袁秉琛，王燕茹，孫郁婷，李承臻，虞道耿

1.海南大學(xué)熱帶作物學(xué)院，海南海口 570228；2.海南大學(xué)林學(xué)院，海南?？?570228；3.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所，海南?？?571101

假木豆屬（DendrolobiumDesv.）是一種多年生灌木或者小喬木，全屬共14種，分布于亞洲熱帶地區(qū)，我國(guó)共有4種，產(chǎn)地分布于廣東、海南、廣西、貴州、云南、臺(tái)灣等省（區(qū)）[1]。研究表明假木豆的植物營(yíng)養(yǎng)干物質(zhì)為39.18%，粗蛋白含量為17.22%~26.79%[2]，纖維含量適中，有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種非常具有潛力的飼用資源[3]。除了作優(yōu)良飼料以外，假木豆中可以提取生物堿[4]、偶氮化合物[5]、黃酮等[6]，具有良好細(xì)胞損傷保護(hù)性、消炎、滅菌等藥用價(jià)值[7]。此外假木豆有著豐富的根瘤菌資源還可以用作退化生態(tài)系統(tǒng)修復(fù)等作用[8]。

植物遺傳多樣性分析在遺傳資源保護(hù)、生物資源開(kāi)發(fā)與可持續(xù)利用、探究物種進(jìn)化史和未來(lái)演化等方面有著重要意義[9]。遺傳多樣性主要通過(guò)遺傳標(biāo)記來(lái)反映，而形態(tài)學(xué)標(biāo)記是遺傳標(biāo)記廣泛使用的主要標(biāo)記方法之一[10]，其通過(guò)直接觀測(cè)植物的性狀來(lái)進(jìn)行分類鑒定，有著方便快捷、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)[11]。目前僅有山螞蝗亞族之間的遺傳多樣性研究[12]，假木豆屬的形態(tài)學(xué)遺傳多樣性的分析研究比較匱乏，缺少大范圍的種質(zhì)形態(tài)學(xué)遺傳多樣性研究。為了探究假木豆屬的種質(zhì)資源分類，本研究對(duì)76份假木豆屬種質(zhì)資源的35個(gè)表型性狀進(jìn)行觀測(cè)，分析假木豆屬的遺傳多樣性特點(diǎn)，為今后的假木豆選育工作提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的76份假木豆屬種質(zhì)（包括假木豆和單節(jié)莢假木豆）來(lái)源于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草中心，供試材料基本信息詳見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)材料基本信息Tab.1 Basic information of test materials

續(xù)表1 試驗(yàn)材料基本信息Tab.1 Basic information of test materials (continued)

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)地基本情況 在中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院品種資源研究所試驗(yàn)基地（109°57′E, 19°53′N，海拔121.87 m）進(jìn)行，試驗(yàn)地為熱帶季風(fēng)氣候，陽(yáng)光與降水充沛[13]。土壤為磚紅土，pH為4.6左右，肥力較低。

1.2.2 表型性狀調(diào)查與指標(biāo) 2020年3月15日進(jìn)行播種育苗，5月11日將苗移栽至大田，試驗(yàn)地采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每份假木豆材料種植2行，12株，株距為0.5 m，行距1 m，植株生長(zhǎng)成熟后隨機(jī)抽取5株進(jìn)行觀測(cè)，植物學(xué)性狀的觀測(cè)主要根據(jù)《熱帶牧草種質(zhì)資源質(zhì)量控制規(guī)范》[14]測(cè)量并對(duì)質(zhì)量性狀進(jìn)行賦值，共35個(gè)植物學(xué)性狀指標(biāo)（表2），其中，中央小葉長(zhǎng)、中央小葉寬、莢果長(zhǎng)、莢果寬為數(shù)量指標(biāo)，其余為質(zhì)量指標(biāo)。

表2 假木豆屬種質(zhì)植物學(xué)性狀及其賦值Tab.2 Batanical characters and their assignment of Desmodium Desv.

