劉 璨，陳 華,3*，唐敏敏，宋 菲，張玉鋒，羅詩怡

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌 571339；3.海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南文昌 571339

檳榔（Areca catechuL.）是海南省的重要經(jīng)濟(jì)作物，是海南東部、中部和南部地區(qū)200多萬農(nóng)民重要的經(jīng)濟(jì)來源[1]。檳榔作為我國(guó)四大南藥之一，含有生物堿、酚類、縮合鞣質(zhì)等生物活性成分，具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗溶血、抗疲勞、抗衰老等作用[2]。鮮食檳榔是我國(guó)檳榔消費(fèi)的主要產(chǎn)品之一，且其活性功能的開發(fā)潛力巨大。常見的檳榔保鮮方法有：利用茉莉酸甲酯、脫氫乙酸鈉、氯化鈣、6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）、甲基硫菌靈、赤霉素（GA3）、1-甲基環(huán)丙烯（1-MCP）、次氯酸鈉、硫化氫、果蠟等涂膜，物理方法則包括冷藏、氣調(diào)、輻照保鮮處理等，已有報(bào)道采用60Co-γ輻照與100 mg/L赤霉素、100 mg/L 6-BA、50%果蠟復(fù)配涂膜相結(jié)合，能有效控制因霉菌引起的果實(shí)腐爛，并能降低檳榔堿損失[3-8]。涂膜保鮮是指在產(chǎn)品表面人為添加一層其本不具有的可食性包覆薄膜，常見的有多糖類、脂類、聚乙烯醇、蛋白質(zhì)類基質(zhì)，可顯著增加果蔬光亮度、降低果實(shí)被外界致病菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)調(diào)控呼吸強(qiáng)度、硬度、物質(zhì)成分含量等品質(zhì)指標(biāo)，改善果皮通透性、細(xì)胞壁金屬離子代謝通路及外源植物激素含量的方式來延緩或部分抑制鮮果自身代謝，從而達(dá)到延長(zhǎng)保鮮期或提升品質(zhì)的目的[9-10]?，F(xiàn)關(guān)于百里香酚、茶多酚、殼聚糖對(duì)檳榔鮮果保鮮效果的研究報(bào)道較少，因此本研究從百里香酚、茶多酚、殼聚糖對(duì)檳榔鮮果的保鮮效果出發(fā)，探討不同涂膜處理對(duì)檳榔鮮果品質(zhì)的影響規(guī)律，為檳榔殼聚糖涂膜保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

檳榔鮮果：2021年 12月采摘于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所檳榔種植基地，果形指數(shù)保持在1.8±0.1左右；所有鮮果經(jīng)蒸餾水、1 mmol/L焦亞硫酸鈉清洗后，統(tǒng)一對(duì)果蒂處進(jìn)行抗氧化劑（叔丁基對(duì)苯二酚）封閉處理。

主要試劑：殼聚糖、茶多酚（國(guó)產(chǎn)市售）、三氯化鋁，DG（18）培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、鐵氰化鉀、半乳糖醛酸、葉綠素a均購(gòu)于麥克林試劑有限公司，沒食子酸、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于 Biotech sharp和Sangan Biotech公司，木質(zhì)素、纖維素、蒽酮購(gòu)于阿拉丁生化科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基肼標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于西格瑪貿(mào)易有限公司；其他試劑均為國(guó)藥AR級(jí)。

主要儀器：pH計(jì)pHS-3C；數(shù)碼體視生物顯微鏡S8APO；培養(yǎng)箱DGZL-1000；色差計(jì)柯尼卡美CM-700d；高速中藥粉碎機(jī)IKA ALL；超凈工作臺(tái)SW-CJ-1CU；人工氣候箱杭州微松環(huán)境科技有限公司；食品物性分析儀FTC/TMS-PR；冷凍離心機(jī)HERMLEZ32HK；全自動(dòng)熒光免疫分析儀Thermo Sci-Var-Flash；LED燈箱，-40℃低溫速凍冰箱。

1.2 方法

1.2.1 鮮果預(yù)處理 樣品經(jīng)自來水清洗并以1 mmol/L Na2S2O5簡(jiǎn)單消毒后，3種處理：CK（含0.5142 g/L HCl，2.367 g/L 吐溫 100）、T1（含0.5142 g/L HCl，11.83 g/L殼聚糖，2.367 g/L吐溫100）、T2（含 0.5142 g/L HCl，11.83 g/L 殼聚糖，3.56 g/L茶多酚，1.75 g/L百里香酚，2.367 g/L吐溫 100），所有復(fù)配體系在 13℃、100 r/min避光振蕩2 h，超聲脫氣30 min后使用。將鮮果樣品分別置于 CK、T1、T2涂膜處理劑中，均勻浸泡10 s后用濾網(wǎng)瀝出，再把所有樣品置于13℃通風(fēng)避光環(huán)境下晾干12 h，再以PE帶孔保鮮袋（厚度0.01 mm，孔徑8 mm×8 mm無菌濾紙透氣孔）進(jìn)行封裝，每袋約為10個(gè)左右，如圖1所示，于13℃、相對(duì)濕度65%環(huán)境下儲(chǔ)藏備用。

