丁云錄，楊 明，申巧慧，李馳坤，李曉兵，歐喜燕，冷 炎*

（1.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，長(zhǎng)春 130021；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院博士研究生，長(zhǎng)春 130117 ）

非酒精性單純性脂肪肝（NAFL）是近年肝病領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。絕經(jīng)后女性因雌激素水平下降，發(fā)病率逐年增高，但針對(duì)性的治療藥物，中西醫(yī)目前均為空白。本實(shí)驗(yàn)課題在院內(nèi)制劑養(yǎng)肝解郁顆粒前期實(shí)驗(yàn)和臨床研究基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行養(yǎng)肝解郁顆粒治療絕經(jīng)后非酒精性單純性脂肪肝的藥效學(xué)及相關(guān)機(jī)制研究，為臨床應(yīng)用提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 動(dòng)物購(gòu)入SPF 級(jí)Wistar 大鼠，雌性，220～250 g。動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK-（吉）2018-0007，購(gòu)于長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。藥品養(yǎng)肝解郁顆粒，規(guī)格：每袋11 g，批號(hào)：20191101，由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心提供。水飛薊賓膠囊，規(guī)格：35 mg×30 粒/盒，批號(hào)：050711064，天津天士力圣特制藥有限公司產(chǎn)品。丙硫氧嘧啶片，規(guī)格：50 mg×100 片/瓶，批號(hào)：1719590，有效期至2022.10.18，Lomapham Rudolf Lohmann GmbH KG Gemany。試劑二氧化乙烯基環(huán)己烯（VCD）溶液，規(guī)格：每瓶25 g，批號(hào)：C11609597、芝麻油，規(guī)格：每瓶250 mL，批號(hào)：C11822050、膽固醇，規(guī)格：每瓶25 g，批號(hào)：C11609597，上海麥克林生化科技有限公司。蛋黃粉，規(guī)格：每瓶100 g，批號(hào)：Z06A11X120668，上海源葉生物科技有限公司。AST 測(cè)定試劑盒，規(guī)格：R1：10 mL×10，R2：100 mL×1/盒，批號(hào)：191381、ALT 測(cè)定試劑盒，規(guī)格：R1：10 mL×10，R2：100 mL×1/盒，批號(hào)：202751、TC 測(cè)定試劑盒，規(guī)格：R1：10 mL×10，R2：100 mL×1/盒，批號(hào)：192061、TG 測(cè)定試劑盒，規(guī)格：R1：100 mL×1，R2：10 mL×10/盒，批號(hào)：198021，均為中生北控生物科技股份有限公司。MDA 測(cè)試盒，規(guī)格：每盒50 T，批號(hào)：20201019，南京建成生物工程研究所。SOD 測(cè)試盒，規(guī)格：每盒50 T，批號(hào)：20201019，南京建成生物工程研究所。FFA 測(cè)試盒，規(guī)格：每盒50 T，批號(hào)：20201014，南京建成生物工程研究所。E2 試劑盒，規(guī)格：每盒48 T，批號(hào)：20201028-30267A、FSH 試劑盒，規(guī)格：每盒48 T，批號(hào)：20201028-30274A、LH試劑盒，規(guī)格：每盒48 T，批號(hào)：20201028-30447A，黃石研科生物科技有限公司。儀器酶標(biāo)儀，型號(hào)：BIO680，Japan BIO RAD 公司；全自動(dòng)分析儀，型號(hào)：selectra junior，荷蘭威圖公司；高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)：Biofuge Stratos，德國(guó)賀利氏公司；可調(diào)高速勻漿器，型號(hào)：FSH-2，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，型號(hào)：OHG-914385-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；生物組織脫水機(jī)，型號(hào)：ZT-14V2；石蠟包埋機(jī)，型號(hào)：YB-6LF；攤片機(jī)，型號(hào)：YT-7FB；染色機(jī)，型號(hào)：YR-21，湖北亞光；切片機(jī)，型號(hào)：leica2255；冷臺(tái)，型號(hào)：leicaEG 1150C，德國(guó)徠卡。-80℃冰箱，型號(hào)：ULT1386-3-V41，Thermo Fisher Scientific（Asheville）LLC。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將70 只Wistar 健康雌性大鼠進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，稱(chēng)重，按體質(zhì)量大小編號(hào)，通過(guò)隨機(jī)數(shù)字表，將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（15 只）；絕經(jīng)模型組（55 只）。

建立雌性大鼠絕經(jīng)后動(dòng)物模型（去氧乙烯基環(huán)乙烯腹腔注射法）[1-6]。

絕經(jīng)模型組大鼠給予15 d 腹腔注射質(zhì)量濃度為80 mg/kg 去氧乙烯基環(huán)乙烯（VCD）溶液（以芝麻油為溶媒）2.5 mL/（kg·d），空白組給予腹腔注射15 d同等劑量芝麻油2.5 mL/（kg·d）。15 d 后模型組和空白組隨機(jī)麻醉5 只大鼠，腹主動(dòng)脈取血，4 ℃離心后，檢測(cè)血清雌二醇（E2），卵泡刺激素（FSH），促黃體生成素（LH）。模型制備成功后，可見(jiàn)血清E2水平降低，血清FSH、LH 水平升高。

