張 穎 任巧麗 趙瑞秋 許紅梅 龍曉茹

國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學研究中心 兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室 兒童感染免疫重慶市重點實驗室 重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院感染科（重慶 400014）

結核病仍是危害人類健康的感染性疾病[1]。據(jù)估計，2020年全球有990萬人患有結核病，相當于每10 萬人口中有127 例，其中11.0%為兒童[2]。2009年至2015 年中國大陸31 個省份上報至國家疾病控制中心的肺結核中，0～14 歲兒童平均每年發(fā)病率為十萬分之2.4，西部地區(qū)發(fā)病率最高[3]。兒童肺結核臨床表現(xiàn)不典型，病原學陽性率低，易延誤診治[4]。雖然兒童耐多藥結核?。╩ultidrug resistant tuberculosis，MDR-TB）通常比成人有更好的治療效果（兒童治愈率78.0 %，成人為50.0 %），但不足5.0 %的兒童接受了適當?shù)闹委焄5]。因此，盡早明確兒童感染結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）的耐藥譜，選擇合適治療方案，提高治療成功率，有利于兒童結核病的防控。本研究對比比例法、微孔板法和全基因組測序（whole genome sequencing，WGS）3 種方法用于異煙肼（isoniazid，INH）、利福平（rifampicin，RFP）、乙胺丁醇（ethambutol，EMB）和鏈霉素（streptomycin，SM）4種兒童常用抗結核藥物耐藥性檢測的檢驗效能。

1 材料與方法

1.1 材料收集

選取2015 年10 月至2020 年9 月在重慶醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院感染科化驗室送檢標本中分枝桿菌培養(yǎng)陽性的保存菌株87株，使用接種環(huán)接種到中性羅氏培養(yǎng)基上置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～8周，共復蘇成功61株。

調(diào)取對應患兒的治療方案與治療結局，其中治療結局根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2021年最新的結核病的治療結局定義分為治療成功組和治療失敗或死亡組[6]。

1.2 方法

1.2.1 表型藥物敏感性試驗 對所有成功復蘇菌株分別采用比例法和微孔板法（試劑盒均購自珠海銀科生物科技有限公司）行表型藥物敏感性試驗（drug susceptibility test，DST）及菌株鑒定。挑取羅氏固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的分枝桿菌菌落，移到含0.5 %吐溫80 的生理鹽水試管中，使用細菌超聲分散儀（購自廣東體必康生物科技有限公司）分散菌落，配成1 mg/mL 的菌懸液。比例法DST：根據(jù)《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》[7]，比濁后的菌懸液，在樣本稀釋瓶中利用含0.5 %吐溫80的生理鹽水，把菌懸液稀釋到10-2mg/mL 和10-4mg/mL。采用標準接種環(huán)取0.01 mL，將兩種濃度菌懸液分別接種到對照培養(yǎng)基及含藥的羅氏培養(yǎng)基表面。置于斜面處37 ℃培養(yǎng)，松開蓋子，培養(yǎng)24～48 h 后，旋緊蓋子繼續(xù)培養(yǎng)4～6 周。當對照中性羅氏培養(yǎng)基的菌體生長良好后，比較含藥培養(yǎng)基和對照培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，計算耐藥百分比，耐藥百分比＞1 %報告耐藥，否則為敏感。含藥羅氏培養(yǎng)基的RFP 濃度為40 μg/mL，INH 為0.2 μg/mL，EMB 為2 μg/mL，SM 為4 μg/mL[7]。使用含0.005 mg/mL 的噻吩-2-羧酸肼（thiophene-2-carboxylic acid hydrazine，TCH）和0.5mg/mL的對硝基苯甲酸（P-nitrobenzoic acid，PNB）進行菌株鑒定，區(qū)分非結核分支桿菌和牛分枝桿菌。TCH 生長為結核分枝桿菌復合群和非結核分支桿菌，TCH 未生長為牛分枝桿菌；PNB 生長陽性提示非結核分枝桿菌，PNB 未生長提示結核分枝桿菌復合群和牛分枝桿菌。微孔板法DST：按照產(chǎn)品使用操作說明書，將無菌稀釋液全部加入凍干雜菌抑制劑混勻，使用移液器取100 μL加入米氏7H9液體培養(yǎng)基混勻后，取200 μL加入C1、D1陰性對照孔，180 μL分別加入A1、B1陽性對照孔。100 μL濃度為1 mg/mL的菌懸液加入液體培養(yǎng)基中混勻，取200 μL 分別加入含濃度為0.2、0.4、0.8和1.6 μg/mL的含INH孔，0.25、0.5、1 和2 μg/mL 含RFP 孔，2.5、5、10 和20 μg/mL 的含EMB 孔，1、2、4 和8 μg/mL 的含SM 孔。另吸取20 μL 加入A 1 對照孔，制成1/10 陽性對照孔，在A1中吸取20 μL加入B1孔，為1/100陽性對照孔。置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，在10～21 d 根據(jù)陽性對照孔菌落直徑情況進行結果判讀。記錄最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）值，MIC 定義為與菌落生長半徑小于1/10 陽性對照孔的最低濃度。耐藥表示MIC 值大于臨界濃度，敏感為MIC 小于或等于臨界濃度。INH 的臨界濃度為0.2 μg/mL，RFP 為1 μg/mL，EMB 為5 μg/mL，SM為2 μg/mL[7]。

