馬翠霞 封露露 馬倩倩 李 揚(yáng) 封紀(jì)珍

1.石家莊市婦幼保健院遺傳科（河北石家莊 050051）；2.石家莊市第四醫(yī)院體檢中心（河北石家莊 050000）；3.石家莊市婦幼保健院產(chǎn)前診斷科（河北石家莊 050051）

高苯丙氨酸血癥（hyperphenylalaninemia，HPA）主要是由苯丙氨酸羥化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）或其輔酶四氫生物蝶呤（tetrahydrobiopterin，BH4）缺乏引起的常染色體隱性遺傳病，為最常見(jiàn)的一種氨基酸代謝障礙性疾病[1]。HPA 在不同地區(qū)、不同人群間發(fā)病率有很大不同，相關(guān)PAH基因的變異位點(diǎn)也有很大差異。本研究通過(guò)分析石家莊市新生兒HPA篩查及患兒基因檢測(cè)結(jié)果，了解石家莊市新生兒HPA發(fā)病及基因變異情況，完善石家莊HPA患兒的基因突變譜，為進(jìn)一步遺傳咨詢(xún)提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇石家莊市新生兒疾病篩查中心負(fù)責(zé)的22個(gè)區(qū)縣107所醫(yī)療機(jī)構(gòu)2017年3月至2021年5月出生的新生兒495 740例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①出生后3～20 d；②充分哺乳（6～8次以上）后采集足跟血。排除標(biāo)準(zhǔn)：①重復(fù)報(bào)告；②數(shù)據(jù)不完整；③死亡；④失訪。

本研究獲石家莊市婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（No.202036），研究對(duì)象監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 足跟血采集方法 75%乙醇消毒，使用一次性采血針刺于足跟內(nèi)或外側(cè)，深度＜3 mm，棄去第1滴血后取樣，用與試劑盒質(zhì)控血片一致的903號(hào)血片接觸血滴，使其自然滲透，采集3 個(gè)直徑＞8 mm的血斑，自然晾干，置4～8 ℃保存，每周定期送至篩查中心，篩查中心收到樣本后于5 個(gè)工作日內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)并出具可疑結(jié)果。

1.2.2 篩查方法及診斷標(biāo)準(zhǔn) 苯丙氨酸（Phe）測(cè)定采用免疫熒光法，試劑為芬蘭Labsystems 新生兒Phe 濃度測(cè)定試劑盒，儀器為芬蘭Wallac 公司半自動(dòng)VICTOR2D 1420 時(shí)間分辨熒光免疫分析儀。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。初篩及復(fù)查血Phe 濃度＞2.0 mg/dL（120 μmol/L）為陽(yáng)性。篩查陽(yáng)性者召回采血測(cè)定Phe 濃度仍＞2.0 mg/dL，并且苯丙氨酸/酪氨酸（Phe/Tyr）＞2.0 確診為HPA；進(jìn)行尿蝶呤譜分析以區(qū)分PAH 缺乏癥和BH 4缺乏癥。

患兒根據(jù)治療前最高血Phe 濃度分為經(jīng)典型苯丙酮尿癥（classic phenylketonuria，cPKU，Phe≥1 200 μmol/L）、輕度PKU（mild phenylketonuria，mPKU，360 μmol/L ≤Phe＜1 200 μmol/L）和輕度高苯丙氨酸血癥（mild hyperphenylalaninemia，MHP，120 μmol/L≤Phe＜360 μmol/L）。

1.2.3PAH基因檢測(cè) 采用基因測(cè)序技術(shù)對(duì)患兒及其父母PAH基因進(jìn)行檢測(cè)?；純杭捌涓改胳o脈血用乙二胺四乙酸抗凝后嚴(yán)格按照說(shuō)明提取DNA，并對(duì)提取物進(jìn)行質(zhì)檢，后進(jìn)行基因組文庫(kù)構(gòu)建。標(biāo)記探針與文庫(kù)DNA雜交，用磁珠結(jié)合探針以抓取目的基因，磁珠被磁力架吸附洗脫純化，目的基因得以富集，進(jìn)而進(jìn)行高通量測(cè)序。所有數(shù)據(jù)進(jìn)行單核苷酸序列多態(tài)性分析（single nucleotide polymorphisms，SNP），檢測(cè)到的變異位點(diǎn)按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南進(jìn)行致病性分析。未報(bào)道的新發(fā)變異使用MutationTaster、GERP++、SIFT、PolyPhen_2、REVEL等功能預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行致病性預(yù)測(cè)。對(duì)發(fā)現(xiàn)的致病變異在其所在片段上、下游設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增及Sanger測(cè)序，進(jìn)一步驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，采用Sanger 法對(duì)患兒父母進(jìn)行目標(biāo)基因變異驗(yàn)證，基因測(cè)序相關(guān)工作由北京邁基諾醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的以中位數(shù)M（P25～P75）表示。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（百分比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPA篩查情況

