黃永祺，喻 偉，游月華1，

1南方醫(yī)科大學附屬深圳市龍華人民醫(yī)院口腔科，廣東 深圳 518109；2南方醫(yī)科大學口腔醫(yī)學院，廣東 廣州510515

口腔黏膜下纖維化（OSF）是口腔潛在惡性疾?。?］，長期咀嚼檳榔是其主要病因之一［2］。近年來，臨床上嘗試用各種藥物和手術治療來干預OSF發(fā)生發(fā)展過程，但效果有限［3,4］。深入研究OSF的發(fā)病機制對于找尋有效的治療方法具有重要意義。

活化的頰黏膜成纖維細胞（BMFs）是OSF黏膜下膠原的主要來源［5］。本課題組在既往研究中發(fā)現(xiàn)BMFs的活化與檳榔堿造成的口腔黏膜下炎癥密切相關［6］，而在口腔黏膜下炎癥中發(fā)揮關鍵作用的巨噬細胞是否參與了BMFs的活化，目前尚無相關報道。

細胞外囊泡（EVs）可介導細胞間通訊［7］。作為細胞外囊泡的一種，外泌體可攜帶多種大分子物質(zhì)參與EVs調(diào)控的細胞間通訊過程［8］。miRNAs是一類長度為18～25 bp的非編碼RNA［9］，在多種疾病的進展中發(fā)揮關鍵調(diào)控作用［10,11］。同時，miRNA也是外泌體轉(zhuǎn)導細胞間信號所攜帶的常見“貨物”，研究顯示，黑色素瘤細胞系可分泌攜帶有miR-155-5p的外泌體誘導成纖維細胞向腫瘤相關成纖維細胞轉(zhuǎn)化［12］。而在OSF中，攜帶miR-155的外泌體是否調(diào)控巨噬細胞與BMFs間的細胞通訊目前尚無報道。miR-155已被證實在肝、腸、腎等多個臟器的纖維化過程中表達上調(diào)，并具有促進纖維化的作用［13,14］，而有關miR-155對OSF的影響目前罕見報道。本研究旨在探討miR-155在OSF中的作用及機制，為OSF的臨床治療提供新的思路與靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 人外周血單核細胞（THP-1）購自中國科學院上海細胞庫；人口腔黏膜成纖維細胞（HOMF）由南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院急診科李旭教授課題組惠贈。

1.1.2 主要試劑耗材與儀器 無水乙醇、甲醇（廣州化學試劑廠）；胎牛血清、青鏈霉素雙抗、DMEM高糖培養(yǎng)基、MEM 培養(yǎng)基、PBS 緩沖液（Gibco）；miR-155-5p mimics、miR-155-5p inhibitor、si-SOCS1（銳博生物），RNA提取試劑盒、RT-qPCR檢測試劑盒（諾唯贊生物科技股份有限公司）；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度檢測試劑盒（碧云天生物技術有限公司）；活性氧ROS檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；CD80流式抗體、CD86 流式抗體、兔抗人α-SMA 抗體、兔抗人I 型Collagen抗體、兔抗人SOCS1抗體、山羊抗兔熒光二抗（Abcam）；細胞培養(yǎng)瓶、細胞培養(yǎng)皿、細胞培養(yǎng)板、Transwell培養(yǎng)小室（Corning）；結晶紫粉末（Sigma）；近紅外掃描儀（Odessey）；超高速離心機（Beckman）；正置相差顯微鏡（奧林巴斯BX-51）；倒置相差顯微鏡（奧林巴斯BX-63）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) THP-1細胞及HOMF細胞以DMEM高糖培養(yǎng)基（10%FBS、1%青鏈霉素雙抗）進行常規(guī)培養(yǎng)。研究分為3組：空白對照組：不接種THP-1細胞；對照組：接種未處理THP-1細胞；ARE刺激組：接種預先以ARE 刺激24 h 的THP-1 細胞，細胞孵箱溫度設定37 ℃、CO2濃度50 ml/L。HOMF 細胞鋪滿培養(yǎng)表面75%～85%時，以胰酶消化傳代。

