陳思遠，蕭建斌，蘇經遷

（1.福建師范大學生命科學學院 福建師范大學南方海洋研究院，福建 福州 350117；2.福建師范大學南方生物醫(yī)學研究中心 福建省天然免疫生物學重點實驗室，福建 福州 350013）

鮑魚是一種具有重要經濟意義的海洋軟體動物，其漁業(yè)和加工產業(yè)在全球20個國家成為支柱產業(yè)[1]。鮑魚的經濟效益在福建省的水產養(yǎng)殖種類產值中排第一位[2]。目前，鮑魚養(yǎng)殖產業(yè)的興起推動了相關行業(yè)的蓬勃發(fā)展，并創(chuàng)造了巨大的生態(tài)效益和經濟效益，但大量廢棄的鮑魚內臟帶來新一輪的問題[3]。

鮑內臟多糖提取物（abalone viscera polysaccharides extract，AVPE）是通過蛋白酶酶解和超濾技術從鮑魚內臟中分離提取出來的一類大分子活性物質[4]。研究表明AVPE富含的多糖、礦物質和脂質等多種營養(yǎng)物質具有抗氧化和增強免疫力等生物學作用[5]，在生物體內發(fā)揮多種生物功能和活性作用，如免疫調控、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等[6-8]，但對其在生物體內是否能夠激活特異免疫功能，是否產生慢性或急性毒性還未明確。因此，本研究以C57BL/6小鼠為試驗對象，通過對AVPE的免疫功能活性和毒性進行探究和驗證，為鮑魚副產物的多方面利用提供佐證。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鮑內臟多糖提取物（AVPE）由福建省水產研究所提供，其中多糖含量為58%；豬苓多糖購于上海源葉生物科技有限公司；刀豆蛋白（ConA）購買于美國適馬（Sigma）公司；綿羊紅細胞（SRBC）、HBSS、DMSO溶液購于北京索萊寶（Solarbio）公司；豚鼠血清（Guinea Pig Serum）購于北京博爾西（Bersee）公司；二硝基氟苯（DNFB）購于上海麥克林（Macklin）公司；復方環(huán)磷酰胺片（Compound Cyclohosphamide Tablets）購于通化茂祥制藥有限公司。其余藥品均為國產分析純。

Countstar BioTech （IC1000），上海睿鈺生物科技有限公司；INFIINITE 200 PRO酶標儀，瑞士帝肯（Tecan）公司；MCO-170AICDL-PC二氧化碳培養(yǎng)箱，日本松下（Panasonic）公司；AVANTIJ-26SXP高速冷凍離心機，美國貝克曼（Beckman）公司。

1.2 實驗動物

C57BL/6 小鼠，雌雄比例對半，體重21～25g，均由福建師范大學實驗動物中心飼養(yǎng)；自由攝水、采食。

1.3 實驗動物分組、造模及給藥

實驗開始對每只小鼠稱重，將小鼠雌雄各3只分成空白對照組（C），陽性藥物組（PC），AVPE低劑量組（LD），AVPE中劑量組（MD），AVPE高劑量組（HD）。LD、MD和HD組分別用AVPE（20、40、80 mg/kg·d）進行灌胃，PC組為豬苓多糖（40 mg/kg·d），C組為同等劑量生理鹽水。藥品由生理鹽水配制，每隔24 h灌胃給藥1次，每只劑量為0.1 mL，自由攝水、采食。

2 實驗方法

2.1 AVPE 對小鼠體重和臟體比的影響

觀察實驗期間動物的一般表現(xiàn)及形態(tài)，并在AVPE各組小鼠實驗結束前記錄體重及其增量。取各組小鼠，禁食15 h前灌胃給藥1次，記錄體質量后，頸椎脫臼處死；取其五臟為心、肝、脾、肺、腎，記錄質量并計算臟器系數(shù)（臟體指數(shù)=器官質量/體質量×100%）。

2.2 ConA 誘導的小鼠脾淋巴細胞增殖

參考王璐等[9]的方案在最后一次給藥12 h后，取各組小鼠脾臟于HBSS中，研碎，制成細胞懸液。取培養(yǎng)板放入細胞懸液，加入ConA液（10 μg/mL），放入37 ℃培養(yǎng)箱中72 h。每孔取0.8 mL培養(yǎng)液和1 mL DMSO到96孔培養(yǎng)板中，OD值由酶標儀（570 nm）測定。