1.2.2 全基因組測序（WGS）用接種環(huán)從分離培養(yǎng)好的羅氏固體培養(yǎng)基上刮下綠豆大小的菌體，放入含500 μL TE緩沖液的離心管中，置80 ℃水浴30 min滅菌，干冰寄送至上海晶諾生物科技有限公司行基因組提取、質控、建庫，使用Illumina 平臺行全基因組測序，測序結果和H 37 Rv 標準菌株比對，行變異位點分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（M）和四分位數(shù)（P25～P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2或Fisher精確概率法檢驗。以比例法為金標準，計算微孔板法和WGS對INH、RFP、EMB、SM耐藥預測的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、符合率及Kappa值；其中Kappa值0～0.2提示無一致性，0.21～0.39為具有較低的一致性，0.40～0.59 為一致性較弱，0.60～0.79為中等一致性，0.80～0.90為高度一致性，＞0.90 為幾乎完全一致[8]。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 藥物敏感性試驗結果

經(jīng)鑒定，61株菌株均為MTB菌株。比例法DST結果中共有48株（78.7%）對4種藥物均敏感，13株（21.3%）對至少1 種藥物耐藥，對4 種藥物共同耐藥的3株（4.9%）；共有耐INH的11株（18.0%），耐RFP的7株（11.5%），耐EMB的5株（8.2%），耐SM的10株（16.4%），7株（11.5%）為多藥耐藥（MDR）。見圖1A。

微孔板法中，44株（72.1%）對4種藥物均敏感。2株（3.3%）EMB的MIC值為5.0 μg/mL，余59株為2.5 μg/mL，均為EMB 敏感菌株。46 株（75.4 %）INH 的MIC 值為0.2 μg/mL，4 株（6.6 %）為1.6 μg/mL，11 株（18.0 %）＞1.6 μg/mL，共計15株（24.6 %）為耐INH菌株。50株（82.0 %）RFP的MIC 值為0.3 μg/mL，4 株（6.6 %）為0.5 μg/mL，7 株（11.5 %）＞2.0 μg/mL 為耐RFP 菌株。52 株（85.2 %）SM的MIC值為1.0 μg/mL，1株（1.6 %）為4.0 μg/mL，2株（3.3%）為8.0 μg/mL，6株（9.8 %）＞8.0 μg/mL，共計耐SM 的菌株為9 株（14.7 %）。見圖1B。

圖1 比例法、微孔板法和WGS 鑒定61 株結核分枝桿菌耐藥結果分布

在WGS中，全敏感菌株46株（75.4 %），對4種藥物共同耐藥的4 株（6.6 %）；共有耐INH 的13 株（21.3 %），耐RFP的8株（13.1 %），耐EMB的6株（9.8 %），耐SM的9株（14.7 %），見圖1C。

