王洪 汪建平 劉曉東 湯祺

(云南大學(xué)附屬醫(yī)院(云南省第二人民醫(yī)院)泌尿外科，云南 昆明 650021)

前列腺癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，目前發(fā)病機制尚未完全闡明，晚期患者主要通過放化療手段治療，但對癥狀緩解效果有限，患者遠(yuǎn)期生存時間較短且副作用較多，隨著中醫(yī)標(biāo)準(zhǔn)化治療腫瘤的發(fā)展，研究表明中藥單藥有效成分對前列腺癌具有一定治療效果，但作用靶點不同，其可調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程，但關(guān)于其作用機制尚未完全闡明〔1～3〕。細(xì)梗香草又稱滿山香，屬于報春花科珍珠菜屬植物，具有抗腫瘤等作用，其中細(xì)梗香草總皂苷(LC)是細(xì)梗香草的主要活性成分，研究發(fā)現(xiàn)LC可抑制肺癌細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔4〕。但LC對前列腺癌的治療效果及其可能作用機制尚未闡明。微小RNA(miRNA)廣泛存在于人體內(nèi)，常可作用于藥物等治療腫瘤的潛在靶點，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rh2通過調(diào)控miR-4295的表達(dá)從而抑制前列腺癌細(xì)胞生長〔5〕。miR-4500在膀胱癌中呈低表達(dá)并可促進(jìn)膀胱癌形成及發(fā)展〔6〕。但miR-4500表達(dá)在LC抑制前列腺癌增殖中的作用尚未可知?；诖耍狙芯繑M探討LC對miR-4500表達(dá)的調(diào)控作用及前列腺癌DU145細(xì)胞在此過程中增殖及凋亡變化情況。

1 材料與方法

1.1臨床標(biāo)本 收集2018年5月至2019年2月云南省第二人民醫(yī)院泌尿外科39例前列腺癌患者資料，患者均經(jīng)臨床組織病理檢測，收集患者前列腺癌樣本組織和匹配的鄰近組織。人前列腺癌細(xì)胞DU145購自上海弘順生物；細(xì)梗香草購自貴州艾力康中草藥開發(fā)有限公司；Lipofectamine2000購自上海潤成生物；噻唑藍(lán)(MTT)試劑購自上海信帆生物；凋亡試劑盒購自北京博邁斯；Trizol試劑購自北京全式金生物；cDNA合成與qRT-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑購自美國Thermo Fisher。

1.2實驗分組 LC〔7〕：取細(xì)梗香草藥材(50 g)粉碎，使用70%乙醇回流提取，減壓回收溶劑后加入蒸餾水溶解，使用正丁醇萃取后采用大孔樹脂柱、中壓十八烷基硅烷鍵合硅膠填料(ODS)柱色譜、硅膠柱色譜、高效液相色譜等技術(shù)手段提取與純化單體化合物，應(yīng)用波譜數(shù)據(jù)分析細(xì)梗香草提取物，鑒定出LC含量為65.08%，加入1%二甲基亞砜(DMSO)溶液進(jìn)行溶解，制備母液為10 mg/ml的溶液，根據(jù)實驗需要分別稀釋至8、16、32 μg/ml。分別配制8、16、32 μg/ml三種劑量的LC設(shè)為LC-L組、LC-M組、LC-H組，分別加入對應(yīng)標(biāo)號的DU145細(xì)胞培養(yǎng)液中，對照組加入等量的藥物稀釋液。取miR-NC、miR-4500 mimics轉(zhuǎn)染DU145細(xì)胞，設(shè)為miR-NC組、miR-4500組。取anti-miR-NC、anti-miR-4500轉(zhuǎn)染至DU145細(xì)胞，設(shè)為LC+anti-miR-NC組、LC+anti-miR-4500組，并采用32 μg/ml LC處理細(xì)胞24 h。

1.3MTT檢測細(xì)胞增殖 取各組DU145細(xì)胞接種于96孔板(5×103個/孔)，按照試劑盒說明書及應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測各孔光密度值(OD值)。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取各組DU145細(xì)胞加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，按照凋亡檢測試劑盒說明書操作分別檢測各組細(xì)胞凋亡率。

1.5qRT-PCR檢測miR-4500的表達(dá)水平 采用Trizol法提取癌旁組織、前列腺癌組織及各組DU145細(xì)胞中總RNA，總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA(參照cDNA合成試劑盒說明書)，qRT-PCR擴增按照試劑盒說明書操作并應(yīng)用羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀檢測miR-4500相對表達(dá)量。

