崔立穎， 唐 君， 程 浩， 嵇 晴

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院 麻醉科，江蘇 南京 210000

奧沙利鉑是第三代鉑類化療藥，被廣泛用于治療結(jié)直腸癌，其抗腫瘤作用較強，但神經(jīng)毒性顯著，長期應(yīng)用該藥誘發(fā)的嚴重神經(jīng)病理性疼痛，發(fā)病率高達60%[1-2]。奧沙利鉑誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛(Oxaliplatin induced neuropathic pain，OINP)主要表現(xiàn)為明顯的機械痛覺過敏、熱痛覺過敏和冷痛覺過敏[3]。目前，對于OINP的治療效果不佳，極大影響患者的生活質(zhì)量。因此，積極探索OINP發(fā)生的分子機制，尋求其治療靶點，仍然是目前的研究重點[4]。近年來，有研究報道，參與神經(jīng)炎癥的神經(jīng)膠質(zhì)細胞是造成慢性疼痛難以治愈的關(guān)鍵因素[5]。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達較豐富的神經(jīng)膠質(zhì)細胞，當(dāng)機體受到傷害性刺激后，星形膠質(zhì)細胞被激活并可以活化為神經(jīng)毒性A1表型星形膠質(zhì)細胞和神經(jīng)保護A2表型星形膠質(zhì)細胞兩種形態(tài)[6]。OINP模型大鼠中星形膠質(zhì)細胞活化，而小膠質(zhì)細胞未見活化，因此，進一步闡明星形膠質(zhì)細胞在OINP中的具體作用對于其治療意義重大[7]。N-myc下游調(diào)節(jié)基因2(N-myc downstream regulated gene 2，NDRG2)是特異性表達于星形膠質(zhì)細胞的一種早期應(yīng)激反應(yīng)基團[8-9]。筆者研究曾發(fā)現(xiàn)，NDRG2與慢性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生機制密切相關(guān)，在脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的慢性疼痛過程中，NDRG2表達顯著增高并調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞的反應(yīng)增生[10]。本研究旨在探討星形膠質(zhì)細胞NDRG2是否參與OINP，并探討其對脊髓星形膠質(zhì)細胞表型分化的影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取清潔級(SPF級)雄性SD大鼠32只，周齡6～7周，體質(zhì)量180～220 g，購于南京卡萊斯生物科技有限公司，飼養(yǎng)于南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院)實驗動物中心。所有的實驗操作方案均通過南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物倫理委員會審核，且符合國際疼痛研究協(xié)會關(guān)于動物實驗倫理的相關(guān)規(guī)定。

1.2 實驗分組 實驗分為兩部分。第一部分：將16只雄性大鼠隨機分為兩組：Vehicle組(n=8)，0～4 d腹腔注射5%葡萄糖溶液；Oxaliplatin組(n=8)，用5%葡萄糖注射液將奧沙利鉑(MCE公司，南京)配置成2 mg/ml的溶液，0～4 d連續(xù)5 d腹腔注射奧沙利鉑溶液，構(gòu)建OINP模型[11]。第二部分：將16只雄性大鼠隨機分為兩組，兩組均采用上述方法構(gòu)建OINP模型，對照腺病毒+OINP組(AD-control+OINP組，n=8)，奧沙利鉑腹腔注射前3 d鞘內(nèi)注射2×108PFU AD-control；Ndrg2干擾腺病毒(AD-Ndrg2-RNAi)+OINP組(AD-Ndrg2-RNAi+OINP組，n=8)，奧沙利鉑腹腔注射前3 d鞘內(nèi)注射2×108PFU AD-Ndrg2-RNAi。鞘內(nèi)注射具體方法：麻醉大鼠后，以L5-6為中點，緊貼脊柱兩側(cè)縱行切開1.5 cm，去除L5-6棘突之間軟組織，充分顯露骨性結(jié)構(gòu)，將PE10導(dǎo)管向頭端置入椎管內(nèi)，置入導(dǎo)管深度為2.0 cm，建立皮下隧道，將導(dǎo)管外端固定于頸部，熱熔封口[12]。利多卡因驗證位置后，注射病毒。

