劉樹義 李凱 蘭凱 張旭東 王鵬 李瑜

(西安醫(yī)學(xué)院 1臨床醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710021；2第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科)

激素性股骨頭缺血壞死(SANFH)是一種致殘率較高的疾病，占非創(chuàng)傷性股骨頭壞死發(fā)病的1/3以上〔1〕。近年來，臨床治療過程中，激素的大量使用導(dǎo)致SANFH發(fā)病率逐年增加，且病變多為雙側(cè)〔2〕。目前對SANFH的治療仍以手術(shù)為主，尚無有效的非手術(shù)治療措施。這一現(xiàn)狀使其發(fā)病機(jī)制的研究十分關(guān)鍵。多年來，學(xué)者們對SANFH的發(fā)病機(jī)制做了大量研究，并取得了許多進(jìn)展，形成了多種學(xué)說，包括脂質(zhì)代謝紊亂、氧自由基損傷、微血管損傷及細(xì)胞凋亡與自噬等〔3〕，但截至目前仍無統(tǒng)一定論。細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞應(yīng)對與適應(yīng)應(yīng)激、損傷等惡劣環(huán)境、穩(wěn)定內(nèi)環(huán)境的自我保護(hù)機(jī)制。作為細(xì)胞程序性死亡的形式之一，它可以將受損的細(xì)胞器吞噬、降解〔4〕。在病理?xiàng)l件下，過度的自噬會促進(jìn)正常組織細(xì)胞死亡。部分體外和在體實(shí)驗(yàn)研究均表明，激素對組織細(xì)胞的應(yīng)激作用，使細(xì)胞的自噬被激活而產(chǎn)生自噬效應(yīng)〔5〕，但在軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞中，所呈現(xiàn)的自噬效應(yīng)卻不盡相同〔6,7〕。本研究通過短期、大劑量使用糖皮質(zhì)激素來構(gòu)建SANFH大鼠模型，并分別應(yīng)用自噬阻斷劑和激活劑，分析各組大鼠骨頭壞死情況及壞死股骨頭組織內(nèi)細(xì)胞自噬的水平，以明確細(xì)胞自噬在SANFH發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 主要試劑及藥物：脂多糖(LPS，貨號：L8880)、3-甲基腺嘌呤(3-MA，貨號：IM0190)、雷帕霉素(貨號：R8140)購自北京索萊寶科技有限公司；注射用甲潑尼龍琥珀酸鈉(40 mg/瓶)購自輝瑞制藥有限公司；自噬效應(yīng)蛋白(Beclin)1抗體(貨號：A7353)購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；微管相關(guān)蛋白/輕鏈3(LC3)Ⅱ/Ⅰ抗體(貨號：2775)、SQSTM1/p62抗體(貨號：5114)購自Cell Signaling Technology,Inc.；β-actin抗體(貨號：20536-1-AP)、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG(貨號：SA00001-2)購自武漢Proteintech公司；乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復(fù)液(貨號：G1206、G1202、G1203)購自武漢谷歌生物科技有限公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(貨號：K5007)購自安捷倫(DAKO)科技公司；ClarityTM Western電化學(xué)發(fā)光(ECL)Substrate(貨號：170-5060)購自Bio-Rad Laboratories,lnc.。主要儀器：脫水機(jī)(JJ-12J)、包埋機(jī)(JB-P5)購自武漢俊杰電子有限公司；ChemiDocTM XRS + Imaging System(1708265)、電泳槽(043BR70002)購自Bio-Rad Laboratories,lnc.；正置熒光顯微鏡(DM2000)購自Leica MICROSYSTEMS。

1.2SANFH大鼠模型的建立 自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心〔動物合格證：SCXK(陜)2018-001〕購買24只SD雄性大鼠(250～300 g)，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白(C)組、模型(T1)組、模型+3-MA(T2)組及模型+RAP(T3)組，每組6只。T1、T2及T3組腹腔注射LPS(20 μg/kg)2次，每次間隔24 h；24 h后兩側(cè)臀肌交替注射甲潑尼龍(40 mg/kg)3次，每次間隔24 h〔8〕。T2、T3組每次肌肉注射甲潑尼龍前30 min，經(jīng)腹腔分別注射3-MA(2.5 mg/kg)、雷帕霉素(1 mg/kg)。C組腹腔及臀肌注射生理鹽水。藥物注射結(jié)束繼續(xù)飼養(yǎng)8 w后，將大鼠處死并取出雙側(cè)股骨頭標(biāo)本，測量壞死股骨頭面積后，取少部分放入普通固定液中固定，剩余股骨頭放入-80℃保存。