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 相關(guān)指標(biāo)計(jì)算 將假木豆各指標(biāo)觀測(cè)的原始數(shù)據(jù)輸入 Excel軟件進(jìn)行匯總，通過(guò)統(tǒng)計(jì)分析得到各表型性狀的分布頻率、最小值、最大值、極差、平均值、標(biāo)準(zhǔn)差及變異系數(shù)。遺傳多樣性指數(shù)由公式H′=∑Pi×lnPi計(jì)算，其中Pi是指性狀的第i級(jí)所含材料份數(shù)占總材料份數(shù)的百分比，ln為自然對(duì)數(shù)。使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 26.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析[15]。

1.3.2 聚類分析 將76份假木豆的35個(gè)植物學(xué)性狀指標(biāo)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，通過(guò)各指標(biāo)間歐式距離進(jìn)行聚類，分析各物種間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 假木豆種質(zhì)植物學(xué)性狀的變異與規(guī)律

由表3可知，觀測(cè)的35個(gè)假木豆屬資源質(zhì)量性狀指標(biāo)中，莖的顏色，莢果顏色遺傳多樣性指數(shù)均大于 1，其中莖的顏色遺傳多樣性指數(shù)是所有性狀中最高的，為1.71；而生活型、葉的類型、中央小葉脈序、葉緣、葉腹面毛被類型、托葉、托葉形狀、托葉質(zhì)地、花序類型、花序著生部位、花萼形狀、莢果毛況類型、裂莢性共13個(gè)性狀的遺傳多樣性指數(shù)均為0。

表3 假木豆屬種質(zhì)資源質(zhì)量性狀頻率Tab.3 Frequency distribution of quality traits of Dendrolobium Desv.

在假木豆莖的顏色性狀分布頻率中，最高是紅褐色分布頻率為39%，最小是綠色、褐色、深褐色3種顏色分布頻率均為3%；莢果的性狀分布頻率中，最高是紅褐色和深褐色，分布頻率均為33%，最低是棕色，分布頻率為5%。

2.2 假木豆屬種質(zhì)資源植物學(xué)性狀變異性分析

對(duì)76份假木豆屬材料的35個(gè)植物學(xué)性狀調(diào)查表明（表4），供試材料的植物學(xué)性狀變異系數(shù)最大的是葉柄毛況（68.93%），其次是葉背面毛況（46.92%）和莖的顏色（39.77%）；生活型、莖毛類型、葉的類型、中央小葉脈序、葉緣、葉腹面毛被類型、托葉、托葉類型、托葉質(zhì)地、花序類型、花序著生部位、雄蕊類型、雌蕊類型、莢果毛況類型、裂莢性等植物學(xué)性狀無(wú)變異情況，說(shuō)明假木豆這部分性狀保持穩(wěn)定，而其余部分性狀遺傳多樣性較為豐富。在所測(cè)指標(biāo)中，莖的相關(guān)指標(biāo)有5個(gè)，變異系數(shù)的平均值為26.97%；葉相關(guān)的指標(biāo)有17個(gè)，變異系數(shù)的平均值為 16.67%；花的相關(guān)指標(biāo)有5個(gè)，變異系數(shù)平均值為8.09%；莢果的相關(guān)指標(biāo)有 7個(gè)變異系數(shù)平均值為 18.62%。通過(guò) LSD多重比較莖、葉、花、莢果的變異系數(shù)平均值（表5），結(jié)果顯示莖、葉與花的之間存在顯著差異，說(shuō)明假木豆遺傳多樣性來(lái)源分布并不均勻。在所觀測(cè)指標(biāo)中葉的背面毛況、莖的顏色、葉柄毛況、葉尖、莖的毛況這5個(gè)性狀變異系數(shù)較大，說(shuō)明這些指標(biāo)在假木豆的遺傳多樣性中起著關(guān)鍵作用。

表4 試驗(yàn)材料各性狀變異情況Tab.4 Variation of various characters of test materials

表5 假木豆屬莖、葉、花、莢果的LSD多重比較Tab.5 LSD multiple comparison of stems, leaves, flowers and pods of Desmodium Desv.

