張濤，牟英玉，亓王盼，張繼友，毛勝勇

（南京農(nóng)業(yè)大學消化道微生物研究室，反芻動物與營養(yǎng)飼料工程中心，動物科技學院，江蘇 南京 210095）

我國是一個優(yōu)質(zhì)牧草資源十分匱乏的國家，奶牛生產(chǎn)中，為提高奶牛產(chǎn)奶量，養(yǎng)殖者常給奶牛飼喂高谷物日糧以提高產(chǎn)奶量。然而，奶牛攝入過多的易發(fā)酵碳水化合物易導致瘤胃微生物發(fā)酵速率加快，產(chǎn)生大量揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA），導致瘤胃內(nèi)環(huán)境酸堿平衡被破壞，引起瘤胃pH急劇下降［1］，繼而誘發(fā)亞急性瘤胃酸中毒（subacute ruminal acidosis，SARA）等瘤胃疾?。?］。研究發(fā)現(xiàn)，SARA可引起瘤胃代謝紊亂，誘發(fā)皺胃移位、瘤胃炎、乳房炎及蹄葉炎等［3-5］，給奶牛養(yǎng)殖造成了巨大的經(jīng)濟損失。生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，盡管通過營養(yǎng)配方調(diào)整、添加瘤胃緩沖劑或微生物制劑可降低SARA的發(fā)生率，但奶牛場中仍然存在一定程度SARA的發(fā)生率，這一現(xiàn)象顯示，SARA的發(fā)生除受日糧結(jié)構(gòu)的影響外，還與其他因素有關(guān)。此外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，即便在相同日糧條件下，奶牛發(fā)生SARA的嚴重程度也不一致［6-8］，造成營養(yǎng)配方調(diào)整方案實施困難，部分易感個體出現(xiàn)嚴重的酸中毒現(xiàn)象。這些結(jié)果說明，奶牛個體間對SARA的易感性存在差異，這種個體差異的存在可能是導致當前營養(yǎng)調(diào)控手段不能完全控制奶牛發(fā)生SARA的根本原因。因此，明確SARA耐受不同奶牛的瘤胃生理特征，有利于篩選SARA耐受性強的奶牛進行飼養(yǎng)，進而降低牛群患SARA的風險，減少蹄葉炎、真胃移位等營養(yǎng)代謝病的發(fā)生，從而推進奶牛分群飼養(yǎng)及健康養(yǎng)殖的發(fā)展。

眾所周知，SARA的發(fā)生主要與瘤胃pH過低有關(guān)，而瘤胃pH主要受瘤胃內(nèi)VFA生成和移除速率的影響［9-10］。因此，瘤胃內(nèi)VFA生成和移除速率差異極有可能是造成SARA耐受性不同的關(guān)鍵因素。在瘤胃中，VFA的移除主要通過瘤胃上皮對VFA吸收來實現(xiàn)，而瘤胃上皮對VFA的吸收主要與瘤胃上皮形態(tài)和功能有關(guān)。然而，目前關(guān)于不同SARA易感奶牛的瘤胃上皮形態(tài)及其與VFA吸收相關(guān)的功能基因表達差異的研究鮮有報道。由此，本研究擬在相同日糧條件下，以瘤胃pH為基準，篩選出對SARA耐受性不同的奶牛，結(jié)合伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）切片及實時定量PCR等技術(shù)手段，比較研究兩組奶牛瘤胃上皮組織形態(tài)及其功能基因表達差異，以揭示奶牛SARA耐受性與其瘤胃上皮形態(tài)與功能基因表達的潛在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計及動物飼養(yǎng)管理

本試驗于2019年2月在江蘇泰州天資牧業(yè)有限公司開展，選用12頭體重相近且裝有永久性瘤胃瘺管的泌乳中期荷斯坦奶牛［2～3胎，泌乳天數(shù)為（114±22）d］，栓系飼喂，自由采食和飲水。試驗期為35 d，前14 d為日糧適應(yīng)期，后21 d為試驗期，奶牛試驗期提供精粗比為4∶6的混合飼糧，飼糧配方及營養(yǎng)水平在張濤等［11］的研究中已詳細描述。分別于每天8：00和19：00飼喂，剩料量控制在飼喂量的5%～10%，并于飼喂前擠奶。

1.2 樣品采集

在試驗期第20和21天晨飼后的0、2、4、6、8、12 h測定瘤胃pH，并于0、4、8、12 h測定瘤胃VFA濃度，隨后基于瘤胃pH變化，將奶牛進行分組。在第21天晨飼前，采集人員佩戴一次性滅菌長臂手套，通過瘤胃瘺管觸及瘤胃腹囊乳頭根部，用手指捏斷瘤胃乳頭根部，迅速放置培養(yǎng)皿中用冰磷酸鹽緩沖溶液（phospate buffered saline，PBS）清洗3次后，挑選完整上皮乳頭置于4%多聚甲醛溶液中，并置于4 °C保存，用于瘤胃上皮乳頭組織形態(tài)學分析；取剩余部分乳頭剪碎，于液氮中保存，用于RNA提取。