2.2 三種方法耐藥結果一致性檢驗

以比例法DST為金標準，微孔板法檢驗INH耐藥性的敏感度、特異度和Kappa 值分別為100 %、92.0 %和0.81，RFP分別為85.7 %、98.2 %和0.84，EMB分別為0 %、10 0%和0.00，SM分別為80.0 %、98.0 %和0.81，符合率為91.8 %～96.7 %；WGS檢驗INH 耐藥性的敏感度、特異度和Kappa 值分別為90.9 %、94.0 %和0.79，RFP的分別為100.0 %、98.2 %和0.92，EMB的分別為60.0 %、94.6 %和0.50，SM的分別為80.0 %、98.0 %和0.81，符合率為91.8 %～98.4 %。見表1。

表1 微孔板法和WGS對四種一線抗結核藥物耐藥性檢測的診斷價值分析

2.3 抗結核藥物耐藥相關基因變異位點在耐藥和敏感菌株間分布

比例法的11 株INH 耐藥菌株中，有1 株包含2個INH耐藥位點，fabG1-15C＞T和inhAIle194Thr。katG基因Ser 140 Asn 變異位點僅分布在ING 敏感的菌株，而Ser 315 Thr 在耐藥和敏感菌株中分別有9 和2 株，分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在15株MIC 值≥1.6 μg/mL 的菌株中，有13 株經(jīng)WGS發(fā)現(xiàn)耐INH相關基因變異，僅katGSer315Thr在兩種不同MIC 值菌株間的分布差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 INH耐藥相關基因變異位點在比例法和微孔板法中鑒定為不同耐藥性菌株分布[n (%)]

7 株經(jīng)比例法DST 鑒定為RFP 的耐藥菌株中，經(jīng)WGS 鑒定出的5 個rpoB基因中僅His 445 Leu 位于RFP 敏感菌株中，該位點在兩組間的分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在微孔板法MIC 值＞2.0 μg/mL的7株菌株中，共有分別存在rpoB基因Ser 450 Leu（n=4）、His 445 Asp（n=1）、His 445 Leu（n=1）和His445Tyr（n=1）4個不同的變異位點。而rpoBHis445Asn存在于MIC為0.5μg/mL的1株菌株中。僅Ser450Leu位點在不同MIC值的菌株中的分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 RFP耐藥相關基因變異位點在比例法和微孔板法中鑒定為不同耐藥性菌株分布[n (%)]

在5株經(jīng)比例法鑒定為EMB耐藥的菌株中，有3 株分別包含embB基因Gln 497 Arg、Met 306 Ile 和Met 306 Val 位點，而在敏感菌株中有3 株分別包括Ala356Val、Gly406Ser和Met306Val位點，各位點的分布差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。微孔板法中，2株MIC值為5.0 μg/mL的菌株均存在Met306Val位點，不同MIC 值菌株之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見表4。

表4 EMB耐藥相關基因變異位點在比例法和微孔板法中鑒定為不同耐藥性菌株分布[n (%)]

在10 株經(jīng)比例法鑒定為SM 耐藥菌株的8 株分別存在rpsL基因Lys43Arg（n=6）和Lys88Arg（n=1）位點以及rrs基因514a＞c位點（n=1）；而在51株SM敏感菌株中，僅有1 株存在rpsL基因Lys 43 Arg 變異位點，該位點在兩組中的分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在8 株MIC ≥8 μg/mL 的菌株中，有rpsLLys43Arg（n=7）和rrs514a＞c（n=1）的耐藥相關變異位點。在1株MIC為4.0μg/mL的菌株中存在rpsLLys88Arg變異。rpsL基因Lys43Arg和Lys 88 Arg 變異位點在不同MIC 值菌株中的分布差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表5。

表5 SM耐藥相關基因變異位點在比例法和微孔板法中鑒定為不同耐藥性菌株分布[n (%)]

