李有德，陳萬(wàn)杰，任維超，王彩霞，李保華*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)植物醫(yī)學(xué)學(xué)院，山東青島 266109；2.冠縣農(nóng)技推廣服務(wù)中心，山東聊城 252500）

鏈格孢屬（Alternaria）是自然界廣泛存在的一類真菌，以腐生、寄生和內(nèi)寄生方式在各種基質(zhì)上生長(zhǎng)繁殖，在多種作物上都能誘發(fā)病害，如煙草赤星病、甘藍(lán)黑斑病等[1-2]。在蘋(píng)果上，鏈格孢菌能侵染葉片，誘發(fā)蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉?。ˋpple Alternaria leaf spot），侵染果實(shí)能誘發(fā)霉心、黑斑、黑點(diǎn)、紅點(diǎn)等癥狀[3-4]。在發(fā)病嚴(yán)重的果園或年份，由于鏈格孢菌誘發(fā)的黑點(diǎn)和紅點(diǎn)病果達(dá)80%以上，嚴(yán)重影響了果品的質(zhì)量、耐儲(chǔ)性和果農(nóng)的收入[5-6]。侵染蘋(píng)果果實(shí)的鏈格孢菌為弱致病菌，病菌需先在花器和果實(shí)的死組織或表面利用死體營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)擴(kuò)展，形成發(fā)達(dá)的菌絲或菌落后，再在適宜條件下從傷口侵入果實(shí)內(nèi)部，誘發(fā)各種癥狀[7]。

壓低鏈格孢菌在花器和果實(shí)上的定殖量，鏟除已定殖的鏈格孢病菌，能有效降低鏈格孢菌誘發(fā)的各種癥狀[8]。化學(xué)防治是壓低花器和果實(shí)上定殖鏈格孢菌、降低果實(shí)發(fā)病率的有效技術(shù)措施[9]。防治鏈格孢菌所致病害的化學(xué)藥劑，主要在蘋(píng)果開(kāi)花后、果實(shí)套袋前和果實(shí)生長(zhǎng)后期噴施，以壓低花器、果實(shí)表面定殖鏈格孢菌的菌源量。然而，目前用于防治鏈格孢菌所致病害的化學(xué)藥劑都達(dá)不到理想的效果，而且使用不當(dāng)會(huì)影響坐果率[10]。生物源殺菌劑，如多抗霉素，雖對(duì)花器和果實(shí)的傷害小，但防治效果差。因此，本文測(cè)試了苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰羥胺等12種殺菌劑，并測(cè)定其對(duì)鏈格孢菌的毒力、對(duì)果實(shí)表面定殖鏈格孢菌的防治效果以及對(duì)花器的影響，以期為防治鏈格孢菌所致病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

10%苯醚甲環(huán)唑WG、20%氟唑菌酰羥胺SC，先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司；25%吡唑醚菌酯EC，巴斯夫植物保護(hù)（江蘇）有限公司；80%代森錳鋅WP，陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技（中國(guó)）有限公司；22.7%二氰蒽醌SC，江西禾益化工股份有限公司；50%異菌脲SC，蘇州富美實(shí)植物保護(hù)有限公司；40%嘧霉胺SC，拜耳作物科學(xué)有限公司北京分公司；10%多抗霉素WP，日本科研制藥株式會(huì)社；80%克菌丹WG，安道麥馬克西姆有限公司；2%春雷霉素AS，日本北興化學(xué)工業(yè)株式會(huì)社；70%甲基硫菌靈WP，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司；33.5%喹啉銅EC，興農(nóng)藥業(yè)（中國(guó)）有限公司。

1.2 供試菌株

2020年9—10月，自山東省青島市采集富士蘋(píng)果的正常生長(zhǎng)果實(shí)，用自來(lái)水沖洗后，切取果實(shí)表皮，轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中分離獲得3株鏈格孢菌，經(jīng)分生孢子形態(tài)和ITS序列鑒定[1,11-13]，3株菌分別鑒定為交鏈格孢菌（A. alternata）、細(xì)極鏈格孢菌（A. tenuissima）和巴恩斯鏈格孢菌（A.burnsii）。自甘肅天水采集元帥蘋(píng)果斑點(diǎn)落葉病的葉片，從病斑上分離獲得1株鏈格孢菌，鑒定為茄鏈格孢菌（A.solani）。將4株鏈格孢菌在PDA中培養(yǎng)3～5 d后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，測(cè)試殺菌劑對(duì)鏈格孢菌的毒力。將交鏈格孢菌在PDA平板上置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)10 d，每個(gè)平板加入10 mL無(wú)菌水并震蕩，將孢子沖洗下來(lái)成孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度至104個(gè)/mL，加入0.1%的吐溫20，用于接種。孢子懸浮液在30 min內(nèi)用完。

