張建海，王向平，馮彬彬*，潘聲旺

1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404120；2.三峽庫(kù)區(qū)道地藥材開(kāi)發(fā)利用重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120；3.河南省洛陽(yáng)市洛龍區(qū)農(nóng)林技術(shù)推廣站，河南洛陽(yáng) 471023；4.成都大學(xué)，四川成都 610106

佛手為我國(guó)傳統(tǒng)的藥食兩用藥材，是我國(guó)常見(jiàn)的熱帶、亞熱帶植物，同時(shí)也可作為園林植物，具有疏肝理氣，和胃止痛，燥濕化痰，一般用于肝胃氣滯，胸脅脹痛，胃脘痞滿，食少嘔吐，咳嗽痰多[1-2]。佛手來(lái)源于蕓香科植物佛手（Citrus medica‘Fingered’）的干燥果實(shí)[1-2]。佛手中主要的化學(xué)成分為多糖類、黃酮類、揮發(fā)油、香豆素、無(wú)機(jī)元素、氨基酸及維生素等[3-5]。目前對(duì)佛手的研究多局限在提取分離、化學(xué)成分、藥效物質(zhì)等方面，而施肥對(duì)佛手產(chǎn)量和品質(zhì)的研究尚無(wú)相關(guān)報(bào)道[3-5]。本研究在萬(wàn)州長(zhǎng)坪鄉(xiāng)中興村試驗(yàn)基地進(jìn)行，利用N、P、K三因子進(jìn)行不完全區(qū)組正交設(shè)計(jì)田間試驗(yàn)，采集同一時(shí)期的田間試驗(yàn)材料進(jìn)行品質(zhì)測(cè)試分析，并根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果對(duì)萬(wàn)州佛手栽培中的N、P、K肥配方與單果產(chǎn)量和品質(zhì)變化進(jìn)行研究，初步建立二者之間的數(shù)據(jù)模型，根據(jù)最優(yōu)模型進(jìn)行驗(yàn)證，為探討萬(wàn)州栽培佛手的施肥規(guī)律及其高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與地點(diǎn) 供試材料為栽培3年的佛手植株，種植面積約為6.67×105m2。試驗(yàn)地點(diǎn)在萬(wàn)州區(qū)長(zhǎng)坪鄉(xiāng)中興村。長(zhǎng)坪鄉(xiāng)屬亞熱帶季風(fēng)氣候；地處丘陵，地勢(shì)東高西低；種植區(qū)域海拔為350 m；年平均氣溫為 23.9℃，年平均生長(zhǎng)期為220 d，年平均無(wú)霜期為 300 d；年平均日照時(shí)數(shù)為1275 h；年平均降水量為1100 mm。土壤為紅壤，有機(jī)質(zhì)為55.32 g/kg，全氮為3.17 g/kg，硝態(tài)氮為 35.84 mg/kg，全磷為 0.54 g/kg，有效磷為9.54 mg/kg，全鉀為 26.35 g/kg，有效鉀為99.65 mg/kg。佛手主要物候期如下：佛手從春季芽萌動(dòng)到秋梢生長(zhǎng)停止，冬季部分老葉脫落，生長(zhǎng)期結(jié)束，最后進(jìn)入休眠或半休眠狀態(tài)。生長(zhǎng)期與休眠期的長(zhǎng)短因各地氣溫條件不同而有差異。本地產(chǎn)區(qū)一年四季開(kāi)花、三季結(jié)果，生長(zhǎng)期為2—11月，主要花期以4月為主，果期以7—8月為主，停止生長(zhǎng)的時(shí)間只有3個(gè)月左右。