1.3 樣品測定

1.3.1 瘤胃上皮組織形態(tài)測定 每頭奶牛選取3個完整的瘤胃上皮乳頭進行脫水、漂洗，并包埋于石蠟中。每個蠟塊不連續(xù)切5塊厚6 μm的組織，進行HE染色，最后封片。在40倍物鏡下對瘤胃上皮的各層厚度進行測量，每張切片選取5個不同區(qū)域，每頭動物共有15個重復。瘤胃上皮各層厚度的測量具體步驟參照Steele等［12］的研究方法。

1.3.2 瘤胃上皮乳頭RNA提取及實時定量PCR分析 瘤胃上皮乳頭RNA提取采用TRIzo（lTakara生物，日本）方法，提取的RNA濃度使用NanoDrop 1000分光光度計（Nyxor Biotech，法國）測定。RNA吸光值在1.8～2.1，說明所提取的RNA純度合格，之后用1.4%的瓊脂糖甲醛凝膠電泳驗證RNA樣品的完整性。RNA經(jīng)檢測合格后，將每個樣品的RNA濃度調(diào)整至500 ng·μL-1，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara生物，日本）合成cDNA。根據(jù)GenBank上牛的核酸序列，應(yīng)用Primer 5.0（Whitehead Institute，美國）軟件進行相應(yīng)的定量引物設(shè)計。引物序列如表1所示，所有引物由上海擎科生物科技有限公司合成。使用ABI 7500定量PCR儀（Thermo，新加坡）對目的基因及內(nèi)參基因進行定量。反應(yīng)程序如下：95 °C 30 s預變性，95 °C 5 s，60 °C（目的基因）34 s，重復40個循環(huán)。使用20 μL反應(yīng)體系，所有樣品設(shè)3個重復，目的基因相對表達量以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參進行校正，數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct方法［13］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel（2019）初步整理數(shù)據(jù)后，采用SPSS 26.0軟件中單因素重復測量模型分析瘤胃pH數(shù)據(jù)，時間點作為重復。瘤胃上皮乳頭組織形態(tài)學及其功能基因表達數(shù)據(jù)使用SPSS軟件中獨立樣本T檢驗分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)測得的瘤胃pH，本試驗將瘤胃pH平均值最高（pH=6.11，n=4）和最低（pH=5.76，n=4）的奶牛分為耐受組（tolerant，TOL）和易感組（susceptible，SUS），具體數(shù)據(jù)詳見Zhang等［14］的研究。

2.1 SARA易感與耐受奶牛瘤胃上皮形態(tài)比較

HE染色切片結(jié)果如圖1所示，測量結(jié)果顯示，與TOL組奶牛比較，SUS組奶牛的瘤胃上皮乳頭的棘突層和基底層厚度（P=0.001）及總厚度（P=0.001）顯著增厚，兩組瘤胃上皮乳頭的角質(zhì)層（P=0.568）、顆粒層（P=0.360）厚度無顯著性差異（表2）。

表2 SUS和TOL組奶牛瘤胃上皮厚度變化Table 2 The changes in rumen epithelial thickness between the SUS（susceptible）and TOL（tolerant）groups（μm）

圖1 瘤胃上皮乳頭光學顯微鏡圖Fig.1 Light micrograph of rumen epithelial papillae

2.2 SARA易感與耐受奶牛瘤胃上皮細胞中與pH調(diào)節(jié)及氫離子轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因表達量比較

為探究瘤胃上皮對VFA的吸收能力與SARA耐受性之間的潛在關(guān)系，本研究對SARA耐受性不同的奶牛瘤胃上皮細胞的VFA吸收相關(guān)基因表達量進行了定量分析。如圖2A所示，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中參與瘤胃pH調(diào)節(jié)的vH+ATPase和Na+/K+ATPase基因及Na+/H+交換蛋白NHE1、NHE2和NHE3表達量顯著高于TOL組（P＜0.01）。如圖2B所示，與TOL組比較，SUS組瘤胃上皮細胞與短鏈脂肪酸轉(zhuǎn)運相關(guān)的蛋白基因PAT1、MCT4和DRA的表達量顯著下降（P＜0.01）。

圖2 瘤胃上皮細胞參與離子交換及VFA吸收相關(guān)基因相對表達量Fig.2 The relative expression levels of ion exchange and VFA absorption-related gene in rumen epithelial cells

