張 鈺，洪淑娥，劉家明，劉志禮，肖世寧，顏金祥，周 揚(yáng)

1南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330006；2南昌大學(xué)脊柱脊髓研究所，江西 南昌330006

盡管神經(jīng)醫(yī)學(xué)近年發(fā)展突飛猛進(jìn)，但是脊髓損傷（SCI）仍是青年人致殘的主要原因［1］。因此，如何改善脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)仍是神經(jīng)醫(yī)學(xué)的研究熱點(diǎn)［2-4］。目前，脊髓損傷基礎(chǔ)研究最常用的為SD大鼠的SCI模型［5］，準(zhǔn)確、客觀的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)方法對(duì)于大鼠SCI后恢復(fù)程度的判斷具有重要意義。

目前常用的評(píng)估大鼠SCI后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)的方法有神經(jīng)電生理［6,7］和BBB評(píng)分量表［8,9］。神經(jīng)電生理評(píng)價(jià)具有客觀性和準(zhǔn)確性，易于定量分析。運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（MEP）潛伏期具有良好的穩(wěn)定性，能夠準(zhǔn)確、客觀地判斷大鼠SCI 后的嚴(yán)重程度，可作為一種金標(biāo)準(zhǔn)去評(píng)估神經(jīng)損傷的程度［10-12］。但是由于神經(jīng)電生理檢測(cè)儀器昂貴以及熟練掌握其測(cè)量方法需要一定的學(xué)習(xí)曲線，其普及性欠佳。BBB評(píng)分由于其簡(jiǎn)易操作，其評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)包括許多評(píng)定細(xì)節(jié)和特征說(shuō)明，分級(jí)較細(xì)致，在大鼠SCI研究中被廣泛應(yīng)用［13-15］。然而，作者在對(duì)SCI大鼠的BBB評(píng)分過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)BBB評(píng)分存在主觀性較強(qiáng)，且在SCI大鼠恢復(fù)的早期（BBB評(píng)分量表中小于等于7分），其髖、膝及踝關(guān)節(jié)的活動(dòng)不易觀察等問(wèn)題［16-18］。

因此，本研究利用SD大鼠在水中恐懼而激發(fā)其運(yùn)動(dòng)潛能，同時(shí)水中浮力減輕其臀部部分重力對(duì)后肢的壓迫，使其后肢關(guān)節(jié)更易驅(qū)動(dòng)且易于被觀察的特點(diǎn)。將SCI大鼠放置于自制單通道透明水缸來(lái)評(píng)估大鼠脊髓損傷后的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，旨在提出一種新的脊髓損傷后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)估方法，以便更加客觀、準(zhǔn)確地評(píng)估脊髓損傷大鼠的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

36只8周SPF級(jí)雌性SD大鼠（天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXΚ（湘）2019-0014），體質(zhì)量200～220 g。大鼠飼養(yǎng)于具有獨(dú)立換氣系統(tǒng)的清潔籠內(nèi)，動(dòng)物房溫度控制為22～25 ℃，濕度55%，保持光照規(guī)律變化。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有動(dòng)物的處理均符合動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)（動(dòng)物倫理號(hào)：CDYFY-IACUC-202207QR001）。

1.2 分組及造模

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)前對(duì)所選大鼠進(jìn)行常規(guī)行為能力測(cè)試，確保其運(yùn)動(dòng)功能正常。36 只大鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，采用數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為脊髓損傷組和假手術(shù)組，18只/組。