1.1.2 主要儀器與試劑 主要儀器：島津LC-30A高效液相色譜儀、EL-204電子天平、J-HH-6A精密數(shù)顯恒溫水浴鍋、惠源HY-5000反滲透全膜法設(shè)備-純水生產(chǎn)設(shè)備。主要試劑：乙腈和甲醇色譜純?cè)噭┵?gòu)自霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司）；橙皮苷標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，乙醇和甲醇等分析純?cè)噭┵?gòu)自川東化工（集團(tuán)）有限公司，氮肥（尿素）和鉀肥（氯化鉀）購(gòu)自重慶江北化肥有限公司，磷肥（過(guò)磷酸鈣）購(gòu)自重慶江北磷肥廠。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部下發(fā)的“測(cè)土配方施肥技術(shù)規(guī)范（試行）”中推薦的“3414”不完全區(qū)組正交設(shè)計(jì)的N、P、K三因子施肥試驗(yàn)方案[6-8]，即：設(shè) N、P、K 3個(gè)因素，每個(gè)因素 4個(gè)施肥水平，共 14個(gè)處理的肥料試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案（表1），試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。栽種株行距為200 cm×200 cm，每個(gè)處理小區(qū)面積為6 m×6 m（共9株）。肥料用量按照表1中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，采用單株施肥量，不施有機(jī)肥，氮肥（尿素）50%作基肥，50%作追肥；磷肥（過(guò)磷酸鈣）全部作基肥一次性施用；鉀肥（氯化鉀）60%作基肥，40%作追肥[6-8]?；试诋?dāng)年 12月施入，追肥在第二年 4月施入[6-8]。

采收期選擇同一季節(jié)開(kāi)花、同一季節(jié)成熟的果實(shí)，采收后，稱重測(cè)得單果的平均鮮重，然后切片烘干，測(cè)果實(shí)的平均干重；按照《中國(guó)藥典》2020版一部，高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定佛手中橙皮苷的含量。具體方法如下：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水-冰醋酸（33∶63∶2）為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)為284 nm[2]。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于5000；取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成濃度為15 μg/mL的溶液，即得對(duì)照品溶液；取本品粉末（過(guò)五號(hào)篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液[2]；分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定[2]。

1.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)最優(yōu)施肥效應(yīng)模型，取N、P、K施肥區(qū)間的中間值作為施肥量進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，主要進(jìn)行干果單重和橙皮苷含量的檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel軟件和SPSS 19.0軟件等進(jìn)行一元二次、二元二次、三元二次回歸統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同配方佛手單果干重分析

由表1可知，在不施肥情況下佛手單果干重最低，不同施肥水平均能不同程度提高佛手單果干重，除了第8、第13、第14水平因子處理差異不顯著外，其他處理項(xiàng)均有顯著差異（P＜0.05），其中 N2P2K2處理單果干重最高，為(202.45±0.058)g，與 N0P0K0相比增產(chǎn) 34.78%。不同施氮水平（N1、N2、N3）佛手平均單果干重分別為186.32、190.22、194.21 g，與不施氮水平相比分別增產(chǎn) 24.04%、26.63%和 29.29%；不同施磷水平（P1、P2、P3）佛手單果平均干重分別為185.83、190.50、195.47 g，與不施磷肥處理相比分別增產(chǎn)23.71%、26.82%和30.13%；不同施鉀水平（K1、K2、K3）佛手單果干重分別為 181.87、192.13、198.24 g，與不施鉀肥處理相比分別增產(chǎn)21.08%、27.91%和31.98%。由于佛手單果干重及單株結(jié)果數(shù)量是佛手產(chǎn)量的主要因素，結(jié)果表明N、P、K肥均是佛手產(chǎn)量提高的決定因子。

2.2 不同配方佛手橙皮苷含量分析

由表1可知，在不施肥情況下，佛手中橙皮苷含量最低，為0.0306%，施用不同水平的N、P、K肥料后，均能不同程度地提高佛手中橙皮苷的含量，但含量差異較大，除第 8、第 9水平因子處理差異不顯著外，其他處理均有顯著差異（P＜0.05）。N、P、K肥最佳配比為 N2P2K2時(shí)，佛手中橙皮苷的含量最高為 0.0412%，比不用肥處理提高34.64%。不同施氮水平（N1、N2、N3）佛手中橙皮苷含量為 0.0366%、0.0362%、0.0392%，與不施氮水平相比分別增加 19.61%、18.30%、20.06%；不同施磷水平（P1、P2、P3）佛手中橙皮苷含量為 0.0363%、0.0366%、0.0364%，與不施磷肥處理相比分別增加18.63%、19.61%、18.95%；不同施鉀水平（K1、K2、K3）佛手中橙皮苷含量為 0.0343%、0.0374%、0.0384%，與不施鉀肥處理相比分別增加12.09%、22.22%、25.49%。因此，N、P、K肥均能明顯提高佛手中橙皮苷的含量，不同的N、P、K肥水平和N、P、K肥水平組合均對(duì)提高佛手中橙皮苷的含量有所不同。