式中：A——淋巴細胞增殖能力；OD1——ConA孔中OD值；OD2——對照孔的OD值。

2.3 DFNB 誘導小鼠遲發(fā)性超敏反應（DTH）

各組小鼠腹部位置進行毛發(fā)脫落，根據(jù)姚滿林等[10]的方案，用50μL的1%DNFB試劑擦拭致敏2 d。在第五天用10μL的DNFB溶液擦拭于各組小鼠右耳（兩面），經過1 d的刺激，頸椎脫臼處死小鼠，取下左右耳殼直徑8 mm的耳片過磅。遲發(fā)性超敏反應（Delayed Type Hypersensitivity，DTH）以左右耳重量之差表示。

2.4 抗體生成細胞

參考趙慶楓等[11]的方案，每組小鼠灌胃55 d，腹腔注射0.2 mL SRBC，連續(xù)注射5 d。將脾臟細胞懸液0.1 mL放于0.3 mL豚鼠血清和0.3 mL 10% SRBC混懸液中混合。離心5 min，取上清于96孔板中，用酶標儀（540 nm）測定抗體生成細胞含量的OD值。

2.5 血清溶血素水平

各分組小鼠連續(xù)灌胃55 d，再連續(xù)腹腔注射5 d的0.2 mLSRBC。根據(jù)朱艷等[12]的方案，對眼球取血，離心收集血清。設置加0.2 mL10% RBC實驗組在200μL稀釋血清中和200μL生理鹽水的對照組；溫浴后，測定SRBC半數(shù)溶血的OD值（540 nm）。用HC50表示血清溶血素的水平，按下式計算：

2.6 急性毒性試驗

根據(jù)景慕嫻等[13]的方案，對小鼠禁食16 h，不禁水。對正常AVPE組與生理鹽水對照組均灌胃給藥，為0.1 mL 2000 mg/kg的AVPE。14 d內記錄小鼠表現(xiàn)及死亡數(shù)。

2.7 骨髓微核率

參考王波[14]的方案，對各組小鼠連續(xù)兩天灌胃給藥。其中，PC組給予 40 mg/kg環(huán)磷酰胺，C組給予生理鹽水，供試組為AVPE組。給藥 6 h后，頸部脫臼處死小鼠，用小牛血清對股骨骨髓制片固定并染色。用顯微鏡記錄每只小鼠1200個嗜多染紅細胞（PCE），計算出微核率和PCE/RBC值。

2.8 精子畸變率

對照彭曉明等[15]的方法，每組取6只25～30 g性成熟雄性小鼠，環(huán)磷酰胺（40 mg/kg）為PC組，C組給予生理鹽水，供試組為AVPE組。小鼠連續(xù)5 d灌胃，隔30 d后脫頸處死，取小鼠左右兩側附睪尾制片和染色，統(tǒng)計精子畸變發(fā)生率。

2.9 統(tǒng)計學分析

兩組間比較用t檢驗，由Graphpad prism 9.0和Adobe Illustrator軟件繪圖。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義（*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；****，P＜0.0001）。

3 實驗結果

3.1 AVPE 對小鼠臟器比重的影響

臟器系數(shù)增大或減小，可表明動物是否染毒。由圖1可以看出，AVPE各劑量組小鼠的心、肝、脾、肺、腎的臟比重均與C組相似，不具有差異顯著性（P＜0.05）。初步表明鮑多糖對小鼠的心、肝、脾、肺、腎臟器體重比值無影響。

圖1 AVPE對小鼠臟器比重的影響

3.2 AVPE 對小鼠體重的影響

由圖2可知，不同劑量的AVPE與C組相比，小鼠體重在28d持續(xù)灌胃中保持穩(wěn)定，對小鼠體重的變化無顯著變化。試驗結果表明AVPE對小鼠體重變化無影響。

圖2 AVPE對小鼠體重的影響

3.3 AVPE 對脾淋巴細胞增殖能力的影響

淋巴細胞在免疫系統(tǒng)中扮演著免疫識別的角色，可通過刀豆蛋白（conA）和植物血球凝集素來誘導[16]。結果如圖3所示，C組的淋巴細胞增殖能力OD值為0.094，三組不同劑量AVPE（20、40、80 mg/kg/d）的OD值分別為0.081、0.080、0.087，與C組相比無差異顯著性（P＞0.05）。實驗結果表明口服AVPE對小鼠脾淋巴細胞增殖能力無顯著影響。