1.2.2 模型的建立 脊髓損傷組大鼠術(shù)前常規(guī)禁食，自由飲水。全部18 只大鼠在椎板切除后，Allen打擊法［19］制備大鼠脊髓損傷模型：異氟烷全身麻醉滿意后，大鼠取俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。無(wú)菌操作下于背側(cè)入路暴露脊髓T10節(jié)段，用直徑3 mm的10 g鐵棒下落打擊裝置造成脊髓輕中度損傷（打擊力量為15 g·cm）。假手術(shù)組大鼠僅暴露脊髓，不給予外力打擊，并常規(guī)縫合。術(shù)后護(hù)理：SCI 大鼠模型建立后，控制環(huán)境溫度在22～25 ℃；每2只大鼠1籠喂養(yǎng)，保持飼養(yǎng)籠墊料干燥、清潔；3次/d協(xié)助排尿，直到反射性膀胱排空形成，以及用干燥毛巾擦干被尿液浸濕的肢體及會(huì)陰部；術(shù)后常規(guī)每日10萬(wàn)單位青霉素肌注預(yù)防感染；術(shù)后皮下注射葡萄糖液5 mL，連續(xù)3 d，預(yù)防失血性休克及補(bǔ)充能量。

1.3 功能評(píng)價(jià)

1.3.1 兩種脊髓損傷評(píng)分方法

1.3.1.1 水缸評(píng)分法 將待觀察大鼠放入盛有5 cm深度溫水的自制單通道透明水缸中，觀察者從自制單通道透明水缸側(cè)面觀察大鼠后肢的活動(dòng)，每只大鼠在單通道水缸內(nèi)通過(guò)全程路線3 次，并觀察其關(guān)節(jié)活動(dòng)、承重步態(tài)、運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性進(jìn)行綜合評(píng)分。具體評(píng)分細(xì)則同BBB評(píng)分［20］：大鼠后肢功能評(píng)分為0～21分，正常大鼠為21分。自制單通道透明水缸（國(guó)家專(zhuān)利號(hào)：202121952501.1）：包括底部控溫裝置，可保證水溫維持在38 ℃，水缸長(zhǎng)150 cm，內(nèi)槽寬度為10 cm，可以很好保證大鼠在其中沒(méi)有擁擠感，但不能自由轉(zhuǎn)身。使用時(shí)，其水深以剛好達(dá)到被觀察大鼠的下頜，約5 cm。水缸周邊玻璃有一定的放大設(shè)計(jì)，保證觀察者從側(cè)面可清楚的觀察到大鼠后肢的活動(dòng)，水缸尾部為黑色物包裹封閉設(shè)計(jì)，因大鼠喜黑，可誘導(dǎo)大鼠向前爬行（圖1、2）。

圖1 自制水缸的構(gòu)造及其應(yīng)用方法Fig.1 Construction of the self-designed water tank and its application.A: Schematic diagram of the self-designed water tank.B:Lateral view of a rat crawling in the water tank.The water level in the tank is below the jaw of the rat so that the activity of the hind limbs can be clearly observed.C: Top view of the rat in the tank,which is confined to crawl forward in the water tank.

1.3.1.2 BBB評(píng)分法［20］大鼠于曠場(chǎng)自由爬行，觀察其運(yùn)動(dòng)4 min，每只觀測(cè)3次。兩種脊髓損傷評(píng)分方法的評(píng)分者為2名經(jīng)過(guò)培訓(xùn)了解評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)的非該實(shí)驗(yàn)人員，評(píng)分采用雙人獨(dú)立觀察，最后結(jié)果為兩位觀察者的平均記錄分?jǐn)?shù)（圖2）。兩組大鼠在術(shù)后1、3、5、7、14、21 d，6個(gè)時(shí)間點(diǎn)均采用兩種不同的脊髓損傷評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分。

圖2 水缸評(píng)分法與BBB評(píng)分法評(píng)分時(shí)SCI大鼠后肢活動(dòng)觀察的對(duì)比Fig.2 Assessment of hindlimb activity of SCI rats using water tank scoring and BBB scoring.A:The water tank scoring method,in which the activity of the hind limb of the rats can be clearly observed in the tank.B: BBB scoring method,in which the movement of the hind limb of SCI rats on the ground is relatively difficult for observation.

