孫廣晨, 李宏宇, 陳 江, 王煜曄, 高 聰, 劉小毓, 常旭東, 韓 杰, 王詩雨, 高 飛

1.錦州醫(yī)科大學(xué)北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院研究生培養(yǎng)基地,遼寧 沈陽 110016;2.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 消化內(nèi)科,遼寧 沈陽 110016;3.大連醫(yī)科大學(xué),遼寧 大連 116000;4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué),遼寧 沈陽 110000

在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,動(dòng)物模型和二維細(xì)胞系模型常被應(yīng)用于探索發(fā)育和疾病機(jī)制、評(píng)價(jià)藥物效果及毒性、了解細(xì)胞信號(hào)通路等方面,但這兩種模型均具有局限性。動(dòng)物和人類之間的物種差異決定了動(dòng)物模型可用性有限。而二維細(xì)胞系模型因缺乏結(jié)構(gòu)和維度,無法完全模擬出細(xì)胞與細(xì)胞之間或細(xì)胞與基質(zhì)之間的相互作用,這導(dǎo)致其無法充分揭示組織中細(xì)胞的功能和細(xì)胞間的信號(hào)交流［1］。相比于上述兩種模型,三維培養(yǎng)的類器官不僅能夠高度模擬來源組織的結(jié)構(gòu)和功能,且可在體外增殖過程中始終保持基因組的穩(wěn)定性。因此,類器官技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于建立生物樣本庫,進(jìn)行高通量篩選,研究發(fā)育和疾病機(jī)制,指導(dǎo)臨床個(gè)性化用藥等諸多方面。本文就類器官在生物醫(yī)學(xué)中的研究進(jìn)展及應(yīng)用作一綜述。

1 類器官的發(fā)展歷程

類器官一詞最早于1946年在一項(xiàng)病例報(bào)告中作為畸胎瘤的同義詞出現(xiàn)［2］。受限于當(dāng)時(shí)的技術(shù)水平,類器官的實(shí)現(xiàn)僅有理論可能,直到20世紀(jì)80年代, Bissell和Peterson發(fā)明了三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)［3］,類器官技術(shù)具有了可行性。2009年,Sato等［4］利用小鼠富含亮氨酸的重復(fù)G蛋白偶聯(lián)受體5陽性(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5-positive,LGR5+)干細(xì)胞,在體外培養(yǎng)出無間充質(zhì)微環(huán)境的小腸隱窩-絨毛結(jié)構(gòu),該類器官模型重現(xiàn)了隱窩樣區(qū)域和絨毛樣上皮區(qū)域的三維結(jié)構(gòu)。2011年,Sato等［5］構(gòu)建了人腸道類器官及結(jié)直腸癌類器官,腫瘤類器官被成功建立。

隨著類器官技術(shù)逐漸發(fā)展為獨(dú)立的研究領(lǐng)域。2014年,Lancaster等［6］對(duì)類器官這一概念進(jìn)行了系統(tǒng)、精確的定義,即從干細(xì)胞或器官祖細(xì)胞發(fā)育而來的器官特異性細(xì)胞類型的集合,并能夠以與體內(nèi)相似的方式經(jīng)細(xì)胞分序和空間限制性的系別分化而實(shí)現(xiàn)自我組建。類器官研究不斷深化,多種類器官不斷被成功構(gòu)建,包括但不限于腦、肝、肺、腎、胃、垂體、內(nèi)耳、食管、氣道、胰腺、乳腺、膀胱、卵巢、結(jié)腸、視網(wǎng)膜、甲狀腺、心血管、輸卵管及子宮內(nèi)膜等類器官,其中,不僅包括正常器官組織的類器官,還包括其腫瘤組織的類器官,以及相應(yīng)的類器官芯片體系。2021年,類器官技術(shù)被列為中國(guó)“十四五”重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)。2022年,美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)了基于類器官芯片技術(shù)獲得臨床前數(shù)據(jù)的新藥(NCT04658472),開始進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。

2 類器官的構(gòu)建

培養(yǎng)類器官的干細(xì)胞來源分為多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells,PSCs)和成體干細(xì)胞,其中,PSCs包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)。此外,患者來源的類器官(patient-derived organoids,PDOs)因通常用于腫瘤患者的建模和藥物篩選,也被稱為腫瘤類器官。

