王艷平,鄭 鵬,田 敏,石雪艷,王靜波
航天中心醫(yī)院血液科,北京 100049
近年來,中國老齡化問題日益突出,隨著各類抗菌藥物、免疫抑制劑、激素及抗腫瘤藥物的廣泛應用,老年患者呼吸道真菌感染的發(fā)病率上升,已成為臨床值得重視的問題,因此,快速檢測出病原菌,為臨床及時提供治療依據(jù)尤為重要。目前,實驗室檢測真菌的方法主要有直接鏡檢法、血清學實驗、培養(yǎng)法、組織病理學檢查等。真菌培養(yǎng)法一直被視為診斷真菌感染的“金標準”,但真菌培養(yǎng)法所需時間長,臨床醫(yī)生不能及時獲取患者真菌感染的依據(jù)。近來又出現(xiàn)了真菌免疫熒光技術,又稱為痰涂片熒光染色法,此方法簡便快速,但在臨床實驗室并未推廣,尤其是在呼吸道真菌感染中的應用甚少[1]。本研究通過對疑似呼吸道真菌感染的老年患者的痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法與真菌培養(yǎng)法檢測結果進行比較,探討痰涂片熒光染色法在老年患者呼吸道真菌感染中的應用價值,為臨床快速、準確地獲得真菌檢測結果提供依據(jù)。
1.1一般資料 選取本院2021年1-12月擬診為肺部真菌感染的479例老年患者為研究對象,其中男298例,女181例;年齡65~103歲,平均(81.5±9.4)歲。
1.2方法
1.2.1痰液標本留取 患者清潔口腔后采集清晨深咳痰于無菌痰盒內(nèi),2 h內(nèi)送檢。
1.2.2痰液標本合格標準 痰液直接鏡檢,要求白細胞計數(shù)在每個低倍視野中≥25個,上皮細胞在每個低倍視野中≤10個,不合格標本重新采集并送檢。
1.2.3痰涂片革蘭染色法 混勻痰液標本,涂片,干燥后火焰固定,采用革蘭染液染色后鏡檢,看到形態(tài)典型的藍黑色孢子、菌絲或假菌絲記錄為陽性。
1.2.4痰涂片熒光染色法 混勻痰液標本,涂片,自然干燥后加一滴熒光染色液(諾立清,免疫顯色試劑),加蓋玻片,輕輕按壓,用濾紙把多余的染色液吸凈,染色時間1~2 min,使用熒光顯微鏡(型號DM500)觀察結果,看到熒光標記的孢子或菌絲即判斷為陽性。
1.2.5真菌培養(yǎng)法 采用常規(guī)方法將混勻的痰液標本接種在沙保羅培養(yǎng)基上,35 ℃培養(yǎng)1周,菌株的初次分離采用科瑪嘉顯色培養(yǎng)基和YST酵母菌鑒定卡進行常規(guī)鑒定,所有菌株采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)儀復核鑒定,結果不一致的菌株采用核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列分析的方法進行菌種鑒定。標準質(zhì)控菌株為念珠菌ATCC8735。
1.3觀察指標 比較痰涂片革蘭染色法、 痰涂片熒光染色法和真菌培養(yǎng)法檢測結果及鏡下形態(tài),并以真菌培養(yǎng)法為參考標準,比較痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法兩種方法的靈敏度、特異度、總符合率、陽性預測值及陰性預測值。靈敏度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%;特異度=真陰性例數(shù)/(假陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%;陰性預測值=真陰性例數(shù)/(假陰性例數(shù)+真陰性例數(shù))×100%;陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%;符合率=(真陰性例數(shù)+真陽性例數(shù))/總例數(shù)×100%。
1.4統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示,組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