1.6Western印跡檢測Ki-67、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)蛋白表達(dá)量 提取細(xì)胞總蛋白后檢測蛋白濃度，取適量蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)膜、封閉2 h，分別孵育一抗稀釋液(1∶1 000，美國Santa Cruz)24 h與二抗稀釋液(美國Abcam，1∶2 000)1 h，用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行獨立樣本t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LC對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的影響 LC可明顯抑制細(xì)胞增殖及Ki-67蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見圖1、表1。

2.2LC對前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的影響 LC可明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡及Bax表達(dá)，明顯抑制Bcl-2表達(dá)，且呈劑量依賴性(均P<0.05)，見表1、圖2、圖3。

圖1 Western印跡檢測Ki-67蛋白表達(dá)

表1 LC對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖、凋亡及miR-4500表達(dá)的影響

圖2 LC對前列腺癌DU145細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

2.3LC對前列腺癌DU145細(xì)胞中miR-4500表達(dá)的影響 與對照組比較，LC-L組、LC-M組、LC-H組miR-4500的表達(dá)水平均顯著升高，且各組比較差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表1。

2.4miR-4500在前列腺癌組織中的表達(dá) 前列腺癌組織中miR-4500的表達(dá)水平(0.30±0.03)顯著低于癌旁組織(1.00±0.07；t=57.401，P<0.001)。

2.5miR-4500過表達(dá)對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖和凋亡的影響 轉(zhuǎn)染miR-4500 mimics可抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，還可抑制Ki-67、Bcl-2表達(dá)而促進(jìn)Bax表達(dá)(P<0.05)，見圖4、表2。

1,2:LC+anti-miR-NC組,LC+anti-miR-4500組；圖4同圖4 miR-4500過表達(dá)對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖和凋亡的影響

表2 miR-4500過表達(dá)對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖和凋亡的影響

2.6抑制miR-4500表達(dá)逆轉(zhuǎn)LC(32 μg/ml)對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖和凋亡的作用 轉(zhuǎn)染anti-miR-4500可拮抗LC對細(xì)胞增殖、凋亡及其相關(guān)蛋白表達(dá)(P<0.05)，見圖5、表3。

圖5 抑制miR-4500表達(dá)逆轉(zhuǎn)LC對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖和凋亡

表3 抑制miR-4500表達(dá)逆轉(zhuǎn)了LC對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖和凋亡的作用

3 討 論

前列腺癌惡性程度高，部分患者確診時已處于晚期導(dǎo)致其失去最佳治療時機，接受化療等治療的患者有效率較低且存在一定副作用，因而尋找新型治療藥物對前列腺癌的治療具有重要意義，隨著植物化學(xué)學(xué)科的不斷發(fā)展，中草藥活性成分在抗腫瘤方面的藥用效果已得到廣泛證實，而相關(guān)的抗腫瘤機制尚待進(jìn)一步闡明〔8～10〕。

LC可能通過調(diào)控半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)的表達(dá)從而誘導(dǎo)膽管癌細(xì)胞凋亡〔11〕。LC具有抗腫瘤作用，其作用機制與調(diào)控機體免疫功能及抑制腫瘤血管新生有關(guān)〔12〕。LC可抑制胰腺癌細(xì)胞生長、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡〔13〕。本研究結(jié)果顯示，前列腺癌DU145細(xì)胞經(jīng)LC處理后，細(xì)胞增殖速度明顯受到抑制，且這種抑制作用隨計量增加而增大。Ki-67高表達(dá)預(yù)示細(xì)胞增殖能力增強〔14〕。本研究發(fā)現(xiàn)LC可抑制Ki-67的表達(dá)，提示LC對前列腺癌DU145細(xì)胞增殖的抑制作用可能與Ki-67表達(dá)相關(guān)。Bcl-2/Bax比值降低可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果顯示，LC可通過抑制Ki-67的表達(dá)促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。miR-4500在結(jié)直腸癌中表達(dá)下調(diào)，并通過調(diào)節(jié)高遷移率蛋白(HMG)A2發(fā)揮新型腫瘤抑制作用〔16〕。miR-4500通過靶向胰島素樣生長因子2 mRNA結(jié)合蛋白(IGF2BP)1抑制人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)程〔17〕。熊果酸通過上調(diào)miR-4500表達(dá)及抑制Janus蛋白酪氨酸激酶(JAK)2/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3磷酸化而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡〔18〕。本研究結(jié)果顯示，抑制miR-4500的表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)LC對前列腺癌DU145細(xì)胞的促凋亡作用。

綜上，LC對前列腺癌DU145細(xì)胞的促凋亡與miR-4500上調(diào)相關(guān)，miR-4500未來可能作為新型抗腫瘤靶點輔助臨床腫瘤治療及藥物科研發(fā)。