1.2.3 高脂高糖復(fù)合因素法制備非酒精性單純性脂肪肝模型[7-11]將圍絕經(jīng)期模型成功的大鼠，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，陽(yáng)性對(duì)照組，養(yǎng)肝解郁顆粒高、中、低3 個(gè)劑量組，共6 組，每組10 只。模型組及各給藥組給予高脂高糖飼料飲食，高脂高糖飼料由豬油（10%）、膽固醇（2%）、蛋黃粉（5%）、丙硫氧嘧啶（0.2%）、蔗糖（10%）、基礎(chǔ)飼料（72.8%）組成。持續(xù)造模及灌胃養(yǎng)肝解郁顆粒8 周。對(duì)照組給予正常飲食。大鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中自由攝食，自由飲水，每周稱(chēng)量體質(zhì)量1 次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥體積。

1.2.4 給藥方法 陽(yáng)性對(duì)照藥水飛薊賓膠囊大鼠藥效劑量75 mg/kg；養(yǎng)肝解郁顆粒設(shè)6.0、3.0、1.5 g/kg 給藥劑量，受試藥物用蒸餾水配制成混懸液，每日灌胃給藥1 次，正常對(duì)照組與模型對(duì)照組大鼠灌胃等量的蒸餾水，灌胃體積為10 mL/（kg·d）。試驗(yàn)過(guò)程中大鼠自由攝食飲水，每周稱(chēng)量體質(zhì)量1 次，以調(diào)整給藥劑量。造模同時(shí)給予受試藥物，給藥周期12 周。

1.2.5 檢測(cè)指標(biāo) 養(yǎng)肝解郁顆粒灌胃8 周末，禁食不禁水12 h，烏來(lái)糖麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min，3 000 r/min 離心15 min，分離血清。血清生化指標(biāo)的檢測(cè)，檢測(cè)AST、ALT、TC、TG 水平，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。動(dòng)物處死后，迅速取出肝臟，預(yù)冷的生理鹽水沖洗肝臟，擦干后稱(chēng)取質(zhì)量，計(jì)算肝系數(shù)。肝系數(shù)＝肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100。取距肝大葉邊緣5 mm 處的肝組織置于10%的甲醛溶液中固定，HE染色，供組織病理學(xué)檢查；另剪取一塊肝組織于冰0.9%氯化鈉溶液中漂洗除去血液，濾紙吸干，稱(chēng)取0.5 g，一塊放入玻璃勻漿管，加5 mL 冰0.9%氯化鈉，用勻漿機(jī)10 000～15 000 r/min上下研磨制備10%組織勻漿，用于檢測(cè)肝組織中TC、TG、MDA、SOD、FFA 含量，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

肝細(xì)胞脂肪變性評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)肝細(xì)胞脂肪變性，0級(jí)，0 分；偶見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，Ⅰ級(jí)，1 分；灶狀肝細(xì)胞脂肪變性，占肝細(xì)胞總數(shù)1/3 以內(nèi)，Ⅱ級(jí)，2 分；脂肪變性肝細(xì)胞占1/3 以上，Ⅲ級(jí)，3 分；肝細(xì)胞彌漫脂變，Ⅳ級(jí)，4 分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 試驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用組間t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠肝組織勻漿中TC、TG 含量及肝臟系數(shù)的影響 見(jiàn)表1。

表1 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后NAFL 雌性大鼠肝組織勻漿中TC、TG 含量及肝臟系數(shù)的影響（± s，n =10）

表1 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后NAFL 雌性大鼠肝組織勻漿中TC、TG 含量及肝臟系數(shù)的影響（± s，n =10）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.2 對(duì)大鼠血清ALT、AST 活性及TC、TG 含量的影響 見(jiàn)表2。

表2 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后NAFL 雌性大鼠血清ALT、AST 活性及TC、TG 含量的的影響（± s，n =10）

表2 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后NAFL 雌性大鼠血清ALT、AST 活性及TC、TG 含量的的影響（± s，n =10）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.3 對(duì)大鼠肝組織勻漿中MDA、FFA 含量及SOD 活性的影響 見(jiàn)表3。

表3 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后非酒精性單純性脂肪肝雌性大鼠肝組織勻漿中MDA、FFA 含量及SOD 活性的影響（± s，n =10）

表3 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后非酒精性單純性脂肪肝雌性大鼠肝組織勻漿中MDA、FFA 含量及SOD 活性的影響（± s，n =10）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