1.2.2 外泌體提取 將各組THP-1細胞完成相應處理后，更換由無外泌體血清配制的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集各組細胞培養(yǎng)上清，以1200 r/min離心10 min后，取上清繼續(xù)以2000 r/min離心30 min，離心完成后仍留取上清，以20 000 r/min離心70 min，吸棄上清并以PBS重懸沉淀，繼續(xù)以20 000 r/min離心70 min，離心完成后收集沉淀即為所提取的THP-1細胞外泌體。以PBS重懸后進行NTA檢測并進行與HOMF細胞的共培養(yǎng)實驗，或加入RNA提取試劑以提取外泌體RNA進行后續(xù)研究。

1.2.3 RT-qPCR檢測細胞中mRNA、miRNA水平 參照諾唯贊公司柱提法RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞總RNA，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1μg RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，隨后在體系內(nèi)加入相應引物及熒光染料，以RT-qPCR檢測α-SMA、I 型膠原、miR-155-5p 和U6 等基因的表達水平。以U6基因為內(nèi)參，以2-ΔΔCt法對目標mRNA/miRNA的表達進行測定。U6、α-SMA、I型膠原、SOCS1等引物由上海生工公司合成，miR-155-5p mimics 與inhibitor序列、SOCS1過表達質(zhì)粒由廣州銳博生物合成。

1.2.4 Western blot檢測各組細胞中相關蛋白表達水平將完成相應處理的細胞以無菌PBS 洗滌3 次，加入RIPA蛋白裂解液進行充分勻漿后離心，留取離心后上清蛋白溶液，以BCA法檢測蛋白濃度后，向蛋白溶液中加入loading buffer并煮沸變性。以20～30 μg上樣量將總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳，待目的蛋白所在條帶完成分離后，切取目的條帶所在凝膠，以濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜以5%BSA溶液于37 ℃恒溫封閉30 min，隨后加入對應一抗并于4 ℃環(huán)境孵育過夜（各種抗體稀釋比例均為1∶1500）。孵育完成后以TBST溶液洗滌3次并加入山羊抗兔熒光二抗（稀釋比例為1∶10 000），繼續(xù)于37 ℃恒溫搖動孵育1 h，孵育完成后TBST溶液洗滌3次后，于近紅外掃描儀中進行掃描顯色。

1.2.5 Transwell 細胞遷移實驗 將完成相應處理的THP-1細胞接種于Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)下室，以0.25%胰酶將HOMF細胞消化、離心，以無血清培養(yǎng)基重懸后計數(shù)，調(diào)整細胞濃度至1×105/mL，在每個Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)上室內(nèi)接種100 μL的HOMF細胞懸液，隨后將培養(yǎng)系統(tǒng)置于37 ℃恒溫孵箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。培養(yǎng)完成后取出小室并浸入4%甲醇溶液內(nèi)，室溫固定30 min；固定完成后以PBS浸泡3次，以棉簽小心擦去小室內(nèi)表面未遷移細胞，隨后將小室置入結晶紫染液中染色15 min；染色完成后再次以PBS浸洗3次，于倒置顯微鏡下拍照并計數(shù)各組HOMF遷移至Transwell小室下表面的細胞數(shù)目。

1.2.6 活性氧檢測 參照南京建成活性氧檢測試劑盒說明書，以無血清培養(yǎng)基溶解DCFH-DA探針，檢測前對提前種植于24孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)的待檢測細胞進行換液處理，隨后加入已稀釋的DCFH-DA探針培養(yǎng)基，37 ℃孵育1 h后，酶標儀設定激發(fā)波長500 nm，檢測各組細胞于525 nm波長處發(fā)射的熒光數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad prism7軟件進行統(tǒng)計繪圖，所有數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用非配對雙尾t檢驗比較獨立兩組間數(shù)據(jù)差異，采用單因素方差分析比較兩兩數(shù)據(jù)組間差異，P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 檳榔堿可誘導THP-1 向M1 型極化但不增強HOMF的纖維化表型