2.3 假木豆屬種質(zhì)資源植物學(xué)性狀的相關(guān)性分析

對(duì)假木豆標(biāo)準(zhǔn)差不為 0的植物學(xué)性狀進(jìn)行相關(guān)性分析（表6），結(jié)果顯示有多組性狀之間存在顯著相關(guān)，表明假木豆各性狀之間存在關(guān)聯(lián)性。莖的形狀與旗瓣形狀、旗瓣顏色、莢果形狀、莢果毛況、葉長(zhǎng)度、葉寬度存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為-0.276、0.307、-0.258、-0.276、-0.459、-0.491，說(shuō)明假木豆屬莖與葉、花、莢果等部分存在關(guān)聯(lián)，可以通過(guò)莖的形狀預(yù)測(cè)假木豆葉、花、莢果相關(guān)的指標(biāo)。中央小葉葉形與葉背面毛況、葉長(zhǎng)度、葉寬度、旗瓣形狀、旗瓣顏色、莢果形狀、莢果長(zhǎng)、莢果寬呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.522、0.375、0.507、0.635、-0.586、0.634、0.360、-0.585，與葉柄毛況呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.251，說(shuō)明同一植物葉的各項(xiàng)指標(biāo)相關(guān)性較高，并且可以根據(jù)葉的形態(tài)預(yù)測(cè)假木豆旗瓣和莢果相關(guān)指標(biāo)。葉背面毛況與葉柄毛況、莢果毛況呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為 0.462、0.589，說(shuō)明同一植物不同組織結(jié)構(gòu)毛被狀況有著較高的相似度。旗瓣顏色與旗瓣形狀、莢果形狀呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.894、-0.945，說(shuō)明假木豆屬資源不同種之間旗瓣與莢果存在明顯差異。葉長(zhǎng)度與葉寬度呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.887，說(shuō)明葉寬隨著葉長(zhǎng)增大。莢果長(zhǎng)度與莢果寬度呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.542，說(shuō)明假木豆莢果寬度隨著莢果長(zhǎng)度的增大而縮小。

2.4 假木豆屬種質(zhì)植物學(xué)性狀的系統(tǒng)聚類分析

對(duì)假木豆20個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差不為0的性狀指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析，得到其聚類圖（圖1）。

圖1 假木豆屬植物學(xué)性狀聚類分析Fig.1 Cluster analysis of Desmodium Desv.based on morphological data

由聚類結(jié)果的歐式距離進(jìn)行遺傳距離判斷，并分析這些假木豆種質(zhì)資源的親緣關(guān)系。結(jié)果表明，供試材料的遺傳距離范圍為 0.666~11.378，說(shuō)明 76份假木豆材料種質(zhì)資源具有較為豐富的遺傳多樣性。在遺傳距離方面，假木豆49和單節(jié)假木豆71之間的歐式距離為11.378，是所有假木豆材料中最大的，說(shuō)明二者親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)；假木豆61和假木豆62之間的歐式距離為0.666，是所有假木豆材料中最小的，說(shuō)明二者親緣關(guān)系比較近。

根據(jù)聚類圖，當(dāng)歐氏距離為 14時(shí)，可以將76份假木豆材料聚成 5大類，第一大類共有 60份假木豆材料，分別為61、62、32、35、73、14、17、75、76、45、69、74、68、70、65、66、57、60、58、59、52、53、5、31、67、7、36、12、30、38、18、19、13、6、24、26、34、29、20、22、15、16、9、21、25、11、4、23、3、10、47、8、51、46、54、63、33、48、1、2；第二大類共有5份假木豆材料，分別為49、55、50、37、56；第三大類共1份假木豆材料（56）；第四大類共有10份單節(jié)假木豆材料，分別為71、72、43、44、39、28、42、41、40、27；為第五大類共有 1份假木豆材料（64）。根據(jù)以上的聚類結(jié)果，可以完全將假木豆和單節(jié)假木豆區(qū)分開(kāi)，單節(jié)假木豆聚在一起，說(shuō)明這些材料關(guān)系比較近，而假木豆材料有4個(gè)分類，說(shuō)明假木豆的種內(nèi)變異波動(dòng)較大。

