沈凱 劉彤

原發(fā)性肝癌是來源于肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其中肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌最常見的類型，占85%～90%[1-2]。肝細(xì)胞癌的發(fā)病率和病死率均較高，目前治療肝細(xì)胞癌的手段包括手術(shù)切除、射頻消融、經(jīng)導(dǎo)管化療栓塞、放化療、分子靶向藥物等，但患者的預(yù)后仍不容樂觀，5年生存率為5%～30%[3-4]。因此，探討肝細(xì)胞癌發(fā)病的分子機(jī)制、發(fā)現(xiàn)新的肝細(xì)胞癌標(biāo)志物有助于疾病的早期診治。研究表明，p53凋亡刺激蛋白2（apoptosis-stimulating of p53 protein 2，ASPP2）在多種人類惡性腫瘤的發(fā)病中起重要作用，通過調(diào)控野生型p53的功能可起到促凋亡作用，但目前國內(nèi)關(guān)于ASPP2在肝細(xì)胞癌發(fā)病中的作用仍停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)階段[5-6]，尚缺乏ASPP2與肝細(xì)胞癌發(fā)病關(guān)系的臨床證據(jù)。因此，本研究以接受手術(shù)切除治療的肝細(xì)胞癌患者為對(duì)象，探討肝細(xì)胞癌組織ASPP2表達(dá)及臨床意義。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2016年6月至2019年6月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院接受手術(shù)切除治療的80例肝細(xì)胞癌患者為研究對(duì)象，其中男45例，女35例；年齡35～62（49.85±8.83）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)術(shù)后病理診斷為肝細(xì)胞癌；（2）臨床病例資料和術(shù)后隨訪資料完整；（3）肝細(xì)胞癌組織和癌旁正常組織樣本完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前接受過放化療；（2）既往有其他惡性腫瘤史；（3）合并除乙肝外的其他類型肝炎。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 ASPP2 mRNA表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法。取肝細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織，按照試劑盒說明書進(jìn)行總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA及qRT-PCR檢測(cè)。在qRT-PCR儀上完成PCR反應(yīng)，得到ASPP2和β-actin的循環(huán)曲線及循環(huán)閾值，以β-actin為內(nèi)參，按照公式2-ΔΔCt計(jì)算 ASPP2 mRNA表達(dá)水平。

1.2.2 ASPP2蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組化染色法。取肝細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織制作病理切片，按照試劑盒說明書進(jìn)行ASPP2免疫組化染色，在顯微鏡下觀察并對(duì)陽性染色百分比和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽性染色百分比評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分，1%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%～100%為4分；染色強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陰性為0分，弱陽性為1分，中度陽性為2分，強(qiáng)陽性為3分。計(jì)算陽性染色百分比評(píng)分與染色強(qiáng)度評(píng)分的乘積，總評(píng)分0～5分為ASPP2蛋白低表達(dá)，6～12分為ASPP2蛋白高表達(dá)。

1.2.3 X連鎖凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）、p53蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。取肝細(xì)胞癌組織，使用組織裂解液進(jìn)行裂解，12 000 g、4℃離心10 min后收集上清液，采用BCA法檢測(cè)上清液蛋白濃度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果將含有30 μg蛋白的上清液樣本用于Western blot檢測(cè)。經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂牛奶封閉硝酸纖維素膜1～2 h，用XIAP一抗（1∶1 000稀釋）、p53一抗（1∶1 000稀釋）、β-actin一抗（1∶5 000稀釋）4℃孵育過夜；次日用辣根過氧化物酶二抗（1∶5 000稀釋）孵育硝酸纖維素膜1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)成像得到蛋白條帶，根據(jù)條帶灰度值計(jì)算XIAP、p53蛋白表達(dá)水平。

1.2.4 術(shù)后隨訪 術(shù)后采用門診或住院復(fù)查、電話回訪等方式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間截至2021年3月31日，主要隨訪內(nèi)容為總生存情況和無病生存情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制Kaplan-Meier生存曲線，計(jì)算累積無病生存率和5年總生存率，組間比較采用log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織ASPP2表達(dá)水平比較 肝細(xì)胞癌組織ASPP2主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，見圖1。肝細(xì)胞癌組織ASPP2 mRNA表達(dá)水平、蛋白高表達(dá)率和蛋白表達(dá)評(píng)分均明顯低于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見表1。

表1 肝細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織ASPP2表達(dá)水平比較

圖1 肝細(xì)胞癌組織及癌旁正常組織p53凋亡刺激蛋白2蛋白表達(dá)（A：肝細(xì)胞癌組織；B：癌旁正常組織；免疫組化染色，×100）

2.2 原發(fā)性肝癌組織ASPP2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 原發(fā)性肝癌組織ASPP2蛋白表達(dá)與病理分期、臨床分期、脈管浸潤等有關(guān)（均P＜0.05），與性別、年齡、HBV感染、肝硬化、甲胎蛋白水平、腫瘤數(shù)量、包膜侵犯等均無關(guān)（均P＞0.05），見表2。

表2 肝細(xì)胞癌組織ASPP2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[例（%）]

2.3 肝細(xì)胞癌組織ASPP2蛋白表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 ASPP2蛋白高表達(dá)患者累積無病生存率和累積5年總生存率均明顯高于ASPP2蛋白低表達(dá)患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。

