韓連書

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院 上海市兒科醫(yī)學研究所 兒內(nèi)分泌遺傳代謝科（上海 200092）

罕見病種類繁多，包括各種器官畸形、綜合征及功能缺陷疾病。遺傳代謝?。╥nherited metabolic disease，IMD）又稱先天性代謝異常（inborn errors of metabolism,IEM），屬于功能缺陷型罕見病，是由于基因變異引起維持正常代謝所必需的酶、受體、載體等蛋白功能缺陷，導致中間或旁路代謝產(chǎn)物蓄積或終末代謝產(chǎn)物缺乏，引起一系列臨床癥狀的一類單基因遺傳病[1]。大部分IMD屬于常染色體隱性遺傳，總體發(fā)病率約1/5000～1/1400[2]。IMD臨床表現(xiàn)復雜，缺乏特異性，全身各器官均可受累。其分類方式多樣，如根據(jù)代謝物可分為氨基酸代謝異常、碳水化合物代謝異常、脂肪酸氧化障礙、尿素循環(huán)障礙、有機酸代謝異常、維生素代謝異常及金屬元素代謝障礙等[3]；根據(jù)受累的細胞器可分為溶酶體病、線粒體病及過氧化物酶體病等。IMD 種類繁多，涉及體內(nèi)代謝途徑廣泛，病因復雜，其確診和分型依賴各種檢測。常規(guī)生化檢測如血常規(guī)、尿常規(guī)、血糖、肝功能、腎功能、電解質(zhì)、血氣分析、血氨、乳酸及肌酸激酶等項目出現(xiàn)異常，不能確定某種疾病，但可為IMD的診斷提供線索，判斷病情程度。如血肌酸激酶增高，則需要鑒別是否為脂肪酸氧化代謝病、肌營養(yǎng)不良及甘油酸激酶缺乏癥等。

1 特殊生化檢測技術

1.1 免疫熒光檢測技術

免疫熒光檢測技術包含化學發(fā)光免疫分析法和放射免疫分析法。其中化學發(fā)光免疫分析法廣泛用于新生兒篩查中促甲狀腺素、17-羥孕酮、苯丙氨酸、葡萄糖6-磷酸脫氫酶檢測。該技術還可通過在外周血白細胞或羊水細胞加入底物，計算產(chǎn)物與底物的比值得出酶活性，作為診斷溶酶體貯積病的金標準，如戈謝病需檢測β-葡糖苷酶活性、法布累病應檢測α-半乳糖苷酶活性、尼曼皮克病需檢測酸性鞘磷脂酶活性，且酶活性檢測是黏多糖貯積病分型的重要依據(jù)[2]?，F(xiàn)已有部分地區(qū)開始利用此技術進行新生兒溶酶體疾病的篩查[4]。另外該技術也廣泛應用于四氫生物蝶呤還原酶缺乏癥、生物素酶缺乏癥及酮氧化酶缺乏癥等疾病的診斷。

1.2 串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術

串聯(lián)質(zhì)譜技術(tandem mass spectrometry,MS/MS)因其特異性高、同時準確區(qū)分及定量多種代謝物等特點，可用于遺傳代謝病的篩查、診斷及治療隨訪檢測。該技術通過檢測濾紙干血斑中氨基酸、?；鈮A、同型半胱氨酸及不同類型類固醇激素等物質(zhì)的質(zhì)荷比（質(zhì)量數(shù)/所帶電荷數(shù)）對其進行定性及定量分析[5]，其優(yōu)點在于檢測方法快速、特異性強，可在2～3 分鐘內(nèi)對1 個3 mm 濾紙干血斑中幾十種代謝產(chǎn)物進行分析，對多種氨基酸、有機酸、脂肪酸氧化代謝紊亂的疾病及類固醇激素相關代謝病進行新生兒篩查、臨床患者的診斷及鑒別診斷。該項技術除了可實現(xiàn)一個血斑一次實驗檢測多種疾病[6]，并可設置相關氨基酸及?；鈮A間的比值，進一步降低檢測的假陽性率和假陰性率。1990年美國Millintong 等[5]首次將此技術用于IMD 的檢測。2002 年上海新華醫(yī)院率先將其應用于新生兒疾病篩查及臨床患者檢測[7]，目前串聯(lián)質(zhì)譜技術已廣泛用于新生兒氨基酸代謝障礙、有機酸血癥、脂肪酸氧化代謝障礙、先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥、溶酶體疾病及X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良的篩查[8-11]，并形成了新生兒疾病串聯(lián)質(zhì)譜篩查技術專家共識[12]。