1.3股骨頭壞死表面積測量 股骨頭壞死表面積測量方法參考趙鳳朝等〔9〕使用的坐標(biāo)紙粘貼法。具體操作方法為：將壞死股骨頭切成層厚為0.5 cm薄片，置于坐標(biāo)紙上并描記其范圍，采用Leica圖像分析儀計算實(shí)際面積。

1.4免疫組織化學(xué)檢測 將股骨頭置于中性甲醛溶液固定72 h后，轉(zhuǎn)移至30%甲酸溶液中繼續(xù)脫鈣72 h。脫鈣完成后，使用梯度二甲苯、酒精進(jìn)行脫水、透明，石蠟包埋后將組織塊制成4 μm薄厚切片。組織切片置于盛滿檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH6.0)的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)，取出切片待自然冷卻并進(jìn)行數(shù)次洗滌后將切片放入3%過氧化氫溶液中室溫孵育，25 min后使用3%牛血清白蛋白(BSA)進(jìn)行封閉。室溫封閉30 min后，去除封閉液并加入LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1及p62抗體溶液(1∶1 000)，將切片置于濕盒內(nèi)4℃孵育過夜。切片經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織，室溫孵育50 min。PBS再次洗滌切片后，加入新鮮配制的DAB顯色劑，在顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。顯色終止后，使用Harris蘇木素復(fù)染細(xì)胞核。流水沖洗后將切片置于梯度酒精和二甲苯溶液中進(jìn)行脫水透明，自然晾干后使用中性樹膠封片，并在顯微鏡下采集、分析圖像。

1.5Western印跡檢測 將股骨頭組織稱重后置于研缽中，加入適量液氮，快速將股骨頭研磨為粉末狀后轉(zhuǎn)移至EP管中，按每20 mg組織加入250 ml RIPA裂解緩沖液(碧云天，P0013C)在冰上裂解，離心后提取上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度。加入蛋白上樣緩沖液后進(jìn)行蛋白熱變性。配置15%分離膠進(jìn)行蛋白樣品凝膠電泳，然后濕轉(zhuǎn)至0.22 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜。裁剪目的蛋白條帶后使用5%脫脂奶粉室溫下封閉1 h，然后加入β-actin(1∶1 000)、LC3Ⅱ/Ⅰ (1∶1 000)、p62(1∶500)及Beclin1(1∶1 000)抗體溶液，4℃孵育過夜。PBST洗膜3次×5 min后加入二抗(HRP標(biāo)記)溶液，室溫孵育1 h。PBST洗滌后，用新配制的ECL化學(xué)發(fā)光液浸濕蛋白條帶并使用ChemiDocTM XRS + Imaging System進(jìn)行成像。應(yīng)用Image-Pro Plus 軟件分析蛋白條帶灰度值，評估目的蛋白的表達(dá)水平。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1股骨頭壞死表面積測量 4組SD大鼠中，除C組股骨頭無壞死外，T1、T2、T3均有不同程度的壞死，壞死率分別為83.33%、16.67%、100%，T3組股骨頭壞死最為顯著。T3組左右兩側(cè)的股骨頭壞死面積明顯大于T1和T2組(P<0.05)，且與T2組相比，T1組壞死面積更為顯著(P<0.05)。見圖1、表1。

圖1 4組股骨頭壞死情況

表1 4組股骨頭壞死表面積比較

2.2免疫組織化學(xué)檢測LC3Ⅱ/Ⅰ、p62及Beclin1蛋白表達(dá) LC3Ⅱ/Ⅰ與Beclin1蛋白在T1、T2、T3組壞死股骨頭組織中的表達(dá)量均多于C組。T3組上述蛋白表達(dá)多于T2、T1組，而T2組中上述蛋白的表達(dá)則低于T1組。p62蛋白在T3中表達(dá)量最少，T2組和C組表達(dá)量較高，且高于T1組。見圖2。

圖2 4組股骨頭組織免疫組織化學(xué)檢測(×100)