圖1 檳榔鮮果預(yù)處理后包裝成品Fig.1 Pretreated and packed fresh betel nut

1.2.2 樣品制備方法 待測(cè)的鮮果棄其果蒂，洗凈后切開得到果仁、果皮。果仁經(jīng)-40℃速凍后置于50 mL離心管中并加入20 mL蒸餾水后，采用漩渦混合器進(jìn)行研磨處理，得到的勻漿再加入20 mL蒸餾水，經(jīng)真空抽濾后取上清液儲(chǔ)存于-40℃冰箱備用。果皮經(jīng)-40℃速凍后采用高速中藥粉碎機(jī)粉碎 1 min，處理得到的均勻纖維置于50 mL離心管中，加入40 mL蒸餾水于4℃培養(yǎng)箱中振蕩提取1 h后，經(jīng)真空抽濾后取上清液，儲(chǔ)存于-40℃冰箱備用。

1.2.3 物理指標(biāo)測(cè)定 經(jīng)過上述處理后，測(cè)定檳榔果實(shí)物理指標(biāo)。

（1）失重率的測(cè)定。失重率=（初始重量-儲(chǔ)藏第n天的重量）/初始重量×100%。

（2）腐爛率的測(cè)定。腐爛率=[Σ(單果腐爛面積×對(duì)應(yīng)腐爛果個(gè)數(shù))]/總個(gè)數(shù)×100%。

（3）色差的測(cè)定。色差值由色差計(jì)在LED燈箱內(nèi)測(cè)定，最終結(jié)果表示為*L、*a、*b、ΔE值的均值，計(jì)算公式為：并計(jì)算得到色角度值H，計(jì)算公式為：H=arc(tanh)，h=*b/*a；

（4）硬度的測(cè)定。利用食品物性分析儀測(cè)定樣品，將檳榔鮮果沿縱徑固定于橫切面半徑r=40 mm的泡沫半圓柱槽內(nèi)，鮮果的橫徑最高點(diǎn)為擠壓起始點(diǎn)，探頭為直徑75 mm的圓盤擠壓探頭，參數(shù)：最大觸發(fā)力250 N，起始位移50 mm，擠壓形變量10%，測(cè)試速度2 mm/s，擠壓2次。

（5）呼吸強(qiáng)度的測(cè)定。植物呼吸強(qiáng)度常用乙烯釋放量來表示，本研究在CO2靜置吸收法上稍作修改[11-12]。在內(nèi)置塑料網(wǎng)、體積 0.4 L、半徑r=(5.0±0.1)mm的 PPE雙旋口塑料瓶?jī)?nèi)進(jìn)行呼吸強(qiáng)度測(cè)定。在塑料網(wǎng)上方放置已知重量的檳榔鮮果，下方加入4 mL 0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。旋緊瓶身后統(tǒng)一置于13℃、相對(duì)濕度65%環(huán)境下反應(yīng)，30 min后用2 mL去CO2蒸餾水將堿液洗至潔凈錐形瓶中，另加 1 mL飽和 Na2CO3溶液和20 μL酚酞指示劑，用0.04 mol/L草酸滴定，體系由紫色變?yōu)榘咨?0 s內(nèi)顏色不再改變?yōu)榈味ńK點(diǎn)，計(jì)算公式為：NCO2=2×(V1×0.04-V2×0.1)；呼吸強(qiáng)度=NCO2×44×m-1×t-1；式中，N表示 CO2物質(zhì)的量，單位為 mol；V1表示滴定至終點(diǎn)時(shí)所用0.04 mol/L草酸的體積，單位為L(zhǎng)；V2表示0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的使用體積，單位為 L；m表示鮮果重量，單位為 kg；t表示反應(yīng)時(shí)間，單位為min；呼吸強(qiáng)度的單位為mg/(kg·min)。

（6）果仁褐變程度的測(cè)定。鮮果縱切后，立即在燈箱內(nèi)以HUAWEI YAL-AL進(jìn)行切面RGB圖像的采集，設(shè)備的光圈值 f/1.4、曝光時(shí)間1/180 s、水平垂直分辨率均為 96 dpi，圖像的分辨率為3000 pxiel×4000 pxiel。原始圖像采集完成后，對(duì)圖像分析處理后可用于特征值的表征[13]。以 Image J 2.4軟件進(jìn)行處理分析，圖像類型為sRGB stack，采用 Interactive 3D surface plot對(duì)采集的圖像進(jìn)行3D處理，以X-Z投影面上Z軸像素點(diǎn)的分布來展示果仁的褐變程度。以采摘后發(fā)生褐變的鮮果為例，處理步驟見圖2。