觀察THP-1細胞經(jīng)ARE處理后由半貼壁生長轉(zhuǎn)向貼壁生長，部分細胞突起較明顯并含較大顆粒，細胞由M0趨向M1極化（圖1A）。予ARE刺激后，THP-1內(nèi)CD80 和CD86 陽性細胞比例顯著增加（圖1B）。Transwell細胞培養(yǎng)結果顯示，對照組與ARE組遷移至小室下表面的細胞數(shù)量無明顯差異（圖1C）。qRT-PCR結果顯示，與對照組相比，ARE處理后HOMF細胞內(nèi)α-SMA與I型膠原蛋白mRNA水平并無顯著差異[(1.03±0.08vs1.04±0.12；1.17±0.08vs1.18±0.19)，P=0.93，P=0.97，圖1D]。WB結果顯示，與對照組相比，ARE處理后HOMF細胞內(nèi)α-SMA與I型膠原蛋白表達水平并無顯著差異（圖1E）。

圖1 檳榔堿對THP-1和HOMF細胞表型的影響Fig.1 Effects of arecoline on phenotypes of THP-1 and HOMF cells.A: Morphological changes of THP-1 cells stimulated by ARE(Original magnification: ×200).B: Surface antigen of THP-1 macrophages stimulated by ARE detected by flow cytometry.C:Transwell cell culture system showing similar cell migration ability between the control group and ARE group(×400).D,E:mRNA and protein expressions of α-SMAand type I collagen was detected by PCR and Western blotting.

2.2 ARE刺激后的THP-1細胞可增強HOMF的纖維化表型

在Transwell 培養(yǎng)系統(tǒng)的上、下室中分別接種HOMF細胞和經(jīng)相應處理的THP-1細胞，共培養(yǎng)12 h后，觀察上室HOMF細胞的遷移情況。結果顯示，與空白對照組（下室中不接種THP-1細胞）和對照組（下室中接種未處理THP-1細胞）相比，ARE刺激組（下室中接種預先以ARE刺激24 h的THP-1細胞）上室內(nèi)HOMF細胞遷移數(shù)量增加（圖2A）。分別提取對照組及ARE刺激24 h組THP-1細胞外泌體與HOMF細胞共培養(yǎng)24 h，以PCR及WB方法檢測HOMF細胞內(nèi)α-SMA和I型膠原表達水平。結果顯示，ARE刺激組HOMF細胞內(nèi)α-SMA和I型膠原的mRNA及蛋白表達均較對照組顯著升高（1.90±0.08vs3.17±0.08；3.19±0.05vs5.65±0.01，P＜0.05，圖2B、C）。

圖2 檳榔堿通過THP-1促進HOMF的纖維化表型Fig.2 ARE promotes HOMF fibroblast phenotype through THP-1 cells.A: Transwell assay for detecting the effect of THP-1 on HOMF migration after ARE stimulation (×200).B: Transcription levels of α-SMA and type I collagen in HOMF detected by RT-qPCR.C:Expression levels of α-SMA and type I collagen proteins in HOMF detected by Western blotting.*P＜0.05 vs blank group,#P＜0.05 vs control group.

2.3 檳榔堿通過THP-1細胞的外泌體促進HOMF細胞的纖維化表型

提取對照組及ARE刺激組THP-1細胞外泌體及無外泌體上清，NTA分析顯示兩組細胞外泌體顆粒大小及數(shù)量無顯著差異（圖3A）。將HOMF 細胞分別與ARE刺激24 h后的THP-1細胞培養(yǎng)上清、THP-1細胞外泌體以及THP-1 細胞無外泌體上清進行共培養(yǎng)。Transwell結果顯示，與無外泌體上清組相比，ARE刺激后THP-1細胞培養(yǎng)上清組和外泌體組穿膜HOMF細胞數(shù)目均顯著增多（圖3B）。提取上述各組HOMF細胞總RNA及總蛋白，分別進行PCR與Western blotting檢測，結果顯示：與無外泌體上清組相比，全培養(yǎng)上清或外泌體刺激組HOMF 細胞內(nèi)α-SMA 及I 型膠原蛋白的mRNA及蛋白表達水平顯著升高(1.00±0.02vs13.17±0.08；1.00±0.07vs15.65±0.01，P＜0.05，圖3C、D）。分別提取ARE刺激前后THP-1細胞、THP-1外泌體以及經(jīng)THP-1外泌體刺激后的HOMF細胞總RNA，檢測miR-155-5p水平。結果顯示，ARE刺激后THP-1及外泌體內(nèi)miR-155-5p 水平較對照組顯著升高[(1.00±0.02vs5.84±0.08；1.00±0.02vs14.17±0.92，P＜0.05，圖3E、F]；同時，ARE刺激后THP-1所分泌的外泌體可顯著上調(diào)HOMF細胞內(nèi)miR-155-5p 水平（3.51±0.08vs11.24±0.08，P＜0.05，圖3G）。