1.3.2 運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位（MEP）應(yīng)用NIM-ECLIPSE生物信號(hào)處理系統(tǒng)（Medtronic,Inc.USA），刺激電極：分別置于大鼠頭顱中線皮下和硬腭黏膜下。記錄電極：分別置于后肢腓腸肌與跟腱處。大鼠大腦皮層接受刺激后，同時(shí)可以在下肢肌肉記錄到MEP。兩組大鼠在術(shù)前，術(shù)后1、3、5、7、14、21 d 檢測(cè)大鼠MEP評(píng)估脊髓損傷恢復(fù)程度。

大鼠晝夜活動(dòng)差別較大，所有評(píng)分及檢測(cè)均固定于每個(gè)時(shí)間點(diǎn)晚上19點(diǎn)進(jìn)行。評(píng)價(jià)前所有大鼠人工排除膀胱尿液，以免因膀胱充盈而影響大鼠活動(dòng)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。正態(tài)分布資料采用Pearson相關(guān)分析，非正態(tài)分布資料采用Spearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠SCI造模術(shù)后一般情況

大鼠SCI造模術(shù)后1 h基本清醒，假手術(shù)組大鼠后肢關(guān)節(jié)可自由活動(dòng)，自主飲水、飲食。脊髓損傷組大鼠表現(xiàn)為截癱，兩個(gè)前肢可爬行運(yùn)動(dòng)，但后肢和尾部無(wú)活動(dòng)，出現(xiàn)尿潴留、腹脹等典型SCI表現(xiàn)。假手術(shù)組大鼠術(shù)后1 d其后肢肌力基本恢復(fù)正常，后肢協(xié)調(diào)性較好。脊髓損傷組大鼠主要靠前肢爬行移動(dòng)，腹部貼地，雙足底向上。所有大鼠切口均愈合良好，定期進(jìn)行水缸評(píng)分方法評(píng)分的同時(shí)，予以水浴清潔護(hù)理會(huì)陰部。所有SCI組大鼠均無(wú)傷口及泌尿系感染跡象。但由于缺乏后肢活動(dòng)，SCI組大鼠后肢較假手術(shù)組出現(xiàn)一定程度的肌肉萎縮。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，因各種原因（如麻醉意外、咬傷、尿路感染、傷口感染、擠尿?qū)е掳螂灼屏训龋┒劳龅拇笫蠊? 只（其中假手術(shù)組0只，脊髓損傷組1 只：同籠大鼠打斗，咬開(kāi)背部傷口致死），總死亡率為2.78%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中意外死亡大鼠及時(shí)補(bǔ)充，以確保每組大鼠數(shù)量與計(jì)劃一致。

2.2 兩種不同脊髓損傷評(píng)分法評(píng)分結(jié)果對(duì)比

脊髓損傷前所有大鼠使用水缸評(píng)分法和BBB評(píng)分法評(píng)分均為21分。

水缸評(píng)分法：SCI組大鼠傷后1 d均為0分；損傷后3 d 開(kāi)始有下肢恢復(fù)跡象為0.22±0.43分，傷后前2周恢復(fù)較快，大鼠SCI后5、7、14 d評(píng)分分別為0.67±0.49分、4.33±1.19 分、8.61±1.20 分，運(yùn)動(dòng)評(píng)分顯著增高（P＜0.05）；第21天達(dá)到14.78±1.06分，已可自主爬行，但是精細(xì)動(dòng)作欠佳（表1、圖3）。

表1 兩種評(píng)分方法評(píng)分結(jié)果對(duì)比Tab.1 Comparison of the results of the two scoring methods(Mean±SD)

BBB 評(píng)分法：SCI 組大鼠在術(shù)后1、3 d 使用傳統(tǒng)BBB 評(píng)分均為0 分；損傷后5 d 地面曠場(chǎng)評(píng)分僅為0.11±0.32分；損傷后7、14 d評(píng)分顯著增高（P＜0.05），第21天達(dá)到14.5±1.47分，可觀察到大鼠后肢自主運(yùn)動(dòng)爬行，但是精細(xì)動(dòng)作欠佳（表1、圖3）。