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的新生兒487 413例。根據(jù)排除標(biāo)準(zhǔn)排除33例，最終入組487 380例。其中男252 521例、女234 859例，采血中位日齡為3.0（3.0～4.0）d，新生兒篩查Phe濃度為0.6（0.3～0.8）mg/dL。篩查出陽(yáng)性患兒191例，確診HPA 104例，均為PAH缺乏癥。其中男55例、女49例，HPA發(fā)病率為1/4686。男嬰（2.2/萬(wàn)）與女?huà)耄?.1/萬(wàn)）HPA發(fā)病率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.05，P=0.827）。104例HPA患兒中61例為MHP（58.7%），23例為mPKU（22.1%），20例為cPKU（19.2%）。見(jiàn)表1。

表1 487 380例新生兒HPA篩查情況及臨床表型

2.2 PAH基因變異類(lèi)型及特點(diǎn)

104 例HPA 患兒208 個(gè)等位基因中，共檢測(cè)到209 個(gè)PAH基因變異位點(diǎn)，62 種基因變異，所有檢測(cè)到的變異均來(lái)自患兒父母。在209 個(gè)PAH基因變異位點(diǎn)中，8 個(gè)最常見(jiàn)的變異占總數(shù)56.0%，即c.158G＞A（39/209，18.7%）、c.728G＞A（22/209，10.5%）、c.611 A＞G（14/209，6.7%）、c.331 C＞T（10/209，4.8%）、c.721 C＞T（10/209，4.8%）、c.442-1G＞A（8/209，3.8%）、c.1068C＞A（7/209，3.3%）、c.1197 A＞T（7/209，3.3%）。PAH基因變異位點(diǎn)分布不均勻，涵蓋范圍較廣，主要在外顯子7（40/209，19.1%）、外顯子2（39/209，18.7%）、外顯子3（23/209，11.0%）、外顯子6（22/209，10.5%）、外顯子11（22/209，10.5%）。104例HPA患兒中3例為雜合變異（2.9%），3例為純合變異（2.9%），98例為復(fù)合雜合變異（94.2%）。62 種變異位點(diǎn)中涉及6種變異類(lèi)型，包括37個(gè)錯(cuò)義變異、10個(gè)剪接變異、7個(gè)無(wú)義變異、2個(gè)同義變異、1個(gè)整碼變異、5個(gè)雜合變異。

在MHP患兒中最常見(jiàn)的變異位點(diǎn)有c.158G＞A（37/209，17.7%）、c.728 G＞A（8/209，3.8%）、c.611 A＞G（8/209，3.8%）、c.320 A＞G（5/209，2.4%）；mPKU患兒中最常見(jiàn)的變異位點(diǎn)有c.721C＞T（9/209，4.3%）、c.728G＞A（7/209，3.4%）、c.611A＞G（4/209，1.9%）；cPKU患兒中最常見(jiàn)的變異位點(diǎn)有c.728G＞A（7/209，3.45%）、c.331C＞T（6/209，2.9%）、c.1068 C＞A（5/209，2.4%）、c.442-1 G＞A（4/209，1.9%）。

2.3 PAH基因片段缺失及未報(bào)道基因變異情況

石家莊市新生兒HPA 患兒中發(fā)現(xiàn)5 種雜合缺失，分別位于外顯子1及上游區(qū)域、內(nèi)含子1、內(nèi)含子3、外顯子4～5、外顯子6，片段缺失分析結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)HGMD文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索外顯子6雜合缺失未有與PAH相關(guān)的報(bào)道。

圖1 HPA 患兒PAH 基因缺失重復(fù)分析結(jié)果

基因變異位點(diǎn)c.630 T＞G、c.61-1 G＞A、c.912+5 G＞T 和c.1055+241 C＞A 經(jīng)HGMD 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索未有相關(guān)報(bào)道，ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)該位點(diǎn)致病性結(jié)果分析。1 例患兒同時(shí)攜帶c.630 T＞G 與c.61-1 G＞A 兩個(gè)位點(diǎn)，臨床表型為MHP，這兩個(gè)位點(diǎn)蛋白功能預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)為有害、未知，ACMG致病性分析為臨床意義未明、疑似致病性變異。c.912+5 G＞T 蛋白功能預(yù)測(cè)軟件為未知，ACMG致病性分析為臨床意義未明，該患兒臨床表型為mPKU。c.1055+241C＞A蛋白功能預(yù)測(cè)軟件為未知，ACMG致病性分析為臨床意義未明，該患兒臨床表型為MHP。見(jiàn)圖2。

圖2 HPA 患兒HGMD 文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)未報(bào)道基因測(cè)序圖

3 討論

食物中蛋白質(zhì)分解形成的Phe 在正常狀態(tài)下由肝臟PAH作用轉(zhuǎn)變?yōu)門(mén)yr，如果PAH缺乏會(huì)導(dǎo)致血中Phe 含量升高，通過(guò)血腦屏障在腦部蓄積，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)損害[2]。BH 4 是Phe、Tyr 代謝過(guò)程中的輔酶，BH 4 還原酶缺乏也會(huì)導(dǎo)致HPA，引起神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺和5-羥色胺合成障礙，損害神經(jīng)系統(tǒng)。HPA根據(jù)病因分為PAH缺乏癥和BH4缺乏癥，在我國(guó)85%～90%為PAH缺乏癥[3]。