圖2 果仁褐變程度處理步驟Fig.2 Steps of nuts browning degree treatment

1.2.4 酶活性的測(cè)定 經(jīng)過1.2.2處理后，測(cè)定相關(guān)酶活性。

（1）果仁多酚氧化酶（PPO）活性的測(cè)定。參照《現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》[14]，并作適當(dāng)修改；測(cè)定 410 nm處的吸光值，單個(gè)樣品測(cè)定Δt=1 s，測(cè)試12次，取前10次計(jì)算多酚氧化酶活性，最終結(jié)果以吸光值每10 s內(nèi)變化0.001為一個(gè)酶活性單位，以U來表示。

（2）葉綠素酶（CLH）活性的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[15]并作適當(dāng)修改；取丙酮層10 μL于384微孔板中，測(cè)定665 nm處吸光值，單個(gè)樣品Δt=1 s，測(cè)試12次，取前10次計(jì)算葉綠素酶活性，最終結(jié)果以吸光值每10 s內(nèi)變化0.001為一個(gè)酶活性單位，以U來表示。

1.2.5 物質(zhì)成分含量的測(cè)定 經(jīng)過1.2.2處理后，測(cè)定物質(zhì)成分含量。

（1）總糖含量的測(cè)定?？偺菧y(cè)定采用蒽酮水解法[16]，無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0222x+0.0065，R2=0.992，可求得總糖含量。

（2）乙基纖維素和木質(zhì)素含量的測(cè)定。乙基纖維素含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]，取粉碎均勻的果皮纖維，用蒸餾水反復(fù)沖洗至洗液無色后，65℃烘干備用。取0.1 g果皮纖維烘干至恒重，置于2 mL離心管中，加入 1 mL 0.1%（m/V）蒽酮（0.50 g蒽酮+50 g硫脲+500 mL 72%硫酸）溶液，80℃水浴10 min，迅速冷卻后暗處?kù)o置20 min，4000 r/min離心2 min。取50 μL上清液測(cè)定620 nm處吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0033x+0.036，R2=0.9802，求得乙基纖維素含量。木質(zhì)素含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[18]并作適當(dāng)修改。取0.1 g果皮纖維烘干至恒重，置于2 mL離心管中，加入200 μL 25%（V/V）溴乙酰-冰醋酸，70℃加熱30 min后，加入500 μL 2 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液、500 μL 1 mol/L鹽酸羥胺、500 μL冰乙酸，振蕩均勻后10 000 r/min離心10 min，取30倍上清稀釋液50 μL于UV板中測(cè)定280 nm處吸光值。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.7254x-0.0032，R2=0.997，求得木質(zhì)素含量。

（3）總黃酮含量的測(cè)定。采用 AlCl3-NaNO2法[19]測(cè)定果仁和果皮超濾液中的總黃酮含量，以蘆丁當(dāng)量表示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.6416x+0.0766，R2=0.9924。

（4）總多酚含量的測(cè)定。采用福林酚法[20]測(cè)定果仁和果皮超濾液中的總黃酮含量，結(jié)果以沒食子酸當(dāng)量表示，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0146x+0.0066，R2=0.991。

1.2.6 抗氧化能力的測(cè)定 （1）DPPH（1,1-二苯基-2-苦基肼自由基）清除率的測(cè)定。參照文獻(xiàn)[21]并作適當(dāng)修改，取0.1 mmol/L DPPH乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液加入384孔板中，每孔精確加入20 μL后置于-20℃冷凍儲(chǔ)藏。測(cè)定時(shí)取出，于13℃靜置5 min解凍，測(cè)定492 nm處吸光值作為初始值（A0），然后向每孔中加20 μL超濾樣液，于25℃暗處反應(yīng)20 min后再次測(cè)定492 nm處吸光值（Asamples）。DPPH清除率計(jì)算公式為：

式中，A0為樣本在492 nm處的初始吸光值，Asample為樣品在492 nm處的吸光值。

（2）Fe3+還原能力的測(cè)定。Fe3+還原能力可作為樣品抗氧化能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)，測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[22]，F(xiàn)e3+還原能力計(jì)算公式為：

式中，Asample為樣本在700 nm處的吸光值，Ablank為蒸餾水（對(duì)照）在700 nm處的吸光值，msample為樣品質(zhì)量，單位為mg。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均來自3次平行試驗(yàn)均值，測(cè)試結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用 Excel 2019、Image J 2.4、SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同涂膜處理對(duì)檳榔鮮果物理指標(biāo)的影響