與BBB評(píng)分法相比，水缸評(píng)分法在造模后第3天開(kāi)始評(píng)分更高，并在造模后第5、7、14天評(píng)分顯著高于BBB評(píng)分法評(píng)分結(jié)果（P＜0.01，圖3）。造模后14 d大鼠后肢功能逐步恢復(fù)，兩種評(píng)分方法分值差距縮小，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 大鼠MEP潛伏期監(jiān)測(cè)結(jié)果

大鼠SCI后MEP潛伏期延長(zhǎng)，波幅明顯減小，SCI術(shù)后1 d潛伏期長(zhǎng)達(dá)8.06±0.22 ms，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，潛伏期逐漸縮短，波幅逐漸增加，SCI術(shù)后14 d潛伏期縮短為6.29±0.34 ms，術(shù)后1、3、5、7、14 d脊髓損傷潛伏期均低于假手術(shù)組潛伏期（P＜0.01）。21 d后接近正常水平為5.87±0.28 ms（表2、圖4）。

表2 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)MEP潛伏期測(cè)量結(jié)果Tab.2 Results of MEP latency measurements at different time points after SCI in the two groups(ms,Mean±SD)

圖4 神經(jīng)電生理監(jiān)測(cè)結(jié)果圖Fig.4 Electrophysiological monitoring results.A:MEP latency in normal rats(about 5.7 ms).B:The latency is significantly prolonged and the wave amplitude is significantly reduced at the initial stage of SCI,indicating that the motor pathway of the lower limbs is damaged.C:The MEP latency decreases over time while the wave amplitude gradually increases,indicating gradual recovery of the motor pathway of the lower limbs.

2.4 兩種不同脊髓損傷評(píng)分法與MEP潛伏期的相關(guān)性分析

兩種脊髓損傷評(píng)分方法得分與MEP 潛伏期均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.01）。但水缸評(píng)分法與電生理MEP潛伏期的相關(guān)系數(shù)（r=-0.90）高于BBB評(píng)分法得分與電生理MEP潛伏期的相關(guān)系數(shù)（r=-0.86）。

3 討論

建立一個(gè)客觀、準(zhǔn)確的大鼠SCI 動(dòng)物模型后肢功能評(píng)價(jià)方法，對(duì)于大鼠SCI損傷程度、恢復(fù)過(guò)程及干預(yù)措施的效果的評(píng)價(jià)非常關(guān)鍵［21-23］。電生理是目前較為準(zhǔn)確、客觀的檢測(cè)手段［24］，但其普及率不高。BBB評(píng)分法［20］是可簡(jiǎn)易評(píng)估大鼠后肢運(yùn)動(dòng)情況的一種方法，也是目前評(píng)價(jià)大鼠SCI后功能恢復(fù)的最常用評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［25-27］。BBB評(píng)分分值越高，表明后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)越好。其中0～7分屬于恢復(fù)的早期階段；8～13分進(jìn)入恢復(fù)中期；14～21分階段代表大鼠精細(xì)運(yùn)動(dòng)恢復(fù)時(shí)期。而實(shí)際上，SCI大鼠早、中期評(píng)分時(shí)，SCI大鼠因后肢癱瘓，活動(dòng)減少，并且其臀部因重力作用壓住無(wú)力后肢，使得其后肢即使有微弱的肌力恢復(fù)也無(wú)法活動(dòng)其髖、膝、踝關(guān)節(jié)，從而導(dǎo)致觀察者無(wú)法準(zhǔn)確、客觀的的判斷其下肢功能恢復(fù)情況。