獲取培養(yǎng)類器官組織樣本的方式包括手術(shù)切除、穿刺活檢、液體樣本等［7］。初步處理組織樣本后(切除非上皮組織),通過機(jī)械解離和(或)消化解離(如膠原酶、胰酶、DNA酶和解離酶等)使其產(chǎn)生單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán),再將其鋪在3D細(xì)胞外基質(zhì)中,最后添加包含多種生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。常用的基質(zhì)膠有Matrigel、Geltrex和Cultrex等,其為分離自Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)小鼠肉瘤的可溶性基底膜提取物,主要成分包括層粘連蛋白、Ⅳ型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和巢蛋白,基質(zhì)膠的作用是為干細(xì)胞提供具有支架功能的三維環(huán)境,并允許細(xì)胞在支架上聚集、增殖及遷移［8］。

生長(zhǎng)因子的選擇會(huì)因培養(yǎng)的組織類型不同進(jìn)行調(diào)整,如在培養(yǎng)人小腸類器官需加入胃泌素、煙酰胺、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β抑制劑和p38抑制劑［5］。培養(yǎng)腫瘤類器官時(shí),為了減少克隆選擇,避免混淆藥效,往往選用減少生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基［9］。但培養(yǎng)基一般包含以下4類生長(zhǎng)因子:促進(jìn)干細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及分化的Wnt信號(hào)通路激活劑,如Wnt-3a［10］、R-spondins［11］;促進(jìn)干細(xì)胞擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號(hào)通路抑制劑,如Noggin［12］;促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖的酪氨酸受體激酶配體,如表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)［13］;抑制干細(xì)胞凋亡的ROCK抑制劑,如Y-27632［14］。類器官的培養(yǎng)方法多樣,除了通過基質(zhì)膠細(xì)胞支架方法培養(yǎng),Capeling及Neal等［15-16］分別使用懸浮培養(yǎng)法和氣液界面法培養(yǎng)出了腸道類器官。此外,PDOs的培養(yǎng)方法還包括微流控培養(yǎng)法、旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器法等［17］。

3 類器官的應(yīng)用

3.1 發(fā)育模型 既往研究多使用小鼠等動(dòng)物模型分析人類大腦的發(fā)育和功能,但人類大腦與小鼠大腦間存在較大差異,而人腦類器官的發(fā)育過程與人類胎兒腦相似,為研究供新的思路［18］。Fleck等［19］利用人腦類器官繪制出人類大腦發(fā)育圖譜,使用CRISPR-Cas9技術(shù)確定了對(duì)大腦不同區(qū)域的神經(jīng)元發(fā)育具有重大影響的基因開關(guān)。Revah等［20］成功將人皮層類器官移植到大鼠大腦中,以此探究大腦的連接性和功能性。此外,心臟、肺、肝、腎、腸道、骨、輸卵管和子宮內(nèi)膜等諸多類器官也已經(jīng)用于人體發(fā)育、功能、代謝及組織間相互作用的機(jī)制研究中。

3.2 疾病模型 類器官在功能和結(jié)構(gòu)上與人體真實(shí)器官高度相似,因此,能夠用來建立疾病模型,探究疾病的發(fā)生與進(jìn)展機(jī)制,開發(fā)新的治療策略。法布里病是一種由半乳糖苷酶α基因突變引起的X連鎖溶酶體貯積病,由于缺少人體實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?該病的研究和治療受到了限制。Kim等［21］使用hiPSCs衍生的腎類器官和CRISPR-Cas9(成簇的規(guī)律性間隔的短回文重復(fù)序列)基因編輯技術(shù)成功對(duì)法布里病建模,揭示了法布里病與球狀神經(jīng)酰胺(Gb3)和谷胱甘肽之間的關(guān)系。Papes等［22］借助人腦類器官揭示了病理性轉(zhuǎn)錄因子4(transcription factor 4,TCF4)突變?nèi)绾斡绊懭祟惿窠?jīng)組織,即TCF4功能喪失導(dǎo)致Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)減少,SOX基因表達(dá)降低,最終導(dǎo)致體外祖細(xì)胞增殖減少,這意味著利用基因治療工具恢復(fù)該基因功能有望治療皮特-霍普金斯綜合征。類器官已經(jīng)成為許多疾病治療和機(jī)制研究不可或缺的工具,包括先天性心臟病［23］、炎癥性腸病［24］、肝損傷［25］、唐氏綜合征［26］、阿爾茲海默?。?7］、帕金森?。?8］、2型糖尿?。?9］、常染色體隱性多囊腎?。?0］等諸多疾病。值得注意的是,類器官模型還能夠模擬病毒或細(xì)菌感染的過程,在研究幽門螺旋桿菌［31-32］、寨卡病毒［33-36］、諾如病毒［37］、輪狀病毒［38］、嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2［39］、人乳頭瘤病毒［40］等病毒的感染和腸道菌群及其代謝產(chǎn)物［41-43］對(duì)人體的影響中是具有重要價(jià)值的3D模型。