2.1.1 失重率 儲(chǔ)藏至10 d后，不同涂膜組失重率開始呈現(xiàn)出差異（P＜0.05），在前10 d CK組失重率為 0，隨儲(chǔ)藏天數(shù)的增加失重率逐漸上升，第40天時(shí)達(dá)到最高，顯著高于 T1、T2（P＜0.05）。表明檳榔鮮果儲(chǔ)藏時(shí)（＞35 d），殼聚糖、殼聚糖-茶多酚-百里香酚涂膜處理對(duì)果實(shí)失重率上升有抑制作用，T2處理的抑制作用最明顯，第40天時(shí)失重率僅為3%（圖3A）。這可能是由于隨著鮮果呼吸代謝，附著在果皮表面的殼聚糖載體對(duì)環(huán)境中的水分有一定吸收作用，外界水分的引入導(dǎo)致質(zhì)量增加，從而一定程度上抵消了果實(shí)物質(zhì)交換所損耗的質(zhì)量，從而體現(xiàn)在失重率的上升被抑制。

2.1.2 腐爛率 檳榔鮮果儲(chǔ)藏過程的腐爛主要由外界微生物侵染和自身衰老所致，前25 d內(nèi)，所有鮮果在試驗(yàn)處理?xiàng)l件下的腐爛率均低于40%，有較好的保鮮意義。T1、T2鮮果在35 d時(shí)的腐爛率保持較好，腐爛率均低于30%。而T2處理的抑制腐爛作用優(yōu)于T1處理，35 d時(shí)腐爛率僅為8%，但隨后腐爛率迅速升至65%，雖仍具有食用價(jià)值但保鮮意義不大，而且隨儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)表面霉菌會(huì)快速生長(zhǎng)繁殖，進(jìn)而污染全部鮮果，最終失去儲(chǔ)藏價(jià)值（圖3B）。

圖3 不同處理對(duì)檳榔鮮果失重率、腐爛率的影響Fig.3 Effect of weight loss rate and rotting rate in nuts under different treatments

2.1.3 色差 評(píng)價(jià)果蔬外觀色澤時(shí)，常用到 CIE坐標(biāo)體系（*L值、*a值、*b值、ΔE值）[23]。*L反映樣品測(cè)試區(qū)灰度值，*a值反映測(cè)試區(qū)紅綠通道數(shù)值，*b值反映測(cè)試區(qū)黃藍(lán)通道。ΔE值則反映測(cè)試區(qū)的色澤穩(wěn)定性，即 ΔE值越大，色澤穩(wěn)定性越差分布越不均勻。

CK組內(nèi)*L值在第 5天達(dá)到最高值后呈逐漸下降趨勢(shì)（圖4A）。T1組*L值在前25 d時(shí)較為穩(wěn)定，而在第40天時(shí)*L值極顯著下降（P＜0.001）。殼聚糖涂膜、殼聚糖-茶多酚-百里香酚涂膜處理在儲(chǔ)藏第1天時(shí)，即可顯著增加果實(shí)表面的亮度（P＜0.05），儲(chǔ)藏至 25 d后果實(shí)亮度極顯著高于CK組，表明其對(duì)果實(shí)亮度的保持最為有效。殼聚糖對(duì)檳榔鮮果表皮有一定的護(hù)色作用，而殼聚糖-茶多酚-百里香酚復(fù)配涂膜劑則較好地抑制了果實(shí)表面亮度的下降，利于鮮果保鮮。

*a值越小綠色分布區(qū)越大，*a值越大紅色區(qū)分布越大。T2組的*a值呈先升后降的趨勢(shì)（圖4B），并且結(jié)合*L值、*b值的數(shù)據(jù)來看，這很好地反映出鮮果儲(chǔ)藏時(shí)色澤由深綠變?yōu)闇\綠而后趨于嫩綠色的現(xiàn)象。T1處理有效地抑制了果皮*a值上升，第40天時(shí)，果皮區(qū)域仍呈現(xiàn)較健康的綠色，無黃化現(xiàn)象，但此時(shí)果實(shí)暗度大于T2組。CK組在 13℃、65%RH環(huán)境下儲(chǔ)藏，其*a值在一定程度上也受到了抑制，僅果蒂下方出現(xiàn)了一定的區(qū)域色澤變淺現(xiàn)象，但果皮整體顏色變化不大，均未出現(xiàn)大面積黃化現(xiàn)象。

