賈 琦，盛楠楠，胡玉奇，劉 祺

(石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832000)

出血性腦卒中在全球的死亡率、致殘率均占據(jù)較高水平，是全世界死亡和殘疾的主要原因，嚴(yán)重威脅著人民的健康水平[1-2]。2017年全球疾病負(fù)擔(dān)(GBD)數(shù)據(jù)顯示，腦卒中是造成我國減壽年數(shù)(YLL)的第一位病因[3]。據(jù)推測，2030 年我國腦血管病事件發(fā)生率將較 2010 年升高約 50%[4]。隨著社會(huì)的發(fā)展和醫(yī)療水平的不斷進(jìn)步，腦出血的預(yù)后有所好轉(zhuǎn)，但仍不理想。腦出血的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其中包括神經(jīng)炎性反應(yīng)、神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡等一系列病理生理反應(yīng)，因此在腦出血后探索神經(jīng)炎性因子的機(jī)制并進(jìn)行適當(dāng)干預(yù)，可有效提高腦出血的預(yù)后。

編碼和非編碼RNA的轉(zhuǎn)錄圖譜已被廣泛用于腦出血，以獲得對復(fù)雜疾病途徑的新見解，識別生物標(biāo)志物以更好地診斷和預(yù)測準(zhǔn)確性[5-6]。因此，對腦出血中這些RNA進(jìn)行更全面的分析可能有助于建立有效的干預(yù)措施，以減輕腦損傷。腦出血后腦損傷的機(jī)制復(fù)雜多樣，主要涉及細(xì)胞毒性、興奮性毒性、氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)等，導(dǎo)致神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞凋亡或壞死以及存活和增殖，最終影響血腦屏障(BBB)的通透性和完整性[7-8]。血腦屏障功能障礙是腦出血后腦損傷的一個(gè)標(biāo)志[9-10]。這種破壞將促進(jìn)腦水腫的形成，通過促進(jìn)白細(xì)胞的涌入?yún)⑴c神經(jīng)炎性反應(yīng)，并允許潛在的神經(jīng)活性物質(zhì)進(jìn)入血腫周圍的大腦，所有這些都可能導(dǎo)致腦損傷。因此，尋找促進(jìn)腦血管完整性的潛在靶點(diǎn)是治療腦出血的方法。

環(huán)狀RNA(CircRNAs)是新近發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼RNA(NcRNAs)，CircRNAs是一組異質(zhì)性的非編碼轉(zhuǎn)錄本，在頭部3'端和尾部5'端之間具有共價(jià)鍵，形成環(huán)狀模式，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中高度保守并大量表達(dá)[11-12]。小腦中CircRim2、CircEl2和CircDym的豐富以及皮質(zhì)中CircPlxnd1的高表達(dá)證明了這一點(diǎn)[13]。雖然它們的生理功能還沒有完全確定，但在發(fā)育中的突觸形成過程中，已經(jīng)在大腦中觀察到了幾種CircRNAs的表達(dá)量變化。而CircRNA087631在出血性腦卒中的表達(dá)及作用尚未有研究，因此，本文旨在研究CircRNA087631在腦出血患者中的表達(dá)并分析預(yù)后及與腦出血之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1納入對象：納入25例石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2020年6月～2021年6月期間住院的腦出血患者，腦出血診斷標(biāo)準(zhǔn)按照1992年版《腦出血的診斷標(biāo)準(zhǔn)》。納入標(biāo)準(zhǔn)： CT影像學(xué)檢查確診腦出血患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患有各類癌癥患者；②除外顱腦外傷、顱內(nèi)占位或感染病變者；③除外腦梗死后繼發(fā)出血者；④有自身免疫性疾病或其他炎性患者；⑤除外近期服用抗凝藥物者。依據(jù)病史、檢查、檢驗(yàn)結(jié)果將診斷為腦出血的患者納入試驗(yàn)組，同期以門診健康體檢者25例作為對照組。本研究通過本院倫理委員會(huì)審批，均已簽署知情同意書。

1.2材料與方法：收集并分析年齡、體重指數(shù)(BMI，kg/m2)、缺乏鍛煉等一般基線資料。測定糖化血紅蛋白、同型半胱氨酸、白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板、紅細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)等指標(biāo)。