3.3 藥物篩選 與傳統(tǒng)的動(dòng)物模型和2D細(xì)胞模型不同,3D培養(yǎng)的類器官模型能夠準(zhǔn)確地模擬出器官的三維結(jié)構(gòu),在異質(zhì)性和遺傳特征上與原始組織保持高度一致,不僅能實(shí)現(xiàn)單次超過5 000種藥物的篩選,還能夠兼顧個(gè)體對(duì)藥物的敏感程度［44］,其高效性和精準(zhǔn)性在藥物篩選方面顯示出了巨大的潛力,極大地節(jié)省了新藥研發(fā)的時(shí)間和成本。Gupta等［45］通過靶向藥物篩選,確定其能夠維持FANCD2和RAD51的活性,發(fā)現(xiàn)延緩順鉑誘導(dǎo)下腎類器官損傷模型慢性腎病進(jìn)展的藥物SCR7(一種DNA連接酶IV抑制劑)。Herpers等［46］對(duì)結(jié)直腸癌PDOs生物庫和配對(duì)的健康結(jié)腸黏膜樣本進(jìn)行大規(guī)模雙靶點(diǎn)抗體(bispecific antibodies,bAbs)功能篩選,發(fā)現(xiàn)了MCLA-158,這種bAb能夠特異性觸發(fā)LGR5+腫瘤干細(xì)胞中的EGF受體降解,對(duì)健康LGR5+結(jié)腸干細(xì)胞的毒性最小。

類器官還能夠高度復(fù)刻臨床患者的藥物反應(yīng)［47］,用來評(píng)價(jià)藥物的效果和毒性。Zhang等［48］通過肝類器官觀察到與藥物性肝損傷患者臨床表現(xiàn)相關(guān)的泰諾福韋-伊那吉韋相關(guān)肝毒性。疾病和藥物的影響往往涉及多個(gè)器官。Rajan等［49］建立了一個(gè)包括腦、心臟、肺、肝、內(nèi)皮和睪丸6種類器官的集成系統(tǒng),相比于孤立環(huán)境下的單一類器官模型,該系統(tǒng)能夠復(fù)刻器官之間的相互作用,綜合模擬藥物在體內(nèi)的代謝和毒性情況。

3.4 基因工程 能夠穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的類器官為基因編輯提供了平臺(tái),使基于體外3D模型的基因修復(fù)成為可能。此外,類器官技術(shù)聯(lián)合基因編輯技術(shù)還有助于建立既往無法在體外重現(xiàn)的疾病模型［50］,且該模型可以用于藥物的效果評(píng)價(jià)和篩選。囊性纖維化是由于囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)基因突變所致,此疾病曾經(jīng)無法治愈且具有致命性［51］。2013年,Schwank等［52］使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)通過同源重組糾正了囊性纖維化患者來源腸道干細(xì)胞類器官的CFTR基因位點(diǎn)。

3.5 腫瘤 腫瘤患者的腫瘤表型在治療過程中不斷變化,這種異質(zhì)性導(dǎo)致了腫瘤原發(fā)和獲得性的耐藥性,治療失敗及病程的進(jìn)展和惡化,成為針對(duì)廣泛患者人群臨床試驗(yàn)的一大障礙［53-54］。既往人源腫瘤細(xì)胞系移植(cell-derived xenograft,CDX)模型和人源腫瘤組織異種移植(patient-derived xenograft,PDX)模型常用于腫瘤研究,但CDX模型在體外培養(yǎng)過程中不斷適應(yīng)環(huán)境及被環(huán)境所選擇,無法準(zhǔn)確概括腫瘤的異質(zhì)性［55］;PDX模型則面臨著成本高昂、移植率低和倫理等問題［56］。而腫瘤類器官模型能夠在體外穩(wěn)定保存母體腫瘤的遺傳特征、藥理學(xué)特征、形態(tài)特征、組織學(xué)特征及分子特征［57］,作為疾病模型,可以應(yīng)用于開發(fā)藥物、指導(dǎo)個(gè)體化用藥、研究腫瘤的發(fā)生及發(fā)展機(jī)制。

腫瘤類器官可用于尋找生物標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn),并針對(duì)該靶點(diǎn)開發(fā)新型抗腫瘤藥物［58］。Kryeziu等［59］研究發(fā)現(xiàn),在33種在研抗腫瘤藥物中,相比于初始性直腸癌肝轉(zhuǎn)移PDOs,復(fù)發(fā)性直腸癌肝轉(zhuǎn)移PDOs對(duì)第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑模擬物L(fēng)CL161的體外敏感性最強(qiáng),并通過功能分析和基因表達(dá)進(jìn)一步解釋了產(chǎn)生該結(jié)果的可能原因。因此,作為一種可能的實(shí)驗(yàn)性療法,LCL161或可被用于治療肝切除術(shù)后或標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)治療后復(fù)發(fā)的轉(zhuǎn)移性直腸癌。