1.2.1 血氨基酸譜檢測 氨基酸水平測定是診斷IMD 的重要方法，尤其是與氨基酸代謝障礙相關。但血液中氨基酸水平受諸多因素影響，包括年齡、營養(yǎng)狀況、生理變化、疾病及治療情況等，因此氨基酸結果分析應結合臨床進行綜合評估。部分氨基酸代謝病患者尿中特異的有機酸可增高，因此血中某些氨基酸增高結合其相應的尿有機酸增高更有助于診斷。如酪氨酸血癥不僅血酪氨酸、酪氨酸與苯丙氨酸比值增高，同時尿4-羥基苯乳酸和4-羥基苯丙酮酸也可增高。

1.2.2 ?；鈮A譜檢測 ?；鈮A是脂肪酸、有機酸代謝的中間產(chǎn)物，多種脂肪酸和有機酸代謝異常均伴有肉堿和?；鈮A的改變。如血游離肉堿降低可提示原發(fā)性肉堿缺乏或繼發(fā)性肉堿缺乏，其水平顯著降低常見于原發(fā)性肉堿缺乏癥；而輕度降低則多繼發(fā)于營養(yǎng)不良、長期素食、反復嘔吐、腹瀉或其他疾病消耗肉堿所致，如有機酸血癥和脂肪酸氧化代謝病等。臨床疑似有機酸血癥或脂肪酸氧化代謝病時首選串聯(lián)質(zhì)譜檢測。另外，串聯(lián)質(zhì)譜檢測羊水?；鈮A水平可用于判斷胎兒是否患有有機酸血癥，故有機酸血癥的產(chǎn)前診斷可利用串聯(lián)質(zhì)譜檢測羊水?；鈮A水平[13]。

1.2.3 類固醇激素譜檢測 目前類固醇激素的測定主要采用各種不同的免疫分析方法，但由于各種類固醇激素在體內(nèi)水平極低，一般檢測水平在nmol/L或pmol/L 數(shù)量級，上述方法雖能達到一定準確度，但仍存在不同激素間的交叉反應、敏感度和特異度不高[14-15]。串聯(lián)質(zhì)譜技術通過檢測不同激素間質(zhì)荷比進行定性，可有效降低假陽性率，提高陽性預測值，廣泛用于新生兒先天性腎上腺皮質(zhì)增生癥（congenital adrenal hyperplasia，CAH）的二級篩查[16]。此外，串聯(lián)質(zhì)譜技術通過檢測不同種類類固醇激素水平，還可篩查除21-羥化酶缺乏癥外的其他CAH類型[17]。

1.2.4 同型半胱氨酸檢測 同型半胱氨酸（homocysteine,Hcy）通常是利用循環(huán)酶法檢測,但其高水平的內(nèi)源性物質(zhì)對測定結果有較大干擾。高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）由于具有高敏感性、特異性及準確性，且能更精確地測定各類同型半胱氨酸水平，近年來已被用于總Hcy的臨床檢測[18]。

1.2.5 溶酶體酶活性檢測 溶酶體酶活性檢測主要用于溶酶體貯積?。╨ysosomal storage disorders,LSDs）臨床疑似患者的診斷及新生兒篩查，檢測方法包括串聯(lián)質(zhì)譜法、熒光法和多免疫定量法。熒光法因每次實驗只能檢測一種酶活性，多免疫定量法因尚未商品化還難以推廣[19-20]。串聯(lián)質(zhì)譜技術可根據(jù)酶反應產(chǎn)物和內(nèi)標特征離子對定量，得到產(chǎn)物與內(nèi)標的信號強度比值，從而計算出酶活性，每次用1個干血斑樣本可同時檢測6種酶活性，包括酸性β-葡萄糖腦苷脂酶、酸性鞘磷脂酶、β-半乳糖腦苷脂酶、a-L-艾杜糖苷酸酶、a-半乳糖苷酶和酸性a-葡糖苷酶，具有較好的靈敏度和準確度，更適用于開展高通量的新生兒LSDs篩查[21]。