圖2 ASPP2蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者的Kaplan-Meier生存曲線（A：無病生存率；B：5年總生存率）

2.4 肝細(xì)胞癌組織ASPP2蛋白表達(dá)與XIAP、p53蛋白表達(dá)的關(guān)系 ASPP2蛋白高表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織XIAP蛋白表達(dá)水平明顯低于ASPP2蛋白低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織，而p53蛋白表達(dá)水平明顯高于ASPP2蛋白低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖3和表3。

表3 肝細(xì)胞癌組織ASPP2蛋白表達(dá)與XIAP、p53蛋白表達(dá)的關(guān)系

圖3 不同ASPP2蛋白表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織XIAP、p53蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

肝細(xì)胞癌的惡性程度高、臨床預(yù)后差、5年生存率低，目前已知與肝細(xì)胞癌有關(guān)的基因包括p53、乙醛脫氫酶2、醌氧化還原酶1等，但具體發(fā)病機(jī)制至今仍未闡明。甲胎蛋白、α-L-巖藻糖肝酶、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3等是篩查肝細(xì)胞癌常用的標(biāo)志物[7-8]，但診斷疾病的靈敏度均不佳，多數(shù)患者在病情進(jìn)展至中晚期才會(huì)出現(xiàn)血清腫瘤標(biāo)志物異常升高，目前尚缺乏能夠早期診斷肝細(xì)胞癌的標(biāo)志物。因此，探討肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制不僅有助于發(fā)現(xiàn)疾病新的治療靶點(diǎn)，也有助于發(fā)現(xiàn)疾病診斷及病情評(píng)估新的標(biāo)志物。

ASPP家族包括ASPP1、ASPP2、ASPP3，其中ASPP2在消化系統(tǒng)惡性腫瘤發(fā)病中的作用受到廣泛關(guān)注。Yin 等[9]、Liu 等[10]、Buti等[11]分別在結(jié)直腸癌、食管癌、胃癌患者腫瘤組織中檢測(cè)到ASPP2表達(dá)降低。ASPP2具有廣泛的促凋亡作用，能夠顯著增強(qiáng)抑癌基因p53誘導(dǎo)的促凋亡效應(yīng)。膀胱癌[12]、子宮內(nèi)膜癌[13]、腎癌[14]相關(guān)研究證實(shí)，上調(diào)ASPP2表達(dá)能明顯促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，而抑制ASPP2表達(dá)能明顯抑制癌細(xì)胞凋亡。至今，ASPP2在肝細(xì)胞癌發(fā)病中作用的研究仍停留在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。Liang等[15]、Chen等[16]的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除或敲低ASPP2能明顯促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的存活和增殖；Wang等[17]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲低ASPP2可促進(jìn)肝細(xì)胞癌移植瘤的形成。本研究通過qRT-PCR和免疫組化染色對(duì)臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌組織中ASPP2表達(dá)水平明顯低于癌旁正常組織，這表明ASPP2的低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的發(fā)病有關(guān)。

ASPP2是細(xì)胞凋亡的調(diào)控基因，在肝細(xì)胞癌發(fā)病過程中，細(xì)胞凋亡異常與腫瘤病理進(jìn)程密切相關(guān)[18-19]。本研究探討ASPP2蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ASPP2蛋白低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織病理分期及臨床分期更高，且更易發(fā)生脈管浸潤，這表明ASPP2蛋白低表達(dá)與肝細(xì)胞癌的病理進(jìn)展有關(guān)，與其介導(dǎo)的促凋亡效應(yīng)吻合。進(jìn)一步探討ASPP2蛋白表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，肝細(xì)胞癌組織ASPP2蛋白低表達(dá)患者累積無病生存率和累積5年總生存率均較低，這表明ASPP2低表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者預(yù)后不良有關(guān)。

目前關(guān)于ASPP2促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的認(rèn)識(shí)不斷在深入。Yang等[20]研究證實(shí)，ASPP2對(duì)肝細(xì)胞癌細(xì)胞促凋亡基因p53的表達(dá)和抗凋亡基因XIAP表達(dá)具有調(diào)控作用。本研究利用已有的肝細(xì)胞癌組織樣本對(duì)ASPP2下游的p53、XIAP蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示與ASPP2蛋白高表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織比較，ASPP2蛋白低表達(dá)的肝細(xì)胞癌組織XIAP蛋白表達(dá)水平升高，而p53蛋白表達(dá)水平明顯降低，提示肝細(xì)胞癌發(fā)病過程中低表達(dá)的ASPP2可能通過增加XIAP表達(dá)、降低p53表達(dá)的方式來發(fā)揮抑制癌細(xì)胞凋亡的作用。但以上結(jié)果仍需今后更多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。

綜上所述，肝細(xì)胞癌組織ASPP2低表達(dá)與病理進(jìn)展、預(yù)后不良有關(guān)，其作用機(jī)制可能與調(diào)控XIAP、p53有關(guān)。本研究結(jié)果為今后深入認(rèn)識(shí)肝細(xì)胞癌的發(fā)病機(jī)制、發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌新的標(biāo)志物提供了思路。