*b值越大樣品在黃色區(qū)域占比越大，*b值越小樣品在藍(lán)色區(qū)域的占比越大，綜合*L、*a、*b值來看，CK組鮮果的*b值在第5天時(shí)最高（圖4C），第 40天時(shí) CK組的*b值顯著高于 T1、T2處理，T1組在前 25 d時(shí)，*b值基本穩(wěn)定在 30.0左右，儲(chǔ)藏至第40天時(shí)*b值下降（P＜0.05），這表明T1涂膜處理對(duì)鮮果在黃、藍(lán)通道的影響并不明顯，并且結(jié)合T1組*L值來看，T1涂膜處理對(duì)果實(shí)顏色的穩(wěn)定起到了一定的作用。T2涂膜處理對(duì)鮮果表皮*b值的影響波動(dòng)較大，在儲(chǔ)藏至第 25天時(shí)，其*b值、*L值均顯著高于CK、T1涂膜處理組（P＜0.05），這表明此時(shí)鮮果趨向于亮綠色轉(zhuǎn)變，而第40天時(shí)，其*b值又顯著降低，即此時(shí)果實(shí)黃化現(xiàn)象并不顯著，T2涂膜處理對(duì)鮮果的表皮色澤起到了一定的改善作用。

ΔE數(shù)值大小常用來表示樣品的顏色變化程度，CK組ΔE值的變化趨勢(shì)與其*L、*b值變化較為一致，即在前25 d內(nèi)顏色變化最為明顯而后趨于穩(wěn)定。而T1組ΔE值在前25 d的變化并不明顯，直至第40天時(shí)ΔE值才出現(xiàn)了較大變化（圖4D），這表明殼聚糖涂膜處理可有效延緩鮮果果皮色澤的變化，利于色澤保持。

H值（色角度）可由 CIE坐標(biāo)轉(zhuǎn)換而來，H=arc(tanh)=arc[tan(b/a)]。h值域范圍[24]為：h＜10°紫 區(qū) ， 40°＜h＜75°橙 區(qū) ， 75°＜h＜95°黃 區(qū) ，95°＜h＜235°綠區(qū)，235°＜h＜295°藍(lán)區(qū)。0＜H＜1 表明其角度分布在第一象限內(nèi)，H變化越大，則鮮果色澤變化越大。如圖4E所示，CK組H值逐漸降低，在儲(chǔ)藏至第40天時(shí)略低于另兩組。并且，T1涂膜處理的鮮果前25 d內(nèi)H值較穩(wěn)定，說明涂膜處理有效維持了儲(chǔ)藏前期鮮果色澤的穩(wěn)定。

圖4 不同處理對(duì)鮮果＊L、＊a、＊b、ΔE、H值的影響Fig.4 Effect of different treatments on *L、*a、*b、ΔE、H values of fresh betel nut

2.1.4 硬度 所有處理的鮮果硬度最大值均出現(xiàn)在第25天（圖5），其中，T2組在處理1 d內(nèi)硬度低于CK、T1組，而第25天后極顯著高于另兩組（P＜0.001）。綜合來看，隨著果實(shí)完全成熟硬度逐漸下降，儲(chǔ)藏至第40天時(shí)，T1組硬度降至最低，而此時(shí) T2組果實(shí)硬度極顯著高于 T1組（P＜0.001），且T2組硬度先升后降的變化趨勢(shì)最為明顯，這表明 T2組鮮果的代謝正常進(jìn)行，有利于保持果實(shí)硬度在合適范圍內(nèi)，從而延緩果實(shí)腐爛軟化。

圖5 不同處理對(duì)鮮果硬度的影響Fig.5 Effect of different treatments on hardness of fresh betel nut

2.1.5 果仁褐變程度 以像素點(diǎn)在X、Z投影面的分布來表示果仁褐變程度（Z=0~240，褐變程度由低到高）。在第5天時(shí)，CK組褐變程度明顯高于T1組和T2組，其像素點(diǎn)在Z≥100的分布明顯多于 T1、T2組，且隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)，CK組像素點(diǎn)在Z≤40的分布逐漸減少，表明果仁亮度下降（圖6）。而 T1組果仁褐變程度明顯低于CK組，這表明相同儲(chǔ)藏條件下，儲(chǔ)藏12 d內(nèi)殼聚糖涂膜可有效減緩鮮果果仁褐變的發(fā)生，且可有效保持果仁亮度。綜合來看，T2處理可明顯抑制果仁褐變，但第12天時(shí)其果仁褐變程度明顯高于CK、T1組，這可能是由于在第12天時(shí)，酚類物質(zhì)在儲(chǔ)藏初期積累至一定程度后多酚氧化酶活性增加從而導(dǎo)致果仁褐變突然增加。

圖6 不同處理對(duì)鮮果果仁褐變程度的影響Fig.6 Effect of treatments on browning degree of fresh betel nut