3 討論

當(dāng)前國(guó)內(nèi)牧草產(chǎn)業(yè)發(fā)展?jié)摿薮螅戏綗釁^(qū)主要豆科牧草品種單一，不利于畜牧業(yè)健康發(fā)展，迫切需要培育牧草新品種，假木豆是優(yōu)質(zhì)豆科牧草材料之一，進(jìn)行遺傳多樣性分析，有助于新品種的選育[16-18]。植物學(xué)性狀是物種的本身遺傳物質(zhì)的外在表現(xiàn)，在牧草的遺傳多樣性分析方面有著廣泛應(yīng)用。通過(guò)多種植物學(xué)性狀評(píng)價(jià)牧草的品質(zhì)是一種有效可行的方式[19]。研究表明，木本植物有著較高的蛋白質(zhì)含量和多種微量元素，但本身又具有莖葉被毛、有尖葉及質(zhì)地硬等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，導(dǎo)致家畜的采食量降低[2,20]。有研究表明，牧草生長(zhǎng)時(shí)間會(huì)影響牧草的品質(zhì)，同時(shí)牧草產(chǎn)量和植株高度、莖葉的相關(guān)指標(biāo)密切相關(guān)[21]；因此，在選擇育種材料時(shí)應(yīng)選擇株高較高、葉形大作為目標(biāo)材料，讓候選材料具有高產(chǎn)特征；同時(shí)也要注意葉尖無(wú)或小、質(zhì)地較軟、莖葉毛況較少或者無(wú)的材料，使材料具有適口性好的特征。

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本研究的76份假木豆植物學(xué)性狀中，植物學(xué)特性變異系數(shù)最大的是葉柄毛況（68.93%），其次是葉背面毛況（46.92%）和莖的顏色（39.77%），說(shuō)明這幾個(gè)性狀在假木豆遺傳過(guò)程中變異情況較大，是區(qū)分材料的重要指標(biāo)。而變異系數(shù)小于20%的有葉基（13.49%）、旗瓣形狀（10.04%）、葉色（5.4%）、葉背面毛類型（2.81%）共4種性狀，其他植物學(xué)性狀中葉柄毛況的變異系數(shù)最高，為68.96%，與劉苗苗等[22]關(guān)于山螞蝗屬的分析結(jié)果相似，說(shuō)明山螞蝗亞族之間變異性具有一些相似性。假木豆的植物學(xué)性狀之間有多個(gè)存在相關(guān)性，葉長(zhǎng)與葉寬之間呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.887，長(zhǎng)寬比約 2.0，葉形比較接近橢圓形。莖的形狀與葉長(zhǎng)度、葉寬度存在相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為-0.459、-0.491，這表明如果假木豆產(chǎn)量以葉面積為主，應(yīng)盡量選擇圓柱形的莖。中央小葉葉形與莢果長(zhǎng)度呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.360，所以選育時(shí)選擇倒卵圓形的葉，可以提高種子產(chǎn)量。葉背面毛況與葉柄毛況、莢果毛況呈極顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分布為 0.462、0.589，說(shuō)明同一植株毛被狀況具有較高的關(guān)聯(lián)性，可進(jìn)行篩選整株毛被較少的資源。通過(guò)聚類分析與系統(tǒng)評(píng)價(jià)為篩選合適的假木豆種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)，結(jié)果顯示第一類中 070314022假木豆、GX121121004假木豆、050218087假木豆、050307492假木豆具有葉形大、葉尖小、莖葉毛況少或無(wú)等共同特點(diǎn)，是假木豆育種工作下一步的重點(diǎn)關(guān)注對(duì)象。

近年來(lái)，分子標(biāo)記技術(shù)在遺傳多樣性研究中廣泛應(yīng)用，有著顯著的技術(shù)優(yōu)勢(shì)[23-26]，但是受到種群和基因型數(shù)量的限制，在當(dāng)前無(wú)法取代測(cè)量簡(jiǎn)單的植物學(xué)性狀分析。本研究或可為接下來(lái)的分子標(biāo)記工作提供基礎(chǔ)，縮小材料選擇范圍，為育種工作提供一定的參考。