1.2.6 極長鏈脂肪酸檢測 血清極長鏈脂肪酸（very long chain fatty acids,VLCFAs）定量檢測是診斷X-連鎖腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（X-linkedadrenoleukodystrophy,X-ALD）最主要的生化方法。國內(nèi)多采用衍生化的質(zhì)譜方法檢測二十二碳脂肪酸(C22:0)、二十四碳脂肪酸(C24:0)、二十六碳脂肪酸(C 26:0)水平以及C 24:0/C 22:0 比值、C 26:0/C 24:0 比值[22]。近年來通過非衍生化的串聯(lián)質(zhì)譜技術檢測濾紙干血片中極長鏈酰基肉堿（very long chain acylcarnitine,VLCAC）和溶血磷脂酰膽堿（lysophosphatidylcholine,LPC）可極大縮短每份樣本的檢測時間，精密度和準確性較好，適合高通量的新生兒篩查。目前，國際上多采用LPC（特別是C26:0-LPC）作為X-ALD的篩查指標[23]。但研究表明C26和C 26/C 22 比值更適合作為我國診斷X-ALD 的生物標志物[11]。

1.3 氣相色譜質(zhì)譜檢測

氣相色譜質(zhì)譜技術（gas chromatography-mass spectrometry,GC/MS）是通過檢測尿液中有機酸質(zhì)荷比對其進行定性及定量分析，可為40多種IMD的診斷提供可靠依據(jù)，是目前常用的IMD檢測方法之一[24]。自1966 年Tanaka 等[25]首次通過GC/MS 檢測尿有機酸譜診斷異戊酸血癥，GC/MS極大促進了IMD的診治，成為有機酸血癥鑒別診斷的主要方法。卜欣欣等[26]采用GC/MS 技術對2 461 例IMD 患兒尿液中132種代謝物進行檢測，發(fā)現(xiàn)32種氨基酸、有機酸及脂肪酸氧化代謝病，揭示了此項技術在IMD患兒中各類疾病的疾病譜，證明GC/MS技術對IMD診斷具有特異性。如甲基丙二酸血癥和丙酸血癥中血丙酰肉堿均增高，僅通過MS/MS 檢測難以鑒別，通過GC/MS檢測尿有機酸，若甲基丙二酸及甲基枸櫞酸等增高提示甲基丙二酸血癥，甲基枸櫞酸及3-羥基丙酸增高則提示丙酸血癥。此外，血MS/MS檢測中3-羥基異戊酰肉堿不同程度增高可提示的疾病包括3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥、多種羧化酶缺乏癥、β-酮硫解酶缺乏癥及3-羥基-3-甲基戊二酸尿癥等，但疾病明確診斷則需通過檢測尿特異有機酸水平。如尿3-甲基巴豆酰甘氨酸、3-羥基異戊酸伴3-羥基丙酸、甲基枸櫞酸等增高提示多種羧化酶缺乏癥，不伴3-羥基丙酸及甲基枸櫞酸增高提示3-甲基巴豆酰輔酶A羧化酶缺乏癥；尿3-羥-3-甲基戊二酸特異性增高提示3-羥基-3-甲基戊二酸尿癥；而大量酮尿提示β-酮硫解酶缺乏癥。

1.4 其他檢測技術

1.4.1 尿黏多糖電泳檢測 尿黏多糖檢測是診斷黏多糖貯積癥最常用的簡便方法。正常情況下，黏多糖可被相應的水解酶降解，故尿中黏多糖檢測為陰性。只有當相應酶缺陷或活性下降時，不完全降解的黏多糖在體內(nèi)貯積，最終從尿中排出，致尿中黏多糖檢測陽性[27]。因此，如尿黏多糖陽性，則間接反應黏多糖水解酶缺乏或活性下降。由于不同酶缺陷導致降解產(chǎn)物不同，故可根據(jù)尿中黏多糖的不同，進行初步分型及診斷。

1.4.2 尿蝶呤譜檢測 尿蝶呤譜分析是四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin,BH4）缺乏癥篩查最重要的檢測方法之一。該方法通過檢測尿濾紙片中新蝶呤（N）、生物蝶呤（B），并計算B%[B/(B+N)X100%]來鑒別診斷6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶（PTPS）缺乏、BH 4 合成酶尿苷三磷酸環(huán)水解酶（GTPCH）缺乏、BH 4 還原酶-紅細胞二氫蝶呤還原酶（DHPR）缺乏這三種分型[28]，具有有效且快速的特點。