1.3 殺菌劑對(duì)鏈格孢菌的毒力試驗(yàn)

采用菌絲生長(zhǎng)速率法[14-15]測(cè)試除70%甲基硫菌靈WP和33.5%喹啉銅EC外的10種殺菌劑對(duì)4株鏈格孢菌的毒力。將殺菌劑用滅菌蒸餾水配成母液，當(dāng)PDA冷卻至50℃左右時(shí)，加入藥劑母液，混勻后配制成含有5個(gè)質(zhì)量濃度梯度的藥劑PDA平板，以不加藥劑的PDA平板為空白對(duì)照，見(jiàn)表1。每株鏈格孢菌于每個(gè)藥劑濃度處理接種2個(gè)平板，全部試驗(yàn)重復(fù)3次。菌餅接種到平板的中央，密封后置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，3 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。10%苯醚甲環(huán)唑WG等10種殺菌劑對(duì)菌絲生長(zhǎng)抑制率為

表1 12 種供試殺菌劑的毒力測(cè)試劑量和噴施果實(shí)和花器使用劑量

1.4 殺菌劑對(duì)蘋(píng)果果實(shí)表面定殖鏈格孢菌和腐生真菌的鏟除效果試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用殺菌劑處理后切取果實(shí)表皮分離真菌的方法，測(cè)試11種殺菌劑（春雷霉素對(duì)鏈格孢菌的毒力差，且主要用于防控細(xì)菌病害，故沒(méi)有測(cè)試2%春雷霉素AS）對(duì)蘋(píng)果果實(shí)表面定殖鏈格孢菌和腐生真菌的鏟除效果。藥劑按廠家推薦劑量使用（表1），以清水為對(duì)照，共設(shè)12個(gè)處理，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.2 培養(yǎng)基的準(zhǔn)備

2021年冬季分3批次從市場(chǎng)購(gòu)置分別產(chǎn)自煙臺(tái)市、青島市和大連市的富士、王林和金帥品種的套袋蘋(píng)果果實(shí)，將果實(shí)分成分12組，每組3個(gè)。用手持噴霧器將配好的藥劑均勻噴到果實(shí)表面，直到藥液自然流下為止，室內(nèi)自然晾干后轉(zhuǎn)入25℃恒溫箱中放置。3 d后，用直徑5 mm的消毒打孔器從每個(gè)果實(shí)萼部、腰部、梗部各打取4個(gè)組織塊，分別接種于2個(gè)PDA平板中，每種平板共接種3個(gè)部位的6個(gè)組織塊，果皮緊貼培養(yǎng)基。將接種蘋(píng)果組織塊的培養(yǎng)皿用保鮮膜密封后，轉(zhuǎn)入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d后檢查記錄每塊表皮組織塊上分離到真菌的菌落數(shù)和鏈格孢菌的菌落數(shù)。

1.4.3 鏟除效果的測(cè)定

當(dāng)同一個(gè)組織塊所形成的菌落從形態(tài)、顏色和空間位置上無(wú)法區(qū)分為不同的菌落時(shí)，計(jì)為1個(gè)菌落；當(dāng)從形態(tài)和顏色可區(qū)分為不同真菌時(shí)，每種真菌計(jì)為1個(gè)菌落；當(dāng)從空間位置可區(qū)分為2個(gè)完全不同的菌落時(shí)，計(jì)為2個(gè)菌落。依據(jù)菌落形態(tài)和顏色及分生孢子形態(tài)判定每個(gè)菌落是否屬鏈格孢菌[16]；當(dāng)無(wú)法判定是否為鏈格孢菌時(shí)，轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。藥劑對(duì)果實(shí)表面定殖真菌的鏟除率為