2.3Western印跡檢測LC3 Ⅱ/Ⅰ、p62及Beclin 1蛋白表達(dá)情況 LC3 Ⅱ/Ⅰ與Beclin 1蛋白在T1、T2、T3組壞死股骨頭組織中的表達(dá)均明顯多于C組(P<0.5)；T3組上述蛋白表達(dá)明顯多于T2、T1組，而T2組上述蛋白表達(dá)則明顯低于T1組(P<0.05)。4組p62蛋白表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 4組股骨頭組織蛋白檢測

表2 4組股骨頭組織中LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白、Beclin1蛋白及 P62蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

激素類藥物是一類臨床應(yīng)用廣泛且治療效果顯著的藥物，但長期使用后的不良反應(yīng)也較為嚴(yán)重。SANFH就是大量使用激素后誘發(fā)的一種致殘率高且難治的疾病。長期以來，學(xué)者對SANFH的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行了大量研究，并闡述了其可能存在的發(fā)病機(jī)制。近年來，隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，自噬被揭示在腫瘤、動脈粥樣硬化等疾病發(fā)病中扮演了重要角色〔10,11〕。自噬作為真核細(xì)胞程序性死亡的形式(Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡)之一，能夠幫助機(jī)體清除無用的、破損的細(xì)胞器、有害大分子物質(zhì)和病原微生物等〔12,13〕。然而，在一些致病因素的作用下，機(jī)體的自噬現(xiàn)象會顯著增強(qiáng)，進(jìn)而誘導(dǎo)組織細(xì)胞出現(xiàn)病理性死亡。研究發(fā)現(xiàn)，饑餓、缺氧、激素等均是誘發(fā)組織細(xì)胞產(chǎn)生自噬現(xiàn)象的常見因素〔14〕。Jia等〔5〕研究認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素既能誘導(dǎo)骨細(xì)胞發(fā)生凋亡，又可誘導(dǎo)骨細(xì)胞發(fā)生自噬，且骨細(xì)胞由激素的劑量來決定。然而，Lai等〔7〕在牙周炎動物模型中發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀能夠通過增強(qiáng)自噬而呈現(xiàn)出成骨細(xì)胞保護(hù)效應(yīng)。部分關(guān)于激素誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬與骨量及骨質(zhì)疏松關(guān)系的研究也存在著爭論〔15,16〕。可見自噬與骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的關(guān)系仍未明確，還需進(jìn)一步探索。

本研究結(jié)果證實(shí)，短期、大劑量使用激素能夠誘發(fā)股骨頭壞死，同時也提示SANFH的發(fā)生很可能與體內(nèi)細(xì)胞自噬水平的高低密切相關(guān)。Gao等〔17〕在體外實(shí)驗(yàn)研究中也發(fā)現(xiàn)地塞米松通過抑制蛋白激酶B(Akt)-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)C1信號通路而促進(jìn)細(xì)胞自噬，并損傷骨細(xì)胞。研究表明，LC3在一定程度上能夠體現(xiàn)細(xì)胞自噬體的數(shù)量，是自噬的標(biāo)志性分子，而LC3 Ⅱ/Ⅰ則是評價細(xì)胞自噬水平可靠的指標(biāo)〔18〕。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了自噬參與了SANFH的發(fā)病。Beclin1是最早被發(fā)現(xiàn)的自噬調(diào)控基因，其在各組股骨頭組織中的表達(dá)趨勢與LC3一致，提示激素誘發(fā)股骨頭壞可能是通過Ⅲ型磷脂酰肌醇-3激酶(Class Ⅲ PI3K)/Beclin 1通路，調(diào)控自噬體的形成，進(jìn)而促進(jìn)骨組織細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。研究認(rèn)為，p62蛋白通過結(jié)構(gòu)域能夠同時與LC3、泛素化蛋白相結(jié)合，介導(dǎo)泛素化蛋白的自噬性降解，具有指示自噬底物降解程度和自噬活性的價值〔19〕。本研究中p62蛋白的變化與自噬的啟動、抑制及促進(jìn)有關(guān)，提示抑制自噬在一定程度上能減少股骨頭壞死發(fā)生的概率。

綜上，SANFH作為激素藥物的不良反應(yīng)之一，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜。短期、大劑量使用激素，能夠通過促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生過度自噬性死亡，進(jìn)而使得股骨頭出現(xiàn)局部骨量丟失、骨質(zhì)疏松及塌陷。但本研究未就自噬導(dǎo)致SANFH的具體機(jī)制進(jìn)行探究，以后研究應(yīng)在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探索。