2.3 SARA易感與耐受奶牛瘤胃上皮細胞中與VFA轉(zhuǎn)運及代謝相關(guān)的基因表達量比較

瘤胃VFA經(jīng)瘤胃上皮后，部分在瘤胃上皮細胞內(nèi)代謝，為瘤胃上皮細胞提供能量。因此，本研究檢測了瘤胃上皮細胞有關(guān)VFA代謝的相關(guān)基因表達量。結(jié)果如圖3A顯示，SUS組丙?；o酶A羧化酶（Propionyl-CoA carboxylase）和丙酮酸脫氫酶1（PDHA1）的mRNA表達量顯著高于TOL組，而乳酸脫氫酶a（LDH a）的基因表達量顯著降低（P＜0.01）。瘤胃上皮細胞中調(diào)控膽固醇及酮體合成的基因定量結(jié)果顯示（圖3B），與TOL組比較，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中的SREBP1和SREBP2表達量顯著升高（P＜0.05），而HMGCL-2表達量顯著下降（P＜0.01）。

圖3 瘤胃上皮細胞參與VFA代謝相關(guān)基因的相對表達量Fig.3 The relative expression levels of VFA metabolism genes in rumen epithelial cells

2.4 SARA易感與耐受奶牛瘤胃上皮細胞中與增殖和凋亡相關(guān)的基因表達量比較

此前結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組奶牛瘤胃上皮厚度差異顯著，暗示其瘤胃上皮細胞增殖和凋亡進程存在變化。因此，本研究對控制瘤胃上皮細胞增殖和凋亡的基因表達量進行定量，結(jié)果顯示，SUS組CDK2、CDK6和Cyclin D1表達量極顯著高于TOL組（P＜0.01，圖4A），且控制細胞凋亡的Bad（P＜0.05）和Caspase-9（P＜0.01）的表達量顯著升高（圖4B），該結(jié)果表明易感奶牛瘤胃上皮細胞的細胞周期進程更短。

圖4 調(diào)控瘤胃上皮細胞增殖和凋亡的基因相對表達量Fig.4 The relative expression levels of cell proliferation and apoptosis genes in rumen epithelial

2.5 瘤胃發(fā)酵參數(shù)與瘤胃上皮細胞功能基因表達量的關(guān)聯(lián)分析

為探究瘤胃發(fā)酵參數(shù)與瘤胃上皮細胞功能間的內(nèi)在聯(lián)系，本試驗將瘤胃發(fā)酵參數(shù)［14］與參與調(diào)節(jié)瘤胃VFA吸收與代謝的相關(guān)差異基因進行關(guān)聯(lián)分析（基于Superman方法計算）。根據(jù)閾值|r|＞0.6，P＜0.05為篩選標準，以確定瘤胃發(fā)酵參數(shù)與上皮細胞差異表達基因的相關(guān)性。如圖5所示，瘤胃pH與鈉氫離子交換蛋白NHE1和NHE2表達量呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），瘤胃丙酸、丁酸、戊酸及TVFA濃度與NHE1表達量顯著正相關(guān)；PAT1、MCT4和DRA表達量與丙酸濃度顯著負相關(guān)，而與瘤胃pH顯著正相關(guān)。

圖5 瘤胃發(fā)酵參數(shù)與瘤胃上皮功能基因相對表達量的相關(guān)性Fig.5 Correlation between rumen fermentation parameters and relative expression of epithelial functional genes

3 討論

長期飼喂高精料日糧可引起奶牛瘤胃內(nèi)VFA濃度升高，使瘤胃pH長期處于較低水平，進而引發(fā)一系列營養(yǎng)代謝疾病如瘤胃炎等［15-16］。生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)，在飼喂相同高精料日糧條件下，奶牛個體間發(fā)生SARA的嚴重程度不一致［8-17］。本試驗采用相同日糧飼喂，發(fā)現(xiàn)12頭奶牛的平均瘤胃pH出現(xiàn)明顯的差異，部分奶牛的瘤胃平均pH值明顯要低于另一些奶牛，且部分奶牛的瘤胃pH值已達到SARA的標準，該結(jié)果與以往有關(guān)SARA易感性的研究結(jié)果一致［18-19］，表明奶牛個體間SARA耐受程度不同的現(xiàn)象普遍存在。前期研究結(jié)果表明，SUS組奶牛的瘤胃TVFA、丙酸、丁酸及戊酸濃度顯著高于TOL組，并揭示了部分瘤胃微生物與SARA耐受性差異的潛在關(guān)聯(lián)［14］，但瘤胃內(nèi)VFA的積累不僅取決于微生物的發(fā)酵速率，同時與瘤胃上皮對VFA的吸收代謝息息相關(guān)。因此在該研究中，對兩組奶牛瘤胃上皮形態(tài)及其對VFA的吸收代謝進行了深入研究。