表1 不同配方佛手產(chǎn)量和質(zhì)量Tab.1 Yield and quality of C.medica ‘Fingered’ of different treatments

2.3 佛手施肥模型的建立與分析

2.3.1 佛手單果干重和橙皮苷含量的三因素效應(yīng)分析 利用二次回歸分析，形成了佛手大田條件下N、P、K肥與佛手單果干重和橙皮苷含量的三元二次肥料效應(yīng)函數(shù)模型（表2）。由表2可知，佛手中單果干重與施肥量之間有極顯著回歸關(guān)系，三元二次肥料效應(yīng)函數(shù)模型方程中的常數(shù)項(xiàng)與不施肥處理相比數(shù)值相近（不施肥為150.2100，常數(shù)項(xiàng)為149.4183），說(shuō)明模型擬合效果好，為佛手N、P、K肥的合理配比及產(chǎn)量預(yù)測(cè)具有較好的指導(dǎo)作用。從函數(shù)方程中可看出，佛手單果干重肥料效應(yīng)函數(shù)方程中，N肥與P肥交互效應(yīng)系數(shù)為正值，而N肥與K肥、P肥與K肥的交互效應(yīng)系數(shù)為負(fù)值，說(shuō)明以單果干重為研究對(duì)象，N肥與P肥之間存在正交互效應(yīng)，而N肥與K肥、P肥與K肥之間存在負(fù)交互作用，則佛手單果干重隨施肥量的增加而呈現(xiàn)漸減率緩慢增加的趨勢(shì)。

表2 三元肥料效應(yīng)函數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Tab.2 Ternary fertilizer effect function and significance test

佛手中橙皮苷含量與施肥量之間也存在顯著回歸關(guān)系，并且三元二次肥料效應(yīng)函數(shù)模型方程中的常數(shù)項(xiàng)與不施肥處理相比數(shù)值相近（不施肥為0.0306%，常數(shù)項(xiàng)為0.0304%），以萬(wàn)州種植佛手中橙皮苷含量為考察對(duì)象，擬合效果較好。萬(wàn)州種植佛手橙皮苷含量肥料效應(yīng)函數(shù)方程中，一次項(xiàng)系數(shù)中的N肥為負(fù)值，而P肥和K肥均為正值、二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值。同時(shí)N、P肥和K肥的交互效應(yīng)系數(shù)也有差別，N肥和P肥之間存在負(fù)交互效應(yīng)，而N肥和K肥與P肥和K肥之間存在正交互效應(yīng)。

2.3.2 佛手單果干重和橙皮苷含量單因素效應(yīng)分析 以佛手單果干重和橙皮苷含量為研究對(duì)象，經(jīng)單因子效應(yīng)分析，得到佛手單果干重及橙皮苷含量的一元二次肥料效應(yīng)函數(shù)模型（表3）和曲線圖（圖1）。

從圖1可看出，N、P肥曲線圖呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，說(shuō)明 N、P肥存在最佳施肥量。從佛手單果干重及橙皮苷含量回歸方程可看出（表3），除了K肥對(duì)佛手中橙皮苷含量為正值外，N、P、K肥的二次項(xiàng)系數(shù)均小于0，說(shuō)明拋物線向下基本符合生物學(xué)規(guī)律，回歸模型真實(shí)。從佛手單果干重和橙皮苷含量一元二次肥料效應(yīng)函數(shù)模型一次項(xiàng)系數(shù)得出，肥料因子對(duì)佛手單果干重影響從大到小依次為N＞P＞K，對(duì)佛手中橙皮苷含量影響從大到小依次為P＞N＞K。以最大產(chǎn)量為指標(biāo)，以佛手單果干重和橙皮苷含量一元二次單因素效應(yīng)方程計(jì)算分析，佛手單果干重N、P、K肥的最佳施肥量分別為52.21、41.78、61.93 g/株，佛手橙皮苷N、P、K肥的最佳施肥量分別為44.44、34.88、49.50 g/株。