1.5 殺菌劑對(duì)花器的影響

通過(guò)先接種后施藥的方法[17-18]，選擇8種果園內(nèi)常用對(duì)鏈格孢菌毒力較高的殺菌劑在離體花叢上測(cè)試對(duì)花器的影響。于西府海棠盛花期剪取盛開(kāi)花朵的枝條，插入自來(lái)水中，用手持噴霧器將鏈格孢菌的分生孢子懸浮液噴霧接種在所有花器上，直到滴水為止。待孢子懸液在室內(nèi)自然條件下晾干后，噴施殺菌劑，每種藥劑處理2個(gè)枝條。殺菌劑使用廠家推薦劑量（表1），以清水為對(duì)照。待花朵上的藥液完全晾干后，從2個(gè)枝條上隨機(jī)摘取20個(gè)完全盛開(kāi)的花朵，置于直徑15 cm的培養(yǎng)皿中。每種藥劑一個(gè)培養(yǎng)皿，密封后轉(zhuǎn)入25℃恒溫箱培養(yǎng)。7 d后觀測(cè)記錄花柱的壞死長(zhǎng)度、花瓣變色狀況和壞死面積，試驗(yàn)重復(fù)3次?；ㄖ鶋乃篱L(zhǎng)度按2級(jí)記錄：1級(jí)為花柱基部有未壞死綠色組織；2級(jí)為花柱整體壞死，基部無(wú)綠色組織?；ò曜兩?壞死面積按3級(jí)記錄：1級(jí)為整朵花所有花瓣變色，壞死面積占總花瓣面積的10%以下；2級(jí)為花瓣變色，壞死面積占花瓣面積的10%～80%；3級(jí)為花瓣變色，壞死面積占花瓣面積的80%以上。藥劑對(duì)花柱壞死抑制效果和花瓣衰敗指數(shù)計(jì)算公式如下：

1.6 數(shù)據(jù)處理

以菌絲生長(zhǎng)抑制率和相應(yīng)的菌絲生長(zhǎng)率（100%-菌絲生長(zhǎng)抑制率）為因變量，以藥劑劑量的對(duì)數(shù)值為自變量，擬合廣義線性模型（GLM）。GLM中的family參數(shù)選擇二項(xiàng)分布（Binomial）。依據(jù)擬合模型，計(jì)算EC50和置信區(qū)間。通過(guò)鄧肯（Duncan）多重比較法計(jì)算差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑對(duì)4株鏈格孢菌的毒力

在25℃下培養(yǎng)3 d后，接種到混有殺菌劑PDA平板上的4株鏈格孢菌的菌絲生長(zhǎng)都受到不同程度的抑制。A.burnsii、A.alternata、A.solani和A.tenuissima在不含殺菌劑的PDA平板上生長(zhǎng)菌落的平均直徑分別為（4.24±0.26）、（4.69±0.19）、（3.58±0.48）和（4.32±0.27）cm，在含有殺菌劑培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)的最小直徑分別為0.00、0.00、0.05和0.00 cm。在所測(cè)試的12種殺菌劑中，70%甲基硫菌靈WP和33.5%喹啉銅EC的數(shù)據(jù)規(guī)律未能擬合毒力曲線。另外10種殺菌劑中，10%苯醚甲環(huán)唑WG對(duì)鏈格孢菌的毒力最強(qiáng)（表2）；其次是20%氟唑菌酰羥胺SC；50%異菌脲SC和40%嘧霉胺SC對(duì)4種鏈格孢屬真菌也有較強(qiáng)的毒力，EC50的均值分別為1.626 mg/L和3.064 mg/L；80%代森錳鋅WP和22.7%二氰蒽醌SC的毒力相當(dāng)，均為28.48 mg/L；2%春雷霉素AS對(duì)鏈格孢菌的毒力較差，EC50的均值分別為87.54 mg/L。A. burnsii、A.alternata、A.solani和A.tenuissima 4種菌對(duì)10種殺菌劑EC50的均值分別為16.18、29.28、21.60和33.79 mg/L，表明4種鏈格孢菌菌株對(duì)殺菌劑的敏感度存在一定差異，其中，對(duì)25%吡唑醚菌酯EC敏感度差異最大，EC50的最高值與最低值相差達(dá)20.04倍，對(duì)其他9種殺菌劑的敏感度差異不大，EC50的最高值與最低值相差均不超過(guò)5.5倍（表2）。