2.2 不同涂膜處理對(duì)呼吸強(qiáng)度的影響

CK組呼吸強(qiáng)度在第12天達(dá)到呼吸高峰，隨后第25天呼吸強(qiáng)度迅速下降，第40天時(shí)鮮果自身基本已不具備呼吸功能（圖7）。T1組在涂膜處理完成后第1天時(shí)呼吸強(qiáng)度高于CK組，第一次呼吸峰出現(xiàn)在第5天，第二次呼吸高峰出現(xiàn)在第25天。T2組呼吸強(qiáng)度同樣出現(xiàn)了二次呼吸高峰，且涂膜處理第1天時(shí)，T2組呼吸強(qiáng)度顯著高于CK組，并且在第 25天時(shí)，呼吸強(qiáng)度再次明顯高于CK、T1組，最終呼吸強(qiáng)度趨向于0。

圖7 不同處理方式對(duì)鮮果呼吸強(qiáng)度的影響Fig.7 Effect of different treatment methods on respiration intensity of fresh betel nut

2.3 不同涂膜處理對(duì)檳榔鮮果酶活性的影響

第25天后，T2組果仁褐變程度明顯低于CK組，結(jié)合多酚氧化酶活性來看，此時(shí)T2組果仁多酚氧化酶（PPO）活性并未降低反而呈遞增趨勢(shì)（圖8A），這表明T2組鮮果此時(shí)的酚類物質(zhì)代謝以苯丙氨酸代謝途徑為主，并非傾向于醌類轉(zhuǎn)變。

從色澤指標(biāo)來看，T1、T2涂膜有效抑制了儲(chǔ)藏期內(nèi)鮮果黃化，因此測(cè)定了果皮中葉綠素酶（CLH）活性（圖8B）。CK組鮮果在第25天時(shí)葉綠素酶活性才達(dá)到組內(nèi)最高，且活性均較低，這表明未經(jīng)殼聚糖、殼聚糖-酚類涂膜處理的鮮果其果皮生理代謝活性受到了儲(chǔ)藏環(huán)境的抑制。而T1、T2組酶活性極顯著高于 CK 組（P＜0.001），這表明涂膜處理一定程度上減輕了低溫（13℃）對(duì)鮮果生理代謝的抑制，并且結(jié)合色差數(shù)據(jù)來看，儲(chǔ)藏后期涂膜組果皮綠色仍保持較好，說明經(jīng)涂膜處理的鮮果葉綠素代謝一直在進(jìn)行，但可能存在代謝后期受阻的現(xiàn)象，并未產(chǎn)生大量葉黃素類物質(zhì)，從而達(dá)到較好護(hù)色效果。

圖8 不同處理對(duì)果仁多酚氧化酶和果皮葉綠素酶的影響Fig.8 Effect of different treatments on kernel polyphenol oxidase and pericarp chlorophyllase

2.4 不同涂膜處理對(duì)檳榔鮮果物質(zhì)成分含量的影響

2.4.1 總糖含量 在儲(chǔ)藏40 d內(nèi)，T1組果仁總糖含量在采后40 d內(nèi)呈先升后降的趨勢(shì)，第40天時(shí)其含量低于CK、T2組。T2組在前25 d內(nèi)果仁均高于 CK組，隨著儲(chǔ)藏天數(shù)增加果實(shí)進(jìn)行自身代謝，總糖在采后第12天時(shí)達(dá)到峰值，隨后碳基化合物降解，總糖含量逐漸下降（圖9A）。

2.4.2 木質(zhì)素和纖維素 檳榔鮮果的木質(zhì)素和纖維素集中分布于果皮內(nèi)，其聚合程度和含量高低影響著果實(shí)軟硬度和咀嚼性。采后 1 d時(shí)，T1組果皮纖維素、木質(zhì)素含量均極顯著高于 CK組（P＜0.001），而儲(chǔ)藏至第40天時(shí)CK組果皮木質(zhì)素含量顯著低于T1、T2組，此時(shí)CK組果皮已出現(xiàn)腐爛，但其硬度高于T1組，這主要是CK組果仁硬度快速上升所致，超出了木質(zhì)素、纖維素含量對(duì)硬度的影響閾值（圖9B，圖9C）。

圖9 不同處理對(duì)鮮果總糖、乙基纖維素、木質(zhì)素的影響Fig.9 Effect of different treatments on total sugar, ethyl cellulose and lignin content of fresh betel nut