圖3 AVPE對小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響

3.4 鮑多糖對DNFB誘導小鼠DTH的影響

小鼠耳腫脹模型是非特異性炎癥模型，可以通過腫脹程度判斷受試反應[17]。通過對比圖4的結果發(fā)現(xiàn)，與C組相比，LD、MD、HD組的耳腫脹程度無顯著差異性（P＞0.05）；實驗結果表明AVPE對小鼠細胞免疫功能無顯著影響。

圖4 AVPE對DNFB誘導小鼠DTH的影響

3.5 AVPE 對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響

特異性抗體細胞生成的數(shù)量反應了體液免疫的水平[18]。結果如圖5所示，PC組的抗體生成細胞數(shù)比C組小鼠略有上升，但無顯著差異性（P＞0.05）。不同劑量的AVPE組對抗體生成細胞數(shù)無顯著影響（P＞0.05）。實驗結果表明AVPE對小鼠抗體生成細胞的增殖無顯著影響。

圖5 AVPE對小鼠抗體生成細胞數(shù)的影響

3.6 AVPE 對小鼠血清溶血素的影響

SRBC 與相應抗體結合，可導致紅細胞溶解，從而統(tǒng)計血紅蛋白的數(shù)量得知抗體產生的水平[19]。結果如圖6所示，LD、MD、HD組溶血素表達量分別為647、647、697，與C組（624）相比無顯著性變化（P＞0.05），表明AVPE對小鼠血清溶血素的表達無顯著影響。

圖6 AVPE對小鼠血清溶血素的影響

3.7 AVPE 的急性毒性試驗

為評價AVPE的安全，試驗通過對各組小鼠單次灌胃2000 mg/kg的AVPE，觀察試驗小鼠出現(xiàn)的中毒數(shù)量、體重變化及死亡情況，評價受試藥物毒性作用的性質[20]。結果如表1所示，在試驗期間，各組小鼠飲食和活動均正常，未有死亡狀況。

表1 鮑多糖的急性毒性試驗結果

3.8 AVPE 對小鼠骨髓微核率和PcE／RBc的比值的影響

微核是細胞受到外界刺激導致染色體斷裂或紡錘絲受損，而形成異常結構[21]。結果如圖7所示，LD、MD、HD組的微核率分別為0.162%、0.140%、0.114%，PC組的微核率為0.763%，C組的微核率為0.126%。PC組與C組比較有顯著增加（P＜0.0001），AVPE組與C組相比無顯著性差異（P＞0.05）。實驗結果表明AVPE對小鼠骨髓微核率無顯著影響。

圖7 AVPE對小鼠骨髓微核率的影響

骨髓細胞PcE/RBc的比值可以判斷藥物對骨髓細胞的毒性作用[22]。結果如圖8所示，LD、MD和HD組的PcE/RBc比值分別為13.086%、12.424%和12.764%，PC組的平均PcE/RBc比值為10.998%，C組的微核率為12.658%。PC組與C組比較有顯著減少（P＜0.001），AVPE組與C組相比無顯著變化（P＞0.05）。實驗結果表明AVPE對小鼠骨髓細胞PcE/RBc比值無顯著影響。

圖8 AVPE對小鼠骨髓細胞PCE/RBC的影響

3.9 鮑多糖對小鼠精子畸變率的影響

精子畸形是精子基因發(fā)生突變的結果[23]。如圖9所示，與C相比，LD、MD、HD組的精子畸變率無顯著差異（P＞0.05），PC組的精子畸形率有顯著提高（P＜0.0001）。實驗結果表明AVPE對雄性小鼠精子畸形率無顯著影響。

圖9 AVPE對小鼠精子畸變率的影響

4 討論

本文通過對各組小鼠給予適當劑量AVPE，探究了AVPE對小鼠免疫功能的調節(jié)作用。結果表明AVPE對小鼠細胞免疫和體液免疫無顯著效果，同時對小鼠的質量、臟器指數(shù)無顯著影響。在毒性經口方面，給予高劑量AVPE灌胃小鼠，未表現(xiàn)異常癥狀，初步說明在劑量低于2000 mg/kg的AVPE具有較高的食用安全性，不會對受試動物產生突變作用和生殖毒性。

綜上所述，AVPE未表現(xiàn)出明顯的免疫調節(jié)作用，研究采用各濃度的AVPE不產生慢性或急性毒性。AVPE作為鮑魚副產物如能有效利用研發(fā)出新型產品，不僅可以開拓鮑魚內臟市場，還可以解決環(huán)境污染問題。本研究為鮑魚副產物的加工利用提供科學依據(jù)和多種出路。