表2 10 種殺菌劑對(duì)4 種鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)的毒力

2.2 殺菌劑對(duì)果實(shí)表面定殖鏈格孢菌和腐生真菌的鏟除效果

11種殺菌劑對(duì)果實(shí)表面定殖鏈格孢菌和腐生真菌有不同的鏟除效果。在清水處理（對(duì)照）的3批蘋(píng)果9個(gè)果實(shí)的108個(gè)組織塊中，共分離獲得118個(gè)真菌菌落，其中鏈格孢菌83個(gè)，每個(gè)培養(yǎng)皿（6個(gè)組織塊）中平均產(chǎn)生6.56個(gè)真菌菌落，其中鏈格孢菌4.61個(gè)，占70.3%。在11種殺菌劑中，20%氟唑菌酰羥胺SC和40%嘧霉胺SC處理果實(shí)表面分離的鏈格孢菌的菌落數(shù)分別為每皿0.56個(gè)和0.78個(gè)，與清水處理果實(shí)產(chǎn)生的菌落數(shù)4.61個(gè)存在顯著差異，表明兩種藥劑對(duì)果實(shí)表面鏈格孢菌具有鏟除效果，其鏟除率分別為87.95%和83.13%。其他9種殺菌劑處理果實(shí)表面產(chǎn)生鏈格孢菌的菌落數(shù)與對(duì)照沒(méi)有顯著差異，表明9種藥劑對(duì)果實(shí)表面已定殖的鏈格孢菌沒(méi)有顯著的鏟除效果。在所測(cè)試的11種殺菌劑中，20%氟唑菌酰羥胺SC和80%克菌丹WG處理果實(shí)表面分離獲得的真菌菌落總數(shù)分別為每皿3.78個(gè)和3.94個(gè)，與清水處理果實(shí)表面產(chǎn)生真菌菌落數(shù)存在顯著差異，表明兩種藥劑對(duì)果實(shí)表面定殖真菌具有鏟除效果，其鏟除率分別為42.37%和39.83%。其他9種藥劑處理果實(shí)表面產(chǎn)生的真菌菌落數(shù)均大于4.83個(gè)，與清水處理果實(shí)對(duì)照產(chǎn)生的菌落數(shù)沒(méi)有顯著差異，鏟除率均低于26.5%，表明9種藥劑對(duì)果實(shí)表面定殖真菌沒(méi)有顯著的鏟除作用（表3）。

表3 11 種殺菌劑對(duì)果實(shí)表面定殖鏈格孢和腐生真菌的鏟除效果

2.3 殺菌劑對(duì)花器的影響

試驗(yàn)所測(cè)的8種殺菌劑對(duì)花器有不同的影響。西府海棠花的花朵接種鏈格孢菌孢子懸浮液后，清水處理花朵的花柱全部壞死，花柱基部見(jiàn)不到綠色的健康組織，花柱的壞死指數(shù)為0.99。在測(cè)試的8種殺菌劑中，除70%甲基硫菌靈WP外，其他7種殺菌劑對(duì)花柱的壞死都有一定的抑制效果，與清水對(duì)照存在顯著差異。其中，25%吡唑醚菌酯EC、20%氟唑菌酰羥胺SC和80%代森錳鋅WP 3種藥劑對(duì)花柱的壞死有較好的抑制效果，分別達(dá)到38.66%、34.45%和31.93%。西府海棠花的花瓣在培養(yǎng)皿中保濕7 d后，逐漸變色并壞死（圖1）。清水處理的花朵保濕7 d后，花瓣的變色和壞死面積一般不超過(guò)整個(gè)花朵花瓣面積的10%，衰敗指數(shù)為0.38；40%嘧霉胺SC和25%吡唑醚菌酯SC處理花朵的變色和壞死面積在70%以上，衰敗指數(shù)為0.86和0.79，與對(duì)照存在顯著差異。22.7%二氰蒽醌SC和80%克菌丹WG處理花瓣衰敗指數(shù)為0.62和0.53，與對(duì)照存在顯著差異，表明4種殺菌劑對(duì)花器有傷害作用（表4）。10%多抗霉素WP、80%代森錳鋅WP、70%甲基硫菌靈WP和20%氟唑菌酰羥胺SC 4種藥劑處理花瓣衰敗指數(shù)與對(duì)照無(wú)顯著差異，表明該4種藥劑對(duì)蘋(píng)果花器的傷害作用不大。