1.3 行為學(xué)測定 第一部分實驗分別在給藥0、7、11、18、25 d測定機械縮足閾值(mechanical withdrawal threshold，MWT)和熱縮足潛伏期(thermal withdrawal latency，TWL)。第二部分實驗分別在給藥0、11 d測定MWT和TWL。MWT具體測定方法：將大鼠置于金屬鐵絲網(wǎng)高架上，適應(yīng)15～30 min后，選用8根von frey纖維絲，將纖維絲垂直刺入大鼠足部中部，持續(xù)8 s，采用Up-down法計算MWT[13]。TWL具體測定方法：將大鼠置于有機玻璃上，輻射大鼠后爪足部中央，記錄開始輻射至出現(xiàn)縮足反應(yīng)的時間為TWL[14]。

1.4 蛋白免疫印跡 取各組大鼠脊髓腰膨大，使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，加入上樣緩沖液煮沸變性，SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%牛奶封閉1 h，一抗NDRG2(abcam，ab174850)、GFAP(CST，3670s)、C3(R&D，AF2655)、S100A10(Proteintech，11250-1-AP)、β-actin(Proteintech，66009-1-Ig)4℃孵育過夜，二抗(購自Proteintech)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光成像。使用Image J對條帶進行半定量分析。

1.5 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) 取各組大鼠脊髓腰膨大，使用TRIzol提取組織RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，配置定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系，并在7500 Real Time PCR儀器進行檢測，以Gapdh作為內(nèi)參對照，用2-ΔΔCT進行相對定量。引物序列如下：Gapdh上游5′-GGATGCTGCCCTTACCC-3′，下游5′-GTTCACACCGACCTTC--ACC-3′；Ndrg2上游5-′GAATTCTA-TGGCAGAGCTTCAGGAGGT-3′，下游5′-GGATCCTCAACAGGAGACTTCCATGGT-3′；C3上游5′-CACAGCGGCACATTTCAT-3′，下游5′-GGGGTCGGTCAAGGTCTA-3′；S1000a10上游5′-GAAAGGGAGTTCCCTGGGTT-3′，下游5′-CCCACTTTTCCATCTCGGCA-3′。

1.6 免疫熒光 分離脊髓腰膨大，4%多聚甲醛溶液固定4 h，再脫水、OCT包埋、冰凍切片機切取25 μm脊髓切片，5%驢血清封閉1 h，一抗(GFAP、NDRG2及C3)4℃孵育過夜，熒光二抗室溫孵育1 h，封片。熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 奧沙利鉑腹腔注射后MWT及TWL的變化 雄性SD大鼠連續(xù)5 d腹腔注射奧沙利鉑，成功構(gòu)建OINP模型。造模前，Vehicle組與Oxaliplatin組的MWT和TWL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。腹腔注射奧沙利鉑7、11、18、25 d，Vehicle組的MWT、TWL均高于Oxaliplatin組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 OINP大鼠MWT、TWL變化情況

2.2 OINP大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞激活及A1、A2表型星形膠質(zhì)細胞分化改變 Oxaliplatin組脊髓星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP蛋白含量、A1表型星形膠質(zhì)細胞標記物C3蛋白含量均高于Vehicle組，而A2表型星形膠質(zhì)細胞標記物S100A10蛋白含量低于Vehicle組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。免疫熒光顯示，與Vehicle組比較，Oxaliplatin組GFAP及C3熒光強度增加。見圖3。

圖2 OINP大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP、A1型星形膠質(zhì)細胞標志物C3和A2型星形膠質(zhì)細胞標志物S100A10的表達改變 圖3 OINP大鼠脊髓背角GFAP及C3熒光表達(比例尺：50 μm)

2.3 大鼠脊髓NDRG2表達改變 Oxaliplatin組脊髓NDRG2蛋白含量顯著高于Vehicle組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。免疫熒光顯示，與Vehicle組比較，Oxaliplatin組NDRG2熒光強度增加。見圖5。

圖4 OINP大鼠脊髓NDRG2的表達改變 圖5 OINP大鼠脊髓背角GFAP及NDRG2熒光表達(比例尺：50 μm)

2.4Ndrg2干擾對脊髓NDRG2蛋白含量及mRNA含量的影響 AD-Ndrg2-RNAi+OINP組NDRG2蛋白含量及Ndrg2相對mRNA含量顯著低于AD-control+OINP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)見圖6。

圖6 Ndrg2干擾后脊髓NDRG2蛋白及mRNA含量表達改變

2.5Ndrg2干擾對OINP大鼠疼痛行為學(xué)的影響 給藥11 d，AD-Ndrg2-RNAi+OINP組的MWT和TWL顯著高于AD-control+OINP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖7。