2.4 治療結局與抗結核藥物的耐藥屬性相關性

菌株對應61 例患兒均接受抗結核治療，其中6例（9.8%）治療失敗或死亡，其余55例（90.2%）治療成功。治療成功組和治療失敗或死亡組采用3 種方法鑒定出的4種抗結核藥物的耐藥屬性差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表6。

表6 結核病患兒61例不同治療結局的菌株耐藥屬性分布[n (%)]

3 討論

目前，MTB耐藥性檢測仍以比例法和BACTEC分枝桿菌生長指示管960 系統(tǒng)為金標準。而比例法DST 檢測時間長達4～8周，BECTEC儀器設備造價較高，且表型DST 由于生物安全問題，均不適用于結核病發(fā)病率較低的發(fā)展中地區(qū)使用。微孔板法DST為改良的液體培養(yǎng)法，其操作便捷，觀察結果時間較短，并可明確藥物的MIC 值，已逐漸應用于臨床。隨著分子生物學技術的發(fā)展，二代測序技術逐漸成熟且價格明顯降低，WGS 可用于MTB 的菌種鑒定、耐藥預測、異質性耐藥及菌群傳播的研究[8]，已漸從科研走向臨床應用。而本研究為WGS和微孔板法的兒童感染的MTB 耐藥性檢測的臨床應用提供了基礎數(shù)據(jù)。

本研究以比例法DST 為金標準，WGS 檢驗對INH 和RFP 耐藥性診斷的敏感度和特異度處于90.9%～100%，與既往研究結果相近[9]。在一項總結了20項研究的綜述中，WGS對RFP耐藥性檢驗的敏感度與特異度分別為98.0 %（95 %CI：93.0 %～98.0 %）和98.0 %（95 %CI：98.0 %～100.0 %），而INH 分別為97.0 %（95 %CI：94.0 %～99.0 %）和93.0 %（95 %CI：91.0 %～96.0 %）[9]。在近期同類研究中，與表型DST 相比，WGS 檢測RFP、INH、EMB 和SM 耐藥的敏感度與特異度分別為96.7 %和98.6 %、75.5 %和97.1 %、93.1 %和93.7 %、68.6 %和99.6 %[10]。除了EMB外，其余3種藥物的檢測結果與本研究均較為接近，提示W(wǎng)GS 對檢測INH、RFP和SM的耐藥性與比例法DST具有高度的一致性。

本研究的微孔板法檢驗結果，除EMB外，INH、RFP和SM的敏感度與特異度處于80.0%～100.0%，與比例法DST 具有高度的一致性，與同類研究中RFP敏感度和特異度分別為97.1%、100.0%的結果較一致[11]。類似研究中的INH、RFP和SM的敏感度、特異度和Kappa 值分別為93.9%、98.8%和0.94，93.8%、99.6%和0.95，88.7%、100%和0.93[12]，與本研究結果相近。因此，微孔板法檢測RFP、INH和SM的耐藥性均與比例法具有高度一致性。

為探索3 種檢測耐藥方法存在差異的原因，本研究分析了4 種藥物耐藥相關基因變異位點在2 種表型DST 鑒定為敏感和耐藥的菌株中的分布差異。MDR-TB的出現(xiàn)是在INH耐藥的基礎上增加了RFP耐藥，因此更應關注MTB的INH耐藥相關變異[13]。本研究中，比例法DST鑒定為INH敏感的菌株而在微孔板法或WGS 中鑒定為耐藥的菌株分別有4 株和3株，分別存在katG基因Ser315Thr和Ser140Asn變異位點。既往已證實katG基因Ser315Thr變異位點與INH 高水平耐藥相關[14]。在本研究中，包含該變異位點菌株INH 的MIC 值均≥1.6 μg/mL，再次證實該位點與INH耐藥相關。而含Ser140Asn變異位點的菌株MIC 值為1.6 μg/mL，且本研究中變異率較低，在比例法中鑒定為INH 敏感菌株。而在相關研究中發(fā)現(xiàn)106 株耐INH 的菌株中僅有1 株存在katGSer140 Asn和Ala139Pro 共同變異[10]。因此，該位點是否與耐藥有關仍需更多研究驗證。