圖1 殺菌劑處理7 d 后西府海棠花器的變化

表4 8 種殺菌劑對(duì)花柱壞死抑制效果及對(duì)花瓣的傷害作用

3 討論

在所測(cè)試的12種殺菌劑中，20%氟唑菌酰羥胺SC對(duì)鏈格孢菌的毒力強(qiáng)，對(duì)定殖于果實(shí)表面的鏈格孢菌和其他真菌鏟除效果好，對(duì)花柱授粉后的壞死有較好的抑制效果，對(duì)花瓣毒害作用小，可以作為花后和果實(shí)采收前防控鏈格孢菌和其他弱致病菌所致病害的首選藥劑。40%嘧霉胺SC對(duì)定殖于果實(shí)上的鏈格孢菌有較強(qiáng)的鏟除效果，但對(duì)定殖于果實(shí)表面其他真菌的鏟除效果較差，且對(duì)花器的傷害作用較大，可考慮在果實(shí)采收前專門(mén)防控由鏈格孢菌所誘發(fā)的各種果實(shí)病害。80%克菌丹WG對(duì)定殖于果實(shí)表面的鏈格孢菌和非鏈格孢菌有較好的鏟除效果，但對(duì)花器有一定的傷害，可考慮用于果實(shí)采收前防控由各種弱致病菌，尤其是非鏈格孢菌誘發(fā)的各種病害。80%代森錳鋅WP和22.7%二氰蒽醌SC兩種藥劑對(duì)定殖于果實(shí)表面的鏈格孢菌和其他真菌有一定的鏟除效果，對(duì)花柱授粉后的壞死也有一定的抑制效果，可用于花期和果實(shí)采收前防控鏈格孢菌和其他弱致病菌誘發(fā)病的病害。10%苯醚甲環(huán)唑WG在室內(nèi)毒力測(cè)定試驗(yàn)中表現(xiàn)出對(duì)鏈格孢菌菌絲生長(zhǎng)有較強(qiáng)的毒力，與已報(bào)道的研究結(jié)果相似[19]，但在對(duì)鏈格孢菌和腐生真菌的鏟除試驗(yàn)中，沒(méi)有表現(xiàn)出其應(yīng)有的防治效果，不宜作為防控鏈格孢菌所致病害的殺菌劑。25%吡唑醚菌酯EC雖對(duì)花柱授粉后的壞死有較強(qiáng)的抑制效果，但對(duì)花器的傷害作用也較大，對(duì)果實(shí)表面定殖弱致病菌的鏟除效果差，不適合防控花期和果實(shí)采收前由各種弱致病菌誘發(fā)的病害。在蘋(píng)果病害防控中，10%多抗霉素WP一直用作防控鏈格孢菌致病害的有效藥劑，但本文試驗(yàn)結(jié)果表明，10%多抗霉素WP對(duì)鏈格孢菌的毒力差，對(duì)果實(shí)表面定殖鏈格孢菌和非鏈格孢真菌的鏟除效果差，對(duì)花柱授粉后的壞死抑制效果也差，難以有效控制花期和果實(shí)采收前由鏈格孢菌和弱致病菌所誘發(fā)的各種病害，這與已有報(bào)道不同[20]。

鏈格孢菌和其他弱致病菌常定殖于花器和果實(shí)的死組織內(nèi)部，如衰敗的花柱和皮孔死組織內(nèi)，并利用死組織提供的營(yíng)養(yǎng)長(zhǎng)期存活。常見(jiàn)的殺菌劑難以滲入寄主的死組織內(nèi)，以鏟除定殖于死組織內(nèi)的鏈格孢菌和其他弱致病菌。因此，噴施到果實(shí)表面的殺菌劑對(duì)各種真菌的鏟除效果最高達(dá)42%左右，難以有效控制弱致病菌的致病。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，20%氟唑菌酰羥胺SC和40%嘧霉胺SC對(duì)鏈格孢菌的鏟除效果可達(dá)80%以上，但實(shí)際可能達(dá)不到這一效果，原因是在病菌的分離過(guò)程種，生長(zhǎng)速度較快的雜菌可能會(huì)掩蓋一部分生長(zhǎng)速度較慢的鏈格孢菌。因此，當(dāng)鏈格孢菌在花器和果實(shí)上定殖后，殺菌劑常難以將其徹底鏟除，藥劑防控也達(dá)不到理想的效果；為了有效防控花期和果實(shí)采收前由鏈格孢菌及其他弱致病菌所致的病害，應(yīng)在病菌定殖前或定殖初期用藥，減少病菌在花器和果面上的定殖量，從而有效控制病菌的定殖與致病[21]。

4 結(jié)論

在所測(cè)試的12種藥劑中，20%氟唑菌酰羥胺SC可作為花后和果實(shí)采收前防控鏈格孢菌和其他弱致病菌所致病害的首選藥劑；其次，可考慮80%代森錳鋅WP等藥劑；40%嘧霉胺SC和80%克菌丹WG只能用于果實(shí)采收前防控鏈格孢菌和其他弱致病菌所致果實(shí)病害；不推薦10%多抗霉素WP作為防控鏈格孢菌所致各種病害的殺菌劑。