瘤胃上皮乳頭棘突層和基底層含有豐富的細胞器，是VFA吸收和代謝的主要場所［20］。本研究中，SUS組奶牛瘤胃上皮棘突層和基底層的厚度明顯要比TOL組奶牛厚，該結(jié)果表明，兩組奶牛瘤胃上皮細胞對VFA的吸收代謝能力可能存在差異。由此，本試驗進而研究了兩組奶牛瘤胃上皮細胞調(diào)控VFA吸收與代謝相關(guān)基因的表達。眾所周知，瘤胃對VFA的吸收機制主要包括被動擴散、陰離子交換及質(zhì)子耦合等，其中脂溶性VFA可直接通過瘤胃壁之間的間隙進入血液，而大部分游離的脂肪酸通過陰離子交換及質(zhì)子耦合途徑吸收［21-22］。DRA與PAT1是主要的VFA-/H+交換載體，而MCT4是VFA-/H+共轉(zhuǎn)運載體，對瘤胃內(nèi)VFA-吸收起關(guān)鍵作用［21-23］。SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中參與揮發(fā)性脂肪酸酸根離子吸收的DRA、PAT1和MCT4的相對表達量明顯較低，表明其對瘤胃內(nèi)游離脂肪酸酸根離子的吸收作用較弱。在瘤胃中，非游離態(tài)的VFA主要通過被動擴散進入瘤胃上皮細胞，并迅速解離成VFA-和H+，H+濃度的升高可引起細胞內(nèi)pH值下降，從而激活細胞膜上的NHE家族基因，將H+運輸至細胞外以維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)［24-25］。SUS組瘤胃上皮細胞中NHE1、NHE2、NHE3和Na+/K+ATPase等基因表達量上調(diào)，表明其有利于胞內(nèi)H+外排，進而導致瘤胃中pH下降。關(guān)聯(lián)分析結(jié)果也證實了這一推測，NHE家族基因表達量與瘤胃pH呈顯著負相關(guān)，而DRA、PAT1和MCT4基因則與瘤胃pH呈顯著正相關(guān)。由此，以上的結(jié)果表明，兩組奶牛的瘤胃上皮細胞對VFA的吸收模式存在差異，主要表現(xiàn)在SARA易感奶牛的瘤胃上皮對瘤胃中游離的脂肪酸酸根離子的吸收減緩，而對瘤胃內(nèi)非游離VFA的吸收增加。

瘤胃內(nèi)VFA被瘤胃上皮細胞吸收后，大部分VFA在瘤胃上皮細胞內(nèi)被代謝，僅少部分直接進入血液，且VFA的代謝速率會影響其吸收速率。本試驗進一步探究了兩組奶牛瘤胃上皮細胞中調(diào)控VFA代謝的相關(guān)基因表達差異。研究表明，瘤胃中75%的丙酸和95%的丁酸經(jīng)瘤胃上皮細胞代謝［26］，其中丁酸主要由瘤胃上皮細胞中的酰基輔酶A合成酶家族加入輔酶A酯生成乙酰輔酶A，最終合成酮體和膽固醇［27-28］。本研究發(fā)現(xiàn)，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中丙酸代謝途徑中的Propionyl-CoA carboxylase和PDHA1基因表達量明顯較高，證明SUS組奶牛瘤胃上皮丙酸代謝更為活躍，且SUS組瘤胃內(nèi)丙酸和丁酸濃度升高亦可促進瘤胃上皮代謝。然而，SUS組的SREBP1和SREBP2表達量卻高于TOL組，說明SUS組中SREBP通路被激活，但激活該通路的主要因子仍不清楚，需進一步研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞中促進細胞增殖（CDK2，CDK6和Cyclin D1）和凋亡（Bad，Caspase-9）的基因表達量明顯較高，結(jié)果說明SUS組奶牛瘤胃上皮細胞周期進程加快，這也可能是導致這些奶牛瘤胃上皮層總厚度增加的原因之一。

4 結(jié)論

綜上所述，本研究表明，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞調(diào)控游離脂肪酸吸收的DRA、PAT1和MCT4基因表達量下調(diào)，而調(diào)節(jié)非游離脂肪酸吸收的NHE家族基因表達量增加，結(jié)果導致奶牛瘤胃內(nèi)游離脂肪酸的累積，瘤胃pH下降，這也是不同奶牛對SARA耐受性存在個體差異的根本原因之一。此外，SUS組奶牛瘤胃上皮細胞參與調(diào)控細胞增殖與凋亡的基因表達量顯著增高，說明SUS組奶牛的瘤胃上皮細胞周期進程加快，導致瘤胃上皮層總厚度增厚。