表3 一元肥料效應(yīng)函數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Tab.3 Univariate fertilizer effect function and significance test

圖1 單因素影響下單果干重和橙皮苷含量變化Fig.1 Changes of dry weight and hesperidin content of single fruit under the influence of single factor

2.3.3 N、P、K二因素效應(yīng)分析 以佛手單果干重和橙皮苷含量為研究對(duì)象，得到佛手單果干重和橙皮苷含量的二元二次肥料效應(yīng)函數(shù)模型（表4）和二因子的曲線圖（圖2）。由表4和圖2可知，因素處理并非僅僅表現(xiàn)出肥料因素簡(jiǎn)單的加和作用，同時(shí)還存在肥料因素之間的協(xié)同促進(jìn)作用和拮抗作用。以萬(wàn)州引種佛手單果干重為指標(biāo)，N肥因素中的任意一個(gè)處于2水平時(shí)，隨著另外2個(gè)因素施肥量的增加，佛手單果干重均表現(xiàn)為先增加后減少的趨勢(shì)，說(shuō)明任意2個(gè)因素在一定范圍內(nèi)存在著相互作用；以佛手中橙皮苷含量為指標(biāo)時(shí)，當(dāng)N、P、K肥處于2水平時(shí)，佛手中橙皮苷含量同樣也表現(xiàn)出先增加后減少的趨勢(shì)，所以在一定范圍內(nèi)也表現(xiàn)出相互作用。

圖2 肥料對(duì)佛手單果干重和橙皮苷含量?jī)梢蛩鼗プ餍?yīng)三維圖Fig.2 Three dimensional interaction effect of fertilizer on dry weight and hesperidin content of bergamot fruit

表4 二元肥料效應(yīng)函數(shù)及顯著性檢驗(yàn)Tab.4 Binary fertilizer effect function and significance test

2.3.4 模型的優(yōu)化方案 本研究對(duì)佛手單果干重和橙皮苷含量經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行優(yōu)化，按照試驗(yàn)條件的一般規(guī)律，產(chǎn)量越高，有效成分的含量越高，從佛手單果干重和橙皮苷含量模型上常用求最大值的方法來(lái)優(yōu)化模型，然而，從佛手單果干重和橙皮苷含量模型上看，佛手單果干重和橙皮苷含量最大值僅僅是理論值，但在生產(chǎn)實(shí)際中出現(xiàn)的概率較低，因此一般不采用求佛手單果干重和橙皮苷含量最大值的方法來(lái)優(yōu)化模型，而是利用頻次分析方法進(jìn)行模型的優(yōu)化。按照佛手單果干重和橙皮苷含量“3414”試驗(yàn)，共有 43=64方案。其中，根據(jù)佛手單果干重和橙皮苷含量肥料效應(yīng)模型分析，采用數(shù)學(xué)求導(dǎo)法計(jì)算出萬(wàn)州種植佛手最佳施肥量，對(duì)產(chǎn)量和有效成分含量進(jìn)行頻次分析，結(jié)果顯示佛手單果干重在181.25 g以上的方案有36個(gè)，佛手中橙皮苷的含量在0.0351%以上有32個(gè)，綜合佛手單果干重和佛手中橙皮苷的含量的結(jié)果，對(duì)佛手單果干重和橙皮苷含量進(jìn)行模擬優(yōu)化尋優(yōu)，選擇有效方案28個(gè)，肥料試驗(yàn)編碼取值分布情況見(jiàn)表5。

從表5可看出，佛手種植大田試驗(yàn) N、P、K肥的最佳施肥量分別為38.78~51.25、35.67~42.35、48.17~60.37 g/株?？梢?jiàn)，N、P、K肥的施用比例并非固定不變，而應(yīng)根據(jù)土壤的基礎(chǔ)肥力適當(dāng)調(diào)整，才能達(dá)到佛手單果干重和佛手中橙皮苷含量的最大化。