2 遺傳學檢測

遺傳代謝病多為單基因病，染色體異常引起者少見。遺傳學檢測主要包括Sanger 測序、基因高通量測序、多重連接依賴探針擴增技術（multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA）、定量PCR及染色體芯片檢測。

2.1 Sanger測序

Sanger 測序也稱一代測序，廣泛應用于已知單基因遺傳病致病基因或熱點致病位點的遺傳檢測。其優(yōu)點是可檢測點突變、特異性強及快速，缺點是不能檢測基因大片段缺失和重復，如肌營養(yǎng)不良和脊肌萎縮癥，所以Sanger 測序結果陰性只能排除目標區(qū)域的特定突變。

2.2 基因高通量測序

基因高通量測序技術（next generation sequencing,NGS）可同時對幾十個基因至全基因進行測序，其優(yōu)點是高通量、自動化程度高，疾病覆蓋廣，在臨床應用中，對于與多個基因相關疾病的基因診斷更有意義。根據(jù)測序區(qū)域范圍大小，NGS 分為全基因組測序(whole genome sequencing，WGS)、全外顯子測序(whole exome sequencing，WES)和靶向捕獲測序（Panel），其中WES 是目前IMD 的主要分子診斷手段[29]。如黏多糖貯積癥有多種亞型，NGS技術可對其致病基因同時測序，縮短檢測時間，降低檢測費用。因此NGS 可以快速、精確地檢測出常見IMD 的基因突變，為患者提供準確的基因診斷。對于病因不明的疑似遺傳病患者優(yōu)選高通量測序技術檢測基因變異，鑒別是否有基因變異導致的疾病。

2.3 MLPA檢測

多重連接依賴探針擴增技術（multiplex ligation dependent probe amplification,MLPA）是針對待測核苷酸中靶序列進行的定性和半定量分析技術。該方法靈敏度高、針對性強，主要檢測染色體數(shù)目非整倍體異常、基因或基因片段的缺失或重復及基因甲基化，臨床上多用于檢測由于染色體異?；蚧虼笃稳笔录膊?，如杜氏肌營養(yǎng)不良、地中海貧血、脊髓性肌萎縮癥、貓叫綜合征（5 p 缺失）、DiGeoge綜合征等。雖然該技術具備較多優(yōu)點，但仍存在不能檢測未知點突變及染色體平衡易位等局限性，因此僅對于部分檢測不到基因突變的遺傳代謝病可進行MLPA檢測，以便發(fā)現(xiàn)拷貝數(shù)異常。由于MLPA檢測的疾病數(shù)量較少，限制了此技術在臨床的開展。

2.4 熒光定量PCR檢測

熒光定量PCR 檢測（quantitative fluorescence PCR,QF-PCR）是快速靶向分子診斷技術，已廣泛用于檢測基因拷貝數(shù)變異領域，如脊髓性肌萎縮癥的診斷[30]，具有快速便捷、成本低廉、普及度高等特點。該方法可通過檢測SMN1基因第7外顯子的拷貝數(shù)判斷SMN1基因的缺失情況，從而快速明確是否患病、是否攜帶致病基因，尤其適用于該病攜帶者及其產(chǎn)前篩查[31]。定量PCR也常用于基因變異位點檢測，如耳聾基因檢測，利用定量PCR可以檢測數(shù)個耳聾基因的幾個已知變異位點，取得了較好的效果[32]。

2.5 染色體芯片檢測

染色體芯片技術也稱染色體微陣列芯片分析（chromosome array analysis,CMA），可以幫助臨床醫(yī)師對兒童發(fā)育異常相關的罕見病進行明確診斷，如Prader-willi 綜合征、貓叫綜合征、22 q 11.2 缺失綜合征、Williams-Beuren綜合征、Angelman綜合征、Russell-silver 綜合征等。對于發(fā)育落后伴外觀畸形或多臟器畸形的患者優(yōu)選染色體芯片檢測。

上述檢測技術均是診斷IMD 的重要檢測方法，臨床醫(yī)師需要了解各項技術的檢測目標、適應疾病及檢測周期。在遺傳代謝病疑似患者的診治過程中，依據(jù)患者的臨床表現(xiàn)，選擇合適檢測方法，達到即經(jīng)濟又高效的目的，對患者進行精準的診斷或排除遺傳代謝病。