HPA 在不同的國(guó)家和地區(qū)發(fā)病率有很大差異，有資料顯示，歐洲不同國(guó)家HPA 的發(fā)病率為1/3000～1/30000[4]，在亞洲國(guó)家中泰國(guó)較低為1/327740[5]。我國(guó)HPA發(fā)病率在南、北方地區(qū)有所不同，南方地區(qū)發(fā)病率在1/81976～1/10567之間[6-7]，北方地區(qū)在1/5452～1/3495 之間[8-9]。石家莊市發(fā)病率為1/4686，明顯高于南方地區(qū)，與北方地區(qū)一致，符合HPA 南低北高的特點(diǎn)。本研究HPA患兒基因變異以錯(cuò)義變異為主，發(fā)生率較高的位點(diǎn)為c.158G＞A（p.R53H）、c.728G＞A（p.R243Q）與c.611 A＞G（p.Y 204 C），與一些學(xué)者研究結(jié)果一致[5,10-11]，青島、陜西與本地區(qū)略有差異[12-13]。青島c.611A＞G（p.Y204C）發(fā)生頻率較低，陜西c.728G＞A（p.R243Q）與c.721C＞T（p.R241C）發(fā)生頻率最高，甘肅c.1068C＞A與c.1238G＞C發(fā)生頻率較高。

本組攜帶c.158 G＞A（p.R 53 H）變異位點(diǎn)的39 例患兒中37 例臨床表型為MHP（1 例患兒攜帶3 個(gè)變異位點(diǎn)，其中2 個(gè)為c.158 G＞A），1 例患兒為mPKU，1 例為cPKU。這與相關(guān)研究的結(jié)論，即c.158 G＞A（p.R 53 H）變異對(duì)PAH 酶活性影響較低一致[11]。1例cPKU患兒所攜帶的位點(diǎn)為c.158G＞A、c.194 T＞C 和c.842+2 T＞A，預(yù)測(cè)這3 個(gè)位點(diǎn)的復(fù)合作用對(duì)PAH酶活性的影響較大。攜帶c.728G＞A（p.R 243 Q）變異的21 例患兒中8 例臨床表型為MHP，7 例為mPKU，6 例為cPKU 患兒（1 例患兒攜帶2 個(gè)c.728 G＞A 變異位點(diǎn)，為純合變異）。相關(guān)研究顯示c.728G＞A（p.R243Q）變異對(duì)酶活性影響較大[14]，而本研究中攜帶該變異的患兒臨床表型與此結(jié)論略有差異。攜帶c.611A＞G（p.Y204C）變異的14 例患兒中8 例臨床表型為MHP，4 例為mPKU，2例為cPKU。有研究顯示c.611A＞G（p.Y204C）變異對(duì)PAH 酶活性影響不大[15]，2 例cPKU 患兒攜帶的變異位點(diǎn)分別為c.611A＞G和c.331C＞T、c.611A＞G和c.1068C＞A，考慮c.331C＞T與c.1068C＞A這兩種變異可能對(duì)PAH酶活性的影響作用較大。本研究中變異位點(diǎn)導(dǎo)致的不同臨床表型與其他研究結(jié)果較為一致[6]。

中國(guó)人群PAH 缺乏癥患者攜帶包括點(diǎn)變異和片段缺失的多種基因變異。石家莊市新生兒HPA患兒中變異頻率最高的區(qū)域是外顯子7，而河南地區(qū)為外顯子6[16]。本組5種片段缺失中外顯子6雜合缺失在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)未有PAH基因相關(guān)性的報(bào)道，該患兒攜帶的另外1個(gè)位點(diǎn)為c.611A＞G，臨床表型為mPKU，與前期研究中變異c.611 A＞G（p.Y 204 C）對(duì)PAH 酶活性影響情況一致[23]。HGMD 數(shù)據(jù)庫(kù)中未報(bào)道的基因變異為c.630 T＞G、c.61-1 G＞A、c.912+5G＞T和c.1055+241C＞A，其中c.630T＞G與c.61-1 G＞A 存在于同一例患兒，該患兒臨床表型為MHP。攜帶c.912+5G＞T變異的患兒，另1個(gè)變異為外顯子4～5 片段缺失，臨床表型為mPKU；攜帶c.1055+241 C＞A 變異的患兒，另1 個(gè)變異為c.721C＞T，臨床表型為MHP。

本研究顯示，石家莊HPA 患兒基因變異以錯(cuò)義變異為主，發(fā)生率較高的位點(diǎn)為c.158 G＞A、c.728G＞A和c.611A＞G，分布區(qū)域以外顯子7為主。本研究明確了石家莊市HPA患兒基因變異的類(lèi)型和特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)外顯子6雜合缺失以及c.630T＞G、c.61-1G＞A、c.912+5G＞T和c.1055+241C＞A 5個(gè)變異在HGMD數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)相關(guān)報(bào)道，豐富和完善了石家莊市HPA患兒的基因變異圖譜，為患兒家庭進(jìn)行遺傳咨詢(xún)和產(chǎn)前診斷提供了重要的補(bǔ)充資料。