2.13種方法的真菌檢測結果比較 痰涂片革蘭染色法、 痰涂片熒光染色法和真菌培養(yǎng)法檢出率分別為13.6%、36.5%和34.2%,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=75.828,P<0.001);痰涂片熒光染色法真菌檢出率略高于真菌培養(yǎng)法,但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.552,P=0.457); 痰涂片熒光染色法真菌檢出率高于痰涂片革蘭染色法,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=67.269,P<0.001)。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率低于真菌培養(yǎng)法,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=56.244,P<0.001)。見表1。
表1 3種方法的真菌檢測結果比較(n=479)
2.2痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法對真菌感染的診斷效能比較 以真菌培養(yǎng)法為金標準,痰涂片熒光染色法、痰涂片革蘭染色法分別與真菌培養(yǎng)法結果比較見表2、3。痰涂片熒光染色法的靈敏度明顯高于痰涂片革蘭染色法,而特異度卻略低于痰涂片革蘭染色法,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);痰涂片熒光染色法的約登指數(shù)、總符合率、陽性預測值和陰性預測值明顯高于痰涂片革蘭染色法,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。
表2 痰涂片熒光染色法與真菌培養(yǎng)法結果比較(n)
表3 痰涂片革蘭染色法與真菌培養(yǎng)法結果比較(n)
表4 痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法診斷效能比較
2.3真菌培養(yǎng)結果 479例患者的痰液標本真菌培養(yǎng)共檢出164株真菌,分別是白色念珠菌107株(65.2%),光滑念珠菌19株(11.6%),熱帶念珠菌15株(9.1%),曲霉菌11株(6.7%),耳念珠菌5株(3.0%),葡萄牙念珠菌3株(1.8%),克柔念珠菌、特納里夫念珠菌、星狀絲孢酵母、毛霉各1株,共4株(2.4%)。
2.4痰涂片革蘭染色法和痰涂片熒光染色法鏡下形態(tài) 痰涂片革蘭染色背景呈紫紅色或粉紅色,菌絲孢子被染成藍黑色,低倍鏡(×10)下背景雜亂,孢子菌絲形態(tài)與痰液標本中脂滴、細胞碎片、植物纖維雜質(zhì)的形態(tài)不好區(qū)分(圖a1),疑似的菌絲孢子形態(tài)需在油鏡下確認,油鏡下可見菌絲孢子形態(tài)(圖a2)。痰涂片熒光染色法中的菌絲孢子在熒光顯微鏡下發(fā)出明亮的藍色熒光,背景黑色,真菌形態(tài)清晰可見(圖b1~b4),低倍鏡(×10)下即可大致確認陰、陽性,特異性非常強(圖b1、b3),高倍鏡(×40)下觀察菌絲孢子形態(tài)(圖b2、b4),根據(jù)孢子和菌絲的形態(tài)、大小和排列等特征可初步判斷真菌種屬,例如念珠菌具有酵母樣孢子和藕節(jié)樣假菌絲(圖b2);曲霉菌有有隔菌絲,約45度角分枝,呈鹿角樣(圖b4)。
注:a1、a2為革蘭染色菌絲孢子;b1~b4為熒光染色菌絲孢子;b1、b2為念珠菌;b3、b4為曲霉菌;a1、b1、b3為低倍鏡(×10),b2、b4為高倍鏡(×40),a2為油鏡(×100)。
老年患者常伴有嚴重的基礎疾病、免疫力低下,長期使用抗菌藥物、激素及免疫抑制劑導致身體免疫功能低下,菌群失調(diào),容易繼發(fā)真菌感染,感染部位以呼吸道占首位?;颊咧灰嬖谝赘幸蛩囟紤M行真菌的反復檢測,如有真菌感染史應定期跟蹤監(jiān)測,以便及時診斷和治療。由于病原學檢查可以為臨床診治提供有力依據(jù),建議將真菌檢測列為常規(guī)項目[2]。本研究中痰液標本真菌檢出率為34.2%(真菌培養(yǎng)法),表明真菌感染率較高,早期快速、準確檢出真菌是治療的關鍵。應用痰涂片革蘭染色法、痰涂片熒光染色法分別對479份痰涂片檢測真菌,并以真菌培養(yǎng)法為標準,對檢測結果進行比較,結果顯示痰涂片熒光染色法真菌檢出率略高于真菌培養(yǎng)法,但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.457)。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率明顯低于真菌培養(yǎng)法和痰涂片熒光染色法,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。以上結果表明痰涂片熒光染色法較痰涂片革蘭染色法的檢出率更高,可以減少漏診,痰涂片熒光染色法檢出率與真菌培養(yǎng)法接近,有利于患者及早診斷和治療。