一般來說，未進(jìn)行任何處理的檳榔鮮果木質(zhì)素含量隨儲(chǔ)藏天數(shù)增加而增加，但本研究中 CK組木質(zhì)素含量的變化未能很好地體現(xiàn)該現(xiàn)象，其原因可能是統(tǒng)一帶有透氣孔的 PE自發(fā)氣調(diào)包裝對(duì)鮮果木質(zhì)化進(jìn)程造成了影響?？偟膩碚f，不同涂膜處理對(duì)果皮木質(zhì)素含量存在一定影響，儲(chǔ)藏40 d時(shí)，CK、T1組果皮木質(zhì)素含量均降至較低水平，對(duì)比之下，T2組果皮木質(zhì)素含量波動(dòng)較小，第40天木質(zhì)素含量與第1天差異不大，表明T2處理可有效維持果皮木質(zhì)素含量的穩(wěn)定，有利于其形態(tài)結(jié)構(gòu)的保持，在儲(chǔ)藏后期，T2涂膜可能促進(jìn)了果皮的莽草酸代謝，從而使其纖維素、木質(zhì)素在第40天時(shí)均極顯著高于另兩組（P＜0.001）。T1涂膜對(duì)第1天果皮木質(zhì)素、纖維素的影響相同，即 T1處理可在儲(chǔ)藏初期相對(duì)增加該類聚合物含量，以此提高果實(shí)抗病菌能力。

2.4.3 黃酮 CK組果仁黃酮含量在第 1天時(shí)極顯著高于T1、T2組（P＜0.001）。在儲(chǔ)藏至第5天時(shí)，CK組、T1組果仁黃酮極顯著下降（P＜0.001），此時(shí) T2涂膜處理有效延緩了果仁黃酮含量的下降。但25 d后，黃酮含量均下降到較低水平（圖10A）。涂膜處理對(duì)果皮黃酮含量并無顯著增加作用，相反地，T1、T2組果皮黃酮含量反而低于CK組（圖10B），這可能是由于涂膜處理對(duì)鮮果有一定的保護(hù)作用，黃酮作為果蔬次生代謝產(chǎn)物，在逆境脅迫條件下其含量相對(duì)增高，CK組果皮黃酮含量在第40天時(shí)顯著升高，也恰好說明了這一點(diǎn)，但此時(shí)其果皮纖維結(jié)構(gòu)已發(fā)生松散，黃酮含量的增加也有可能是由于黃酮溶出率上升而導(dǎo)致的。

2.4.4 多酚 第1天時(shí)，對(duì)比CK組T1涂膜處理顯著提高了果仁多酚含量（P＜0.001），此時(shí)T2組果仁多酚含量最高，約是CK組的3倍（圖10C）。表明 T1處理在儲(chǔ)藏初期增加果仁多酚含量，而T2組果仁多酚含量顯著提高可能是由于涂膜劑中茶多酚的添加所導(dǎo)致，酚類物質(zhì)在果皮表面積累隨著鮮果自身生理代謝進(jìn)入到果實(shí)內(nèi)部。儲(chǔ)藏初期多酚含量高有利于提高果實(shí)抗菌能力、抑制微生物繁殖，達(dá)到保鮮效果。T1處理可極顯著增加果皮多酚含量（P＜0.001），這對(duì)檳榔鮮果保鮮具有積極意義，而T2組果皮多酚含量在40 d內(nèi)均低于 CK組（圖10D），這可能是由于 T2涂膜對(duì)果皮有保護(hù)作用，導(dǎo)致其不具有較為明顯的抗逆現(xiàn)象，這也間接反映了T2涂膜劑中的酚類物質(zhì)可通過果皮組織滲透進(jìn)入果內(nèi)部，而表面的交聯(lián)殘留對(duì)果皮中酚類物質(zhì)的積累并無顯著促進(jìn)作用。

圖10 不同處理對(duì)鮮果黃酮、多酚含量的影響Fig.10 Effect of different treatments on flavonoid and polyphenol content of fresh betel nut

2.5 不同涂膜處理對(duì)抗氧化能力的影響

T1組內(nèi)果仁和果皮的DPPH自由基清除能力在第5天時(shí)顯著高于另兩組（圖11A，圖11B），表明T1涂膜可有效提高貯藏初期DPPH清除能力。T2涂膜處理反而抑制了果仁的 DPPH清除能力，但就果皮來看，第5天時(shí)T2涂膜可有效提高果皮的DPPH清除力，極顯著高于CK、T1組（P＜0.001）。

圖11 不同處理方式對(duì)鮮果自由基清除率、Fe3+還原力的影響Fig.11 Effect of different treatments on DPPH scavenger power and Fe3+ reducing power of fresh betel nut

在儲(chǔ)藏至第5天時(shí)，T2涂膜處理顯著增加了果仁的Fe3+還原能力，而T1涂膜處理反而抑制了果仁Fe3+還原能力。在儲(chǔ)藏第1天時(shí)，T2組內(nèi)果皮Fe3+還原能力顯著高于CK組、T1組，且在第25天，T1和 T2組果皮的 Fe3+還原能力均顯著高于 CK組，第 40天時(shí)，所有處理組的果皮 Fe3+還原能力均處于較低水平，此時(shí)果皮已基本不具備抗氧化能力（圖11C，圖11D）。