1.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR：Trizol法提取肝臟組織中總RNA，調(diào)平后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，條件為：37℃ 2 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min，4℃ 保存。將所得cDNA進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，所用PCR引物序列見表1。擴(kuò)增條件為:95℃ 10 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，循環(huán)次數(shù)40次。使用2-△△Ct計(jì)算公式得出mRNA的表達(dá)量。

表1 PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1一般資料比較： 此研究納入50例研究對象，其中腦出血組25例，正常對照組25例。在腦出血組中，BMI水平明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；并且具有腦卒中家族史的患者人數(shù)明顯多于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表2 組間一般資料比較

2.2組間生化指標(biāo)比較：與正常對照組相比較，腦出血組中的糖化血紅蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；腦出血組的同型半胱氨酸水平高于正常對照組；腦出血組白細(xì)胞計(jì)數(shù)高于正常對照組；腦出血組的血小板計(jì)數(shù)低于對照組；差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 組間生化指標(biāo)之間比較

2.3CircRNA087631在出血性腦卒中的表達(dá)：通過對腦出血患者及健康體檢者的血液提取血液中總RNA后檢測CircRNA的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，試驗(yàn)組均高表達(dá)CircRNA087631，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4CircRNA087631的表達(dá)與臨床指標(biāo)之間的關(guān)系：通過測定CircRNA的表達(dá)與50例患者的臨床指標(biāo)進(jìn)行分層，發(fā)現(xiàn)CircRNA的表達(dá)高低與BMI的升高、存在腦卒中家族史、糖化血紅蛋白的升高、同型半胱氨酸的升高、血小板的升高、發(fā)生腦出血有著密切關(guān)系。見表4。

表4 Circ RNA087631的表達(dá)與臨床指標(biāo)的關(guān)系(n)

2.5CircRNA087631水平與腦卒中患者臨床特征相關(guān)性分析：Spearman 相關(guān)性分析顯示，CircRNA087631水平與腦卒中家族史、同型半胱氨酸、出血量、白細(xì)胞均呈正相關(guān)；與GCS評分呈負(fù)相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表5。

表5 CircRNA087631水平與結(jié)直腸癌腦卒中患者臨床特征相關(guān)性分析

3 討論

在出血性腦卒中，需要預(yù)后性生物標(biāo)志物以了解腦出血的發(fā)展階段，從而可以制定個(gè)體化治療策略，鑒于此必須確定用于該疾病的廉價(jià)且方便的預(yù)后生物標(biāo)志物。既往的研究并未對腦卒中家族史與腦出血的關(guān)系得出明確結(jié)論。應(yīng)激性高血糖不利于神經(jīng)元修復(fù)，進(jìn)一步加重腦損害，腦出血發(fā)生時(shí)，59%的非糖尿病患者在入院時(shí)血糖水平升高，而45%的患者在入院后72 h內(nèi)血糖水平一直保持升高(應(yīng)激性高血糖與腦出血患者預(yù)后的關(guān)系分析)。同型半胱氨酸水平增高是導(dǎo)致腦出血的原因之一[14]。腦出血，血液滲入大腦，小膠質(zhì)細(xì)胞增多并分泌炎性因子，直接干擾血腦屏障功能，加重 ICH 后的炎性反應(yīng)[15]。GCS評分可以對腦出血患者的預(yù)后進(jìn)行早期預(yù)測且評分越低，預(yù)后越差。血小板可作為重要的危險(xiǎn)因素，對卒中后血栓復(fù)發(fā)和出血轉(zhuǎn)歸進(jìn)行評價(jià)。隨著血小板計(jì)數(shù)水平的減少，出血風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行性增加[16]。

本研究揭示了腦出血患者與未發(fā)生腦出血患者中相比CircRNA的差異性表達(dá)及對疾病進(jìn)展的相關(guān)分析。在本文中首次顯示了CircRNA在腦出血中的差異性表達(dá)，并對CircRNA的表達(dá)與腦出血患者的預(yù)后相聯(lián)系。此外本研究表明腦出血后CircRNA表達(dá)水平的變化受到多種動(dòng)態(tài)的調(diào)節(jié)，與體內(nèi)多種生化指標(biāo)變化相協(xié)調(diào)。