圖7 脊髓Ndrg2干擾后OINP大鼠MWT和TWL的變化情況

2.6Ndrg2干擾對脊髓A1、A2表型星形膠質(zhì)細胞分化的影響 AD-Ndrg2-RNAi+OINP組A1表型星形膠質(zhì)細胞標志物C3的蛋白含量及mRNA含量低于AD-control+OINP組，而A2表型星形膠質(zhì)細胞標志物S100A10的蛋白含量及mRNA含量顯著高于AD-control+OINP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖8。

圖8 脊髓Ndrg2干擾后OINP大鼠C3和S100A10蛋白及mRNA表達改變

3 討論

奧沙利鉑屬于鉑類化合物，通過與細胞DNA結(jié)合并交聯(lián)發(fā)揮化學(xué)治療作用，目前，臨床上被廣泛用于治療肺癌、乳腺癌、卵巢癌和結(jié)腸癌等。奧沙利鉑對神經(jīng)元有顯著毒性，除了病理性疼痛，還可引起癲癇發(fā)作、腦水腫、中風(fēng)和視覺損傷[15]。奧沙利鉑誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變在停藥后不可逆轉(zhuǎn)，甚至其神經(jīng)損傷可能加重[16]。本研究通過腹腔注射奧沙利鉑溶液構(gòu)建了OINP模型，在不同時間點分別檢測了奧沙利鉑腹腔注射后的機械痛覺敏感性和熱痛覺敏感性，大鼠MWT和TWL出現(xiàn)了顯著而持久的下降，驗證了奧沙利鉑引起了典型的神經(jīng)病理性疼痛。

在外周神經(jīng)損傷后，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞可以分化為神經(jīng)毒性A1表型和神經(jīng)保護性A2表型[17]。神經(jīng)毒性A1型星形膠質(zhì)細胞失去促進神經(jīng)元存活、生長、突觸發(fā)生和吞噬作用的能力，并誘導(dǎo)神經(jīng)元和少突膠質(zhì)細胞死亡。A1星型膠質(zhì)細胞高度存在于人類神經(jīng)退行性疾病中，包括阿爾茲海默病、亨廷頓病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化和多發(fā)性硬化癥等[18-20]。近年來，有研究報道，在慢性手術(shù)后疼痛中，星形膠質(zhì)細胞向A1表型分化，而恢復(fù)A1/A2比例可以緩解皮膚肌肉損傷引起的機械性疼痛[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在OINP模型中，大鼠脊髓星形膠質(zhì)細胞發(fā)生激活，GFAP和C3蛋白表達顯著增加，伴隨S100A10蛋白表達顯著降低，同時，大鼠的疼痛行為學(xué)發(fā)生改變，表明奧沙利鉑腹腔注射誘導(dǎo)脊髓星形膠質(zhì)細胞增生活化，并誘導(dǎo)向A1表型分化，提示神經(jīng)毒性A1表型星形膠質(zhì)細胞參與OINP的發(fā)生發(fā)展過程。

NDRG2廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，并且特異性表達于星形膠質(zhì)細胞內(nèi)，參與調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細胞反應(yīng)性增生，在阿爾茲海默病、缺血再灌注損傷、實驗性自身免疫性腦脊髓炎等多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用[22-24]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，NDRG2在脊神經(jīng)結(jié)扎誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[10]。在本研究中，鞘內(nèi)注射病毒干擾脊髓Ndrg2表達能夠?qū)е滦坌設(shè)INP大鼠的MWT及TWL顯著增加，顯著緩解奧沙利鉑誘導(dǎo)的機械痛和熱痛。同時，本研究還發(fā)現(xiàn)，干擾脊髓Ndrg2，可以顯著抑制A1表型星形膠質(zhì)細胞分化，增加A2表型星形膠質(zhì)細胞表達。這表明，NDRG2參與調(diào)節(jié)了星形膠質(zhì)細胞的極化，提示NDRG2可能通過調(diào)節(jié)反應(yīng)性星形膠質(zhì)細胞的表型分化，從而促進OINP的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，脊髓背角NDRG2促進星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)毒性A1表型分化，從而促進OINP雄性大鼠產(chǎn)生機械痛覺過敏和熱痛覺過敏，為治療OINP提供潛在的干預(yù)靶點。