圖3 檳榔堿經(jīng)THP-1外泌體途徑調(diào)控HOMF表型及胞內(nèi)miR-155-5p水平Fig.3 Arecoline regulates HOMF phenotype and intracellular miR-155-5p through THP-1 exosome pathway.A:NTA detection of THP-1 exosomes before and after ARE stimulation.B:Transwell cell migration assay for detecting HOMF migration(×200).C:Transcription levels of α-SMA and type I collagen in HOMF detected by RT-qPCR.D:Expression level of α-SMA and type I collagen proteins in HOMF detected by Western blotting.E-G:miR-155-5p level detected by RT-qPCR.*P＜0.05 vs NES group,#P＜0.05 vs control group.

2.4 miR-155-5p 介導ARE 經(jīng)THP-1 外泌體途徑對HOMF細胞成纖維表型的調(diào)控

構建miR-155-5p 模擬物和抑制物（miR-155-5p mimics和miR-155-5p inhibitor）并轉(zhuǎn)染HOMF細胞，檢測二者對HOMF細胞內(nèi)miR-155-5p水平的影響（1.10±0.19vs20.90±1.58;1.05±0.11vs0.08±0.01，P＜0.05，圖4A、D）。Transwell檢測轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics后HOMF細胞遷移能力，結果顯示：與NC組相比，轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics組HOMF細胞遷移能力顯著增強，而轉(zhuǎn)染miR-155-5p inhibitor組HOMF細胞在與ARE刺激后THP-1細胞外泌體共培養(yǎng)時的遷移能力則較NC組顯著下降（圖4B,E）。PCR結果顯示，轉(zhuǎn)染miR-155-5p inhibitor組HOMF細胞在與ARE刺激后THP-1細胞外泌體共培養(yǎng)后，細胞內(nèi)α-SMA及I型膠原蛋白mRNA水平較NC組顯著下調(diào)（5.84±0.08vs2.00±0.98；7.32±0.51vs2.33±0.43，P＜0.05，圖4F）。而WB檢測結果顯示，轉(zhuǎn)染miR-155-5p mimics組HOMF較NC組α-SMA及I型膠原蛋白表達顯著上調(diào)（圖4C）；轉(zhuǎn)染miR-155-5p inhibitor則可顯著下調(diào)與ARE刺激后THP-1細胞外泌體共培養(yǎng)的HOMF細胞內(nèi)α-SMA及I型膠原蛋白表達水平（圖4G）。

圖4 miR-155-5p是ARE經(jīng)THP-1外泌體誘導HOMF細胞纖維化表型的關鍵分子Fig.4 miR-155-5p is a key molecule in fibrotic phenotype of HOMF induced by exosomes from AREstimulated THP-1 cells.A,D:Levels of miR-155-5p in HOMF detected by RT-qPCR.B,E:Transwell for detecting HOMF migration(×200).C,G:Expression level of α-SMA and type I collagen protein in HOMF detected by Western blotting.F:Transcription levels of α-SMA and type I collagen in HOMF detected by RT-qPCR.*P＜0.05 vs Control group,#P＜0.05 vs NC-ARE group.