腦出血早期的腦活動(dòng)主要以細(xì)胞死亡和局部炎性反應(yīng)為主，同時(shí)伴有血腦屏障破壞并水腫的形成；對于慢性腦出血后炎性反應(yīng)幾乎全部消失，血腦屏障修復(fù)起到了主導(dǎo)作用，包括但不限于神經(jīng)發(fā)生、血管形成和緊密連接組裝。但是長期血腦屏障的修復(fù)會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)退變。因此對于急性或慢性腦出血的治療方案基本是靶向分子治療。血腦屏障的破壞在急慢性腦出血神經(jīng)功能障礙的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。對腦出血患者的基礎(chǔ)研究為其復(fù)雜的病理生理過程提供了方向，特別是揭示了炎性反應(yīng)在推動(dòng)神經(jīng)元死亡和導(dǎo)致出血后屏障破壞的神經(jīng)缺陷中的作用。

研究發(fā)現(xiàn)CircRNA在腦出血呈現(xiàn)出高表達(dá)，提示在腦出血的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的作用。通過收集腦出血患者基本資料及腦出血后生化指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)多種指標(biāo)的變化與CircRNA的變化相一致。Wang等人發(fā)現(xiàn)在235例蛛網(wǎng)膜下腔出血患者的血液中CircAFF1 上調(diào)，闡明了CircAFF1/miR-516b/SAV1/YAP1軸在血管內(nèi)皮功能障礙中的作用及腦出血疾病的潛在早期診斷價(jià)值[17]。本文發(fā)現(xiàn)在腦出血患者中CircRNA-087631呈現(xiàn)出高表達(dá)，且通過對患者基本資料分析發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比較，血中同型半胱氨酸呈現(xiàn)出高表達(dá)，且表達(dá)的高低與CircRNA的表達(dá)相一致。血同型半胱氨酸的表達(dá)高低與H型高血壓相關(guān)，有研究發(fā)現(xiàn)在H型高血壓患者血液中存在高表達(dá)的同型半胱氨酸，而腦出血的高危因素中就存在高血壓，高血壓性腦出血廣泛存在于腦出血的患者中；本文又對患者的基本資料進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)腦出血患者患有高血壓的概率為94%；因此猜想在腦出血的發(fā)病過程中CircRNA的激活表達(dá)紊亂，導(dǎo)致CircRNA087631表達(dá)升高，通過一系列通路的激活使血中同型半胱氨酸的表達(dá)升高引起H型高血壓導(dǎo)致腦出血。因此研究腦出血中CircRNA的表達(dá)對腦出血的治療及探究機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

相關(guān)性分析顯示，CircRNA087631水平與腦卒中家族史、同型半胱氨酸、出血量、白細(xì)胞均呈正相關(guān)；與GCS評分呈負(fù)相關(guān)。Xie等[18]發(fā)現(xiàn)腦外傷后，損傷側(cè)海馬區(qū)CircRNA差異表達(dá)，認(rèn)為CircRNA變化不僅與腦損傷有關(guān)，而且可能與外傷后的神經(jīng)新生存在某些關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)初期腦出血導(dǎo)致血液中的谷氨酸進(jìn)入組織間隙，出血后凝血酶的產(chǎn)生導(dǎo)致Src激酶活化，隨著同型半胱氨酸的升高，增加神經(jīng)元受到興奮性毒性損傷的風(fēng)險(xiǎn)[19]。Cui等[19]發(fā)現(xiàn)腦出血21 d后腦組織中的lncRNA與mRNA呈差異性表達(dá)，認(rèn)為線粒體基質(zhì)、G蛋白耦聯(lián)受體活性降低及嗅覺傳導(dǎo)受損、炎性反應(yīng)可能參與腦出血后功能障礙的形成過程調(diào)節(jié)。

本研究存在一定的局限性，如樣本數(shù)量小，因此本研究結(jié)果可能存在偏差，且部分患者由于死亡，從而缺少遠(yuǎn)期影像學(xué)資料，因此在今后的研究中本課題組將增加樣本量，延長觀察時(shí)間。通過更多的亞組分型，探索出血部位、出血時(shí)間、出血影響因素與腦卒中的關(guān)系，進(jìn)一步納入更多的CircRNA，明確其在出血性卒中中的作用以及是否會(huì)出現(xiàn)出血轉(zhuǎn)歸，是否可將CircRNA序列作為出血性腦卒中(特別是早期患者) 的常規(guī)篩查序列，精準(zhǔn)尋找該疾病的高危因素，對患者進(jìn)行相關(guān)預(yù)后評估。