表5 產(chǎn)量與質(zhì)量的頻率分析及優(yōu)化方案Tab.5 Frequency analysis and optimization scheme of yield and quality

2.3.5 最優(yōu)方案的驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 根據(jù)最優(yōu)施肥效應(yīng)模型，取N2P2K2施肥區(qū)間的中間值作為主要最優(yōu)值進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。由圖3和圖4可看出，在最優(yōu)施肥模型條件下，栽培佛手的產(chǎn)量和橙皮苷含量均比“3414”組高。單果干重產(chǎn)量較“3414”組的最高產(chǎn)量高出 8.14%，橙皮苷含量較“3414”最高組高出 1.94%，說(shuō)明最優(yōu)配方施肥模型合理。

圖3 最優(yōu)施肥模型單果干重比較Fig.3 Comparison of dry weight of single fruit in optimal fertilization model

圖4 最優(yōu)施肥模型橙皮苷含量比較Fig.4 Comparison of hesperidin content in optimal fertilization models

3 討論

研究表明，佛手N、P、K配合施肥能夠明顯增加萬(wàn)州佛手單果干重和佛手中橙皮苷含量，可在實(shí)際操作過(guò)程中，由于種植藥農(nóng)觀念上的差異，造成肥料施用過(guò)程中有所偏好，造成產(chǎn)量和品質(zhì)的下降，制約了萬(wàn)州佛手產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

已有研究表明，氮肥能促使樹(shù)木繁茂，增加葉綠素，補(bǔ)充植物成長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)；磷肥能促使植物莖枝堅(jiān)韌、促花芽形成和開(kāi)花、果實(shí)早熟，提高植物的抗寒抗旱能力[6-8]；而鉀肥能促使植物的莖干強(qiáng)健，提高植物抗病、抗蟲(chóng)、抗旱、抗倒伏的能力，使其根系發(fā)達(dá)，提高果實(shí)的品質(zhì)。佛手單果干重和器官的分化、發(fā)育及光合產(chǎn)物的分配和積累密切相關(guān)，了解其形成規(guī)律與N、P、K之間的關(guān)系是進(jìn)行合理肥效調(diào)控，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)的基礎(chǔ)[6-8]。本研究結(jié)果表明，N、P、K肥對(duì)萬(wàn)州種植佛手單果干重和橙皮苷含量有影響，在萬(wàn)州種植佛手生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中N肥是主要限制因子，其含量決定著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的合成，同時(shí)P肥和K肥也能協(xié)助萬(wàn)州種植佛手光合作用產(chǎn)物到營(yíng)養(yǎng)器官的運(yùn)輸，使萬(wàn)州種植佛手產(chǎn)量增加，品質(zhì)提高，與N、P、K肥料的作用相符。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，佛手單果干重產(chǎn)量較“3414”組的最高組高出8.14%，橙皮苷含量較“3414”組的最高組高出1.94%。說(shuō)明最優(yōu)配方施肥模型合理，這對(duì)佛手的大田栽培具有一定的實(shí)踐指導(dǎo)作用。

藥用植物的品質(zhì)形成與藥用植物中有效成分的含量高低有關(guān)。天然黃酮類化合物多以苷類形式存在，橙皮苷是黃酮類化合物，而黃酮苷的形成多以可溶性糖為基礎(chǔ)[6-8]。佛手中水溶性浸出物中含有較多的可溶性糖類，這說(shuō)明可溶性糖類與佛手中總黃酮的合成可能直接有關(guān)[6-8]。土壤養(yǎng)分缺乏或不平衡可能影響佛手中可溶性糖的合成，從而降低佛手中橙皮苷的含量，平衡施肥促進(jìn)佛手中可溶性糖的合成，從而提高了佛手中橙皮苷的含量[6-8]。本研究結(jié)果表明，不施 N、P、K肥能顯著降低萬(wàn)州種植佛手中橙皮苷的含量，N、P、K三因子中兩因子存在著交互效應(yīng)，對(duì)佛手中橙皮苷的含量有一定的影響。