雖然與其他抗結核藥物相比，RFP 耐藥相關基因變異不易出現(xiàn)，但由于RFP廣泛用于抗結核治療，耐藥率正逐年上升[15]。超過95.0%的RFP 耐藥相關變異集中在編碼RNA聚合酶的β亞單位的rpoB基因上[16]。多數(shù)存在于81 bp 的426～452 位（大腸桿菌編碼507～533位）氨基酸的RFP耐藥決定區(qū)域（rifampicin resistance determining region，RRDR），其中90.0%位于435、445 和450 位點，且均為RFP 高水平耐藥相關的基因變異位點[17]。本研究中耐RFP菌株的rpoB基因變異位點集中在445（50.0 %）和450（50.0 %）位點上，均處于RRDR，多數(shù)菌株的MIC值大于2.0 μg/mL，進一步證實該位點與高水平RFP耐藥相關。相關研究使用基因芯片技術檢測MDRTB時，發(fā)現(xiàn)耐RFP變異位點集中在445（16.7 %）和450（63.3 %）位點上，且替換氨基酸與本研究一致[16]。因此，考慮在本研究中3 種方法存在差異原因可能與本研究使用的為復蘇菌株，表型DST可能表現(xiàn)不穩(wěn)定有關。

隨著新型抗結核藥物的出現(xiàn)，SM 已較少用于兒童結核病的治療。在既往研究中，存在rpsL基因Lys43Arg突變位點的MTB菌株SM的MIC值均大于32 μg/mL，考慮該位點與SM耐藥相關[18]。而本研究中，比例法鑒定為SM敏感而WGS鑒定為耐藥的1株MTB菌株中僅存在該耐藥位點，考慮可能與表型DST表現(xiàn)不穩(wěn)定有關。

本研究中，WGS 和微孔板法檢測EMB 耐藥性的結果與比例法DST 一致性較差，考慮與表型DST 中EMB 的錯誤率較高有關。表型DST 是MTB耐藥性檢測的金標準，該觀點會混淆耐藥基因突變位點的識別，尤其是EMB，據(jù)報道表型DST 中EMB耐藥性檢測的錯誤率較高[19]。而本研究中，微孔板法中未鑒定出EMB 耐藥菌株，可能本研究使用耗材的EMB 的MIC 值低于WHO 的界定值。約50.0%～70.0%的EMB 耐藥的MTB 分離株存在embB基因306～497 位密碼子的基因變異[20]。已證實306、406 和497 位密碼子變異可導致低水平和中等水平的EMB耐藥[21]。在泰國的一項篩查EMB耐藥的MTB臨床分離株embB變異分布的研究中發(fā)現(xiàn)，306位密碼子存在氨基酸錯義變異的概率為50.6%，其中含有Met306Val變異的菌株占44.1%[22]。本研究中，在3株經(jīng)比例法DST鑒定為EMB敏感而WGS耐藥的菌株中分別含有Met 306 Val、Gly 406 Ser 和Ala356Val變異位點。僅Ala356Val的功能不詳，在EMB耐藥菌株中的報道罕見，功能仍待驗證。

本研究中菌株對應的61例患兒治療結局與3種方法鑒定的耐藥和敏感菌株分布的相關性分析發(fā)現(xiàn)，差異均無統(tǒng)計學意義，提示治療結局與患兒感染的MTB對4種藥物是否耐藥無關。有研究發(fā)現(xiàn)與MDR-TB不良治療結局相關的獨立風險因素包括高水平莫西沙星耐藥、環(huán)絲氨酸耐藥、導致高水平氟喹諾酮耐藥性的變異和ethA變異，與EMB耐藥及相關基因變異無關[23]。但本研究結果也可能存在偏倚，與樣本量偏少，耐藥菌株比例偏小有關。

綜上所述，本次研究仍存在樣本量偏小，DST使用菌株為復蘇菌株而非臨床分離株等不足。本研究證實微孔板法和WGS 檢測INH、RFP 和SM 耐藥的效果與比例法DST 高度一致，可應用于臨床。而EMB的耐藥性檢測可結合比例法DST和WGS結果綜合判斷。