2.4 對(duì)肝臟病理組織學(xué)改變的影響 正常對(duì)照組大鼠的肝內(nèi)可見(jiàn)多個(gè)肝小葉，肝索及肝竇排列整齊，匯管區(qū)3 種管道結(jié)構(gòu)清楚可見(jiàn)，無(wú)明顯異常，呈正常肝組織結(jié)構(gòu)。模型組肝細(xì)胞可見(jiàn)明顯的脂肪變性。證明肝損傷的模型復(fù)制是成功的。陽(yáng)性藥物組肝細(xì)胞可見(jiàn)脂肪變性；肝細(xì)胞未見(jiàn)點(diǎn)狀壞死；未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，陽(yáng)性藥物組肝損傷程度減輕，有效緩解肝細(xì)胞脂肪變性。高劑量組肝細(xì)胞脂肪變性程度減輕，未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，高劑量組可以有效減輕肝損傷的程度，與陽(yáng)性藥物組比較，高劑量組效果優(yōu)于陽(yáng)性藥物組。中劑量組肝細(xì)胞以脂肪變性為主，未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，中劑量組可以有效減輕肝細(xì)胞脂肪變性的程度。低劑量組肝細(xì)胞脂肪變性的程度得到有效的減輕，未見(jiàn)肝細(xì)胞壞死，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)；與模型組比較，低劑量組可以有效減輕肝細(xì)胞脂肪變性的程度。見(jiàn)肝臟病理照片1～6 及表4、5。

表4 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后非酒精性單純性脂肪肝雌性大鼠肝臟的病理形態(tài)影響觀察結(jié)果

3 討論

圖1 正常對(duì)照組大鼠肝臟病理照片

圖2 模型對(duì)照組大鼠肝臟病理照片

圖3 陽(yáng)性對(duì)照組大鼠肝臟病理照片

圖4 養(yǎng)肝解郁顆粒高劑量組大鼠肝臟病理照片

圖5 養(yǎng)肝解郁顆粒中劑量組大鼠肝臟病理照片

圖6 養(yǎng)肝解郁顆粒低劑量組大鼠肝臟病理照片

表5 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后非酒精性單純性脂肪肝雌性大鼠肝細(xì)胞脂肪變性評(píng)分統(tǒng)計(jì)（± s）

表5 養(yǎng)肝解郁顆粒對(duì)絕經(jīng)后非酒精性單純性脂肪肝雌性大鼠肝細(xì)胞脂肪變性評(píng)分統(tǒng)計(jì)（± s）

注：與模型對(duì)照組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

非酒精性單純性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver，NAFL）是非酒精性脂肪肝?。∟AFLD）早期階段，也是相對(duì)易控制治療的時(shí)期，在此時(shí)對(duì)疾病進(jìn)行干預(yù)，可以降低繼而發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎和肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)，能有效的減少非酒精性脂肪肝病的發(fā)病率[12-14]。絕經(jīng)后女性因雌激素降低引起機(jī)體脂代謝功能紊亂，導(dǎo)致肥胖及高脂血癥，與非酒精性單純性脂肪肝的發(fā)生密切相關(guān)，非酒精性單純性脂肪肝在我國(guó)成人中發(fā)病率較高，患病率絕經(jīng)后女性高于男性[15-16]。非酒精性單純性脂肪肝發(fā)病初期，TG 在肝細(xì)胞累積成脂滴，形成肝臟脂肪變性，影響脂質(zhì)代謝，主要表現(xiàn)為 TC、TG 異常升高。隨著肝臟 TG 的繼續(xù)累積，過(guò)量的脂肪酸聚集在肝臟引起肝臟損傷，表現(xiàn)為 ALT、AST 的異常升高，肝細(xì)胞脂肪變性，同時(shí)機(jī)體抗氧化能力減弱，即SOD 活性下降，F(xiàn)FA、MDA 含量升高，進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷[17-19]。

養(yǎng)肝解郁顆粒方來(lái)源于丹梔逍遙散加決明子而成，具有疏肝清熱、健脾養(yǎng)血之功效。主治非酒精性脂肪性肝病，中醫(yī)辨證屬肝郁脾虛、內(nèi)有郁熱型。癥見(jiàn)脅肋不舒，煩躁易怒，自汗盜汗、潮熱、頭痛目赤、面赤口干、月經(jīng)不調(diào)等證。在本實(shí)驗(yàn)中，絕經(jīng)期大鼠非酒精性單純性脂肪肝模型建立成功后，模型組大鼠肝細(xì)胞可見(jiàn)明顯的脂肪變性，肝組織勻漿中TC、TG 含量及肝臟系數(shù)均明顯升高，血清AST、ALT 活性及TC、TG 含量均明顯升高，大鼠肝組織勻漿中MDA、FFA 含量顯著升高、SOD 活性顯著降低。在給予養(yǎng)肝解郁顆粒藥物干預(yù)后，均有不同程度的減輕，能減緩非酒精性單純性脂肪肝的進(jìn)展，可作為治療非酒精性單純性脂肪肝的有效中藥制劑。