以往痰涂片革蘭染色法以其操作簡單、觀察方便等優(yōu)點被廣泛應用于實驗室,但其檢出率明顯低于真菌培養(yǎng)法[3],痰涂片革蘭染色法常規(guī)用于痰培養(yǎng)前的鏡檢,一方面,痰涂片保證了痰液標本的質(zhì)量,能提高痰培養(yǎng)的陽性率;另一方面,合格痰液標本的細菌革蘭染色涂片信息可預測培養(yǎng)結果[4],本研究同樣也驗證了上述觀點,痰涂片革蘭染色法檢出率明顯低于真菌培養(yǎng)法,但有助于選定合格的標本。痰涂片革蘭染色法真菌檢出率非常低,筆者總結主要有以下幾方面原因:(1)痰涂片太厚,真菌孢子菌絲混雜在標本內(nèi)部,染色不明顯,無法辨認;(2)實驗室所用染色儀器的影響,導致染色太淺或太深均不利于鏡下觀察;(3)低倍鏡下孢子菌絲的形態(tài)不明顯,易與植物纖維、細胞碎片混淆,油鏡觀察很難做到整片瀏覽;(4)檢測人員鏡下觀察能力不足。
近些年來,痰涂片熒光染色法逐步在國內(nèi)被推廣,因其具有較高的靈敏度和特異度,越來越受到臨床實驗室的青睞。痰涂片熒光染色法所使用的免疫顯色試劑主要功能成分包括β-D-葡聚糖結合蛋白和熒光素,能特異性地結合真菌細胞壁β-D-葡聚糖和幾丁質(zhì)多糖,使真菌細胞壁被雙重標記,在熒光顯微鏡紫外光(波長340~380 nm) 或者藍紫光(波長420~490 nm)特定的激發(fā)光波段下,菌絲或者孢子發(fā)出明亮的藍色熒光,在黑色背景下結構清晰、易于分辨,提高真菌的檢出率,而且實驗過程非常簡單,只需滴加一滴試劑,等待1~2 min即可鏡檢。查閱文獻發(fā)現(xiàn),國內(nèi)學者大多將痰涂片熒光染色法用于淺部真菌的檢測,標本類型主要為皮屑、甲屑、毛發(fā)、皮膚病理組織等,研究結果均顯示痰涂片熒光染色法是一種靈敏度高、快捷、可靠的真菌檢測方法,陽性檢出率高于常規(guī)鏡檢法[5-11]。劉鴻宇等[12]提出,痰涂片熒光染色法與痰涂片革蘭染色法相比,具有更高的靈敏度、特異度和準確度,可減少假陰性發(fā)生,降低對真菌的漏檢率,值得臨床推廣應用。本研究采用3種不同的真菌檢測方法檢測老年患者痰液標本,研究結果與上述文獻一致。痰涂片熒光染色法雖然過程簡便、快捷,具有較高的靈敏度和特異度,但熒光染色后除了真菌外,細支氣管上的彈性纖維、外源性植物纖維、脂肪滴、寄生蟲也可以發(fā)出亮藍色的熒光,需結合形態(tài)區(qū)分[13]。在熒光鏡檢實際工作中,筆者總結出一些需要注意的地方,如痰液標本一定要混勻,挑取黏性或含血絲部位,均勻涂抹在玻片上,切勿蘸取唾液或涂得太厚,以免造成假陰性結果;壓片后一定要用濾紙按壓蓋玻片吸去多余的染色劑,這樣避免痰液標本懸浮流動,可使鏡下觀察更清晰,同時也可避免液體溢出造成污染;染色后盡快讀片,以免試劑干涸熒光淬滅影響觀察;玻片上會有少量纖維雜質(zhì),同樣也會發(fā)出熒光,但沒有典型的橫隔和出芽結構,形態(tài)一般不規(guī)則,大小亮度與真菌有很大差異,一定要注意區(qū)分,避免出現(xiàn)假陽性結果;試劑常溫保存,避免高、低溫環(huán)境及陽光直射影響試劑效果。
痰涂片熒光染色法的特異度和靈敏度均較高,不乏導致定植真菌的檢出,因此可能導致檢出率高于真菌培養(yǎng)法。在臨床工作中,老年住院患者的念珠菌病發(fā)病率較高,這明顯與口腔真菌的高定植率有關,中老年住院患者口腔真菌定植檢出率最高的是白色念珠菌,占95.5%[14]。伍海英[15]在1 020份呼吸道標本中共檢測出真菌271株,主要為白色念珠菌,占檢測出的病原菌總株數(shù)的76.0%,與本院培養(yǎng)法檢出的白色念珠菌的比例65.3%接近。本研究中的研究對象均為65歲以上的老年人,主要癥狀以咳嗽、咳痰為主,基礎疾病較多,大部分長期使用抗菌藥物治療,很容易發(fā)生菌群失調(diào),導致機體免疫功能低下,念珠菌可在局部大量生長繁殖,由酵母相轉(zhuǎn)為菌絲相,毒力增強,導致感染,甚至導致播散性念珠菌病,因此,定植性的真菌檢出也很重要,應根據(jù)臨床病情,結合其他檢測結果綜合診斷。
綜上所述,通過3種真菌檢測方法結果的比較,發(fā)現(xiàn)痰涂片熒光染色法能夠快速、準確地判斷真菌,提高了真菌檢出率,在老年患者呼吸道真菌感染的診斷中具有重要的價值,有利于患者及早診斷和治療,值得實驗室推廣應用。