臨床常用的抗腫瘤藥物包括細(xì)胞毒藥物(如環(huán)磷酰胺、甲氨蝶呤、順鉑等)、靶向藥物(如靶向EGFR、HER2、MET等靶點(diǎn)的藥物)、免疫治療藥物(PD-1抗體、PD-L1抗體)等。實(shí)際應(yīng)用中,往往采取多手段聯(lián)合治療,基于腫瘤類器官的藥物敏感性檢測(cè)可以指導(dǎo)患者選擇個(gè)性化藥物,提高臨床療效,減少不良反應(yīng)。Wang等［60］針對(duì)化療和靶向治療進(jìn)行了基于肺癌類器官的藥物敏感性測(cè)試(lung cancer organoids-based drug sensitivity tests,LCO-DSTs),研究表明,藥物敏感性與臨床反應(yīng)的總體一致性可達(dá)83.33%,提示LCO-DSTs在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)指導(dǎo)用藥中具有巨大潛力。

Buti等［61］通過對(duì)胃類器官的培養(yǎng),揭示了細(xì)胞毒素相關(guān)基因A(cytotoxin-associated gene A,CagA)的致癌機(jī)制,在幽門螺旋桿菌感染期間腫瘤抑制因子ASPP2被CagA破壞細(xì)胞極性,若能干擾CagA-ASPP2的相互作用,則可以防止細(xì)胞極性的喪失,并減少細(xì)菌在體內(nèi)的定植。Yao等［62］從接受了新輔助化療的局部晚期直腸癌患者中建立了一個(gè)活體類器官生物庫,經(jīng)臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí),直腸癌類器官真實(shí)地再現(xiàn)了直腸癌的病理生理學(xué)和遺傳變化。

3.6 再生醫(yī)學(xué) 作為供體器官,類器官不僅安全、穩(wěn)定、可塑,并且獲取方便。值得注意的是,其安全性不僅體現(xiàn)在移植部位精準(zhǔn),且多數(shù)類器官移植手術(shù)以微創(chuàng)形式操作,還體現(xiàn)在來源于自體細(xì)胞的類器官能夠使免疫排斥風(fēng)險(xiǎn)最小化［63］。Watanabe等［64］詳細(xì)描述了如何將腸道類器官移植到葡聚糖硫酸鈉鹽誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中,為腸道類器官移植治療難治性潰瘍性結(jié)腸炎提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。目前,除腸道類器官之外,肝、腎、膽管、胰腺、淚腺、唾液腺等類器官的移植也得到了不同程度的應(yīng)用。

4 總結(jié)

類器官的設(shè)計(jì)在不斷完善［65］,但作為仍在發(fā)展中的前沿技術(shù),類器官仍有一些亟待解決的問題。類器官在應(yīng)用和培養(yǎng)方面需要標(biāo)準(zhǔn)化,例如目前常用的基質(zhì)膠之間往往存在批次間的差異,不同研究團(tuán)隊(duì)的類器官培養(yǎng)方法也不盡相同,進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。此外,應(yīng)當(dāng)制定具有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的類器官培養(yǎng)方案,并保障質(zhì)量、滿足大規(guī)模生產(chǎn)需求［63］。除技術(shù)問題,類器官衍生出的倫理問題也需要重視,如關(guān)于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和使用類器官所需的捐贈(zèng)者授權(quán)和倫理審查類型。因此,確立類器官的道德和法律地位需要進(jìn)行倫理討論和實(shí)證研究,尤其是人腦類器官［66］。

類器官技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)是進(jìn)一步突破單一技術(shù)的局限,與實(shí)時(shí)成像、基因編輯、器官芯片、生物打印、微流體等技術(shù)互相融合。Geyer等［67］利用基于微流體的胰腺導(dǎo)管腺癌類器官系統(tǒng)揭示了缺氧條件對(duì)治療效果的影響。Tran等［68］通過實(shí)時(shí)成像技術(shù)篩選出了247種能夠阻止囊腫形成但不抑制類器官生長(zhǎng)的蛋白酶抑制劑。因此,“類器官+”技術(shù)將為生物醫(yī)學(xué)發(fā)展可能會(huì)遇到的問題給出新的解答方法。

綜上所述,類器官已經(jīng)應(yīng)用于諸多領(lǐng)域,成為精準(zhǔn)醫(yī)療、藥物開發(fā)、發(fā)育和疾病機(jī)制研究、再生醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域不可或缺的基石。