本研究設(shè)計(jì)水缸評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分：由于水的浮力抵消了SCI大鼠部分自身重力，即使微弱肌力恢復(fù)也可驅(qū)動(dòng)下肢髖、膝、踝關(guān)節(jié)的活動(dòng)，并且通過(guò)盛水玻璃的局部放大作用，大鼠下肢活動(dòng)可被早期發(fā)現(xiàn)。此外，正常大鼠放入盛水水缸內(nèi)，表現(xiàn)為有意高抬后肢動(dòng)作，表現(xiàn)出一定的恐水性。因此，大鼠SCI后早、中期后肢活動(dòng)能力得到激發(fā)，且水中浮力的存在使得SCI大鼠后肢活動(dòng)更容易被觀察者捕獲，從而提高了該評(píng)分方法的準(zhǔn)確性和敏感性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水缸評(píng)分法和BBB評(píng)分法評(píng)分均能反映SCI 后大鼠后肢功能恢復(fù)過(guò)程，體現(xiàn)SCI后神經(jīng)恢復(fù)的程度。但水缸評(píng)分法得分在SCI術(shù)后第5、7、14天均顯著高于傳統(tǒng)BBB評(píng)分。術(shù)后第5～14天，損傷大鼠下肢逐漸恢復(fù)運(yùn)動(dòng)，在自制水缸內(nèi)觀察評(píng)分，早、中期大鼠后肢尚不明顯的屈伸活動(dòng)更容易被觀察者捕獲。這可能是由于輕、中度脊髓損傷的在傷后第5天，開(kāi)始有一定的下肢運(yùn)動(dòng)恢復(fù)。但是由于恢復(fù)早期，臀部的壓迫影響了下肢的活動(dòng)，導(dǎo)致兩種評(píng)分方法有顯著差異。傷后14～21 d兩種評(píng)分方法無(wú)明顯差異。這可能是由于SCI術(shù)后14 d脊髓損傷大鼠下肢肌力逐漸恢復(fù)，以至于可逐步承重爬行，并且傳統(tǒng)BBB評(píng)分方法已經(jīng)可以很好的觀察大鼠后肢活動(dòng)情況。因此，傷后14 d以上，兩種評(píng)分方法沒(méi)有明顯差異。本研究使用的大鼠脊髓損傷模型為輕度損傷模型，因此在術(shù)后21 d BBB評(píng)分可達(dá)到14.50±1.47分，而馬善峰等［28］在大鼠脊髓損傷術(shù)后6周評(píng)分僅為11.50±0.93分，這可能是由于不同研究需要和不同造模儀器參數(shù)導(dǎo)致的大鼠SCI程度不一致，但是本研究中使用同一批大鼠進(jìn)行不同評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分方法結(jié)果差異的比較不受大鼠SCI程度影響。

進(jìn)一步，本研究分析了兩種脊髓損傷下肢功能評(píng)分法與神經(jīng)電生理檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。神經(jīng)電生理檢測(cè)可較為客觀的反映脊髓功能，在神經(jīng)中樞、神經(jīng)傳導(dǎo)通路和效應(yīng)器（肌肉）上，可以記錄到特定位相的電變化，能夠反映神經(jīng)系統(tǒng)一定部位的功能狀態(tài)［28］。本研究結(jié)果顯示：水缸評(píng)分方法得分與MEP 潛伏期數(shù)值的相關(guān)性更高，高于傳統(tǒng)BBB評(píng)分得分與MEP 潛伏期數(shù)值的相關(guān)系數(shù)（r=-0.90，r=-0.86）。有研究在進(jìn)行大鼠脊髓損傷功能評(píng)價(jià)的研究中指出MEP與BBB評(píng)分有較好的相關(guān)性［10］，這與本研究結(jié)論一致。伊超凡等［16］研究表明脊髓在受到損傷時(shí)，其MEP潛伏期顯著延長(zhǎng)、波幅顯著下降，且脊髓在受到重度損傷時(shí)，會(huì)出現(xiàn)波形明顯變異，無(wú)法確認(rèn)，因此本研究選擇輕度損傷，從而更好的檢測(cè)MEP的潛伏期。因此，本研究結(jié)果可以表明：水缸評(píng)分方法的評(píng)分結(jié)果與電生理定量數(shù)值具有更好的相關(guān)性，得出的評(píng)分更加客觀、準(zhǔn)確。

綜上所述，水缸評(píng)分方法與BBB評(píng)分法相比，能夠在大鼠SCI早期更客觀、準(zhǔn)確的反映脊髓損傷后的功能恢復(fù)過(guò)程。本研究結(jié)果為大鼠急性脊髓損傷模型后肢功能恢復(fù)的一種可靠的評(píng)估方法。