3 討論

傳統(tǒng)的冷藏保鮮技術(shù)是通過降低鮮果代謝能力來達(dá)到延長(zhǎng)保鮮期的目的，但并不適用于檳榔鮮果保鮮。檳榔鮮果作為熱帶果蔬，儲(chǔ)藏溫度普遍高于10℃[25]，否則會(huì)發(fā)生較嚴(yán)重的冷害現(xiàn)象，因此，為達(dá)到預(yù)期保鮮目的，需聯(lián)合其他技術(shù)共同處理。涂膜保鮮是近年來應(yīng)用廣泛、效果明顯的果蔬保鮮方式之一，常見的檳榔鮮果涂膜保鮮劑有茉莉酸甲酯、脫氫乙酸鈉、氯化鈣、6-芐氨基腺嘌呤、甲基硫菌靈、赤霉素、1-甲基環(huán)丙烯、次氯酸鈉、硫化氫、果蠟等等[3-7]。涂膜材料在果蔬內(nèi)外發(fā)揮功效的同時(shí)，其致密透氣、彈性緩沖的網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)還可避免外界脅迫所引起的鮮果機(jī)械損傷，例如在輻照保鮮檳榔鮮果時(shí)，在輻照前對(duì)鮮果進(jìn)行100 mg/L赤霉素、100 mg/L 6-BA、50%果蠟涂膜處理[3,8]，可有效提高鮮果輻照耐受劑量，更好地抑制微生物滋生、降低物質(zhì)成分損耗。

本研究對(duì)比了無菌蒸餾水（CK）、殼聚糖（T1）、殼聚糖-茶多酚-百里香酚（T2）3組涂膜劑對(duì)鮮果的涂膜保鮮效果，提供了一種經(jīng)濟(jì)可行、簡(jiǎn)便高效的檳榔鮮果涂膜保鮮方法：T2處理可使常溫儲(chǔ)藏貨架期僅為 5 d的檳榔鮮果貨架期延長(zhǎng)至35~40 d。其中，涂膜處理對(duì)鮮果的呼吸代謝具有重要的調(diào)控作用，檳榔鮮果在0~20℃儲(chǔ)藏時(shí)，一般在第6天或第13天達(dá)到呼吸高峰[26-27]，本研究中 CK組在第 12天達(dá)到呼吸高峰符合常見規(guī)律，隨后呼吸代謝衰弱，第25天后呼吸代謝基本不再發(fā)生，而T1組呼吸強(qiáng)度在儲(chǔ)藏第25天才達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，表明殼聚糖涂膜可有效延緩鮮果呼吸高峰的出現(xiàn)，并在一定程度上調(diào)節(jié)了果實(shí)自身代謝進(jìn)程。T2組更好地反映了這一點(diǎn)，涂膜 1 d鮮果呼吸強(qiáng)度顯著高于其他處理，隨后逐漸降低，同樣在第 25天時(shí)出現(xiàn)第二次呼吸高峰，表明T2涂膜處理對(duì)鮮果的呼吸代謝產(chǎn)生了較為積極的影響，使其自身生理代謝能力增強(qiáng)、呼吸峰值延遲，這均有利于鮮果品質(zhì)的保持。研究中發(fā)現(xiàn)，在檳榔冷鮮保藏過程中，呼吸強(qiáng)度并非越低越好，通過干預(yù)使得鮮果對(duì)環(huán)境的適應(yīng)力提高，利用鮮果自身代謝機(jī)制調(diào)控每一階段物質(zhì)轉(zhuǎn)化的速率和轉(zhuǎn)化量，例如先應(yīng)激脅迫鮮果產(chǎn)生足量的次生代謝產(chǎn)物從而具備抵御外界病菌入侵的能力后，再轉(zhuǎn)向成熟衰老，反而具有更好的保鮮效果。

綜上，T1處理對(duì)抑制鮮果黃化有較為明顯的效果。而T2處理綜合保鮮效果最佳，增強(qiáng)了儲(chǔ)藏初期鮮果抗氧化能力，顯著抑制了失重率和腐爛率的上升，儲(chǔ)藏至 35 d時(shí)腐爛率僅為8%，并可顯著抑制果仁褐變，并且儲(chǔ)藏25 d后，鮮果的硬度、纖維素和木質(zhì)素含量、多酚氧化酶和葉綠素酶活性均表明 T2涂膜處理可穩(wěn)定維持鮮果的生理代謝能力，使得25 d后鮮果仍具有較好的生理活性、呼吸高峰延后，保鮮效果顯著優(yōu)于單獨(dú)冷藏的對(duì)照組。因此，殼聚糖聯(lián)合酚類涂膜處理可作為一種多功能、高效、價(jià)廉的檳榔鮮果保鮮方式，而本研究中鮮果對(duì)涂膜劑的吸收滲透代謝機(jī)制仍有待探索。