2.5 檳榔堿誘導的THP-1外泌體通過抑制HOMF細胞內(nèi)SOCS1表達而上調(diào)胞內(nèi)ROS水平并促進HOMF細胞纖維化表型

PCR及WB結果顯示，與對照組（不加外泌體刺激或加入未經(jīng)ARE誘導的THP-1外泌體）相比，經(jīng)ARE誘導的THP-1外泌體刺激組HOMF細胞內(nèi)SOCS1的mRNA和蛋白水平顯著下調(diào)（1.08±0.06vs0.34±0.02，P＜0.05，圖5A、B）。與對照組相比，經(jīng)ARE誘導的THP-1外泌體刺激組HOMF細胞內(nèi)ROS水平顯著上調(diào)（圖5C）。過表達SOCS1可顯著抑制ARE誘導的HOMF細胞內(nèi)ROS堆積和α-SMA、I型膠原蛋白的表達（4.41±0.55vs2.08±0.33；2.03±0.10vs1.23±0.11，P＜0.05，圖5E～H）。

圖5 SOCS1是ARE刺激后THP-1細胞外泌體誘導HOMF成纖維表型增強的重要靶點Fig.5 SOCS1 is an important target for enhancing HOMF fibroblast phenotype induced by exosomes from ARE-stimulated THP-1 cells.A,D-F:mRNA levels detected by RT-qPCR.B,H:Expression levels of SOCS1,α-SMA and type I collagen proteins in HOMFs detected by Western blotting.C,G:ROS levels in HOMFs measured using DCFH-DA kit(×100).&P＜0.05 vs Control group,*P＜0.05 vs ARE EXO group,#P＜0.05 vs Ctr EXO group.

3 討論

目前研究認為，病理性纖維化與慢性炎癥密切相關。盡管已有研究證實檳榔堿可能通過誘導炎癥細胞因子的分泌，促進成纖維細胞增殖［15］，但檳榔堿調(diào)控炎癥細胞的潛在機制及其對下游成纖維細胞的影響方式目前尚未完全闡明。本研究證實檳榔堿可通過THP-1細胞所分泌的外泌體途徑上調(diào)HOMF細胞中miR-155-5p水平，進而增強HOMF細胞活性。機制研究結果表明，經(jīng)檳榔堿刺激后的THP-1外泌體被HOMF攝取后，外泌體內(nèi)miR-155-5p 可通過抑制HOMF 細胞內(nèi)SOCS1 蛋白的表達導致細胞內(nèi)氧化還原失衡，引起HOMF細胞內(nèi)ROS水平的升高，最終導致HOMF細胞的進一步活化。鑒于此前報道的抑制人胚肺成纖維細胞中miR-155-5p水平，可通過恢復Smad5基因的表達，減少細胞增殖、促進細胞凋亡并抑制胞內(nèi)I型和III型膠原蛋白的生成［16］，本研究可能為闡明檳榔所誘導的口腔黏膜炎癥及黏膜下纖維化相關機制提供新證據(jù)。

miRNA可通過結合于基因的3’UTR區(qū)域來參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄；此外，miRNA還可募集RNA相關沉默復合物以誘導靶標mRNA的降解，在轉(zhuǎn)錄后水平抑制相關蛋白的表達。因此，miRNA在維持組織與細胞的生理功能方面具有重要作用，并可參與多種病理過程的調(diào)控。在口腔黏膜下纖維化方面，Padacherri等［17］對OSF中miRNA的表達改變進行了綜述，在OSF中發(fā)現(xiàn)了13個miRNAs的表達缺失，共有371個實驗驗證的基因被證明與OSF相關的miRNAs相互作用，miRNA及其靶基因的失調(diào)說明了miRNA在纖維化中的生理作用。由此可見，miRNA對OSF病變過程的調(diào)控可能具有重要意義。

miR-155是位于染色體21q21上的非編碼基因，可調(diào)控多種下游靶基因參與細胞的增殖、凋亡等過程，是最早被研究的miRNA 之一［16］。目前研究認為，miR-155-5p是一種促纖維化因子，在多種纖維化相關疾病的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。miR-155-5p通過抑制SIRT1信號通路促進梗阻性腎病腎間質(zhì)纖維化［18］。敲除miR-155可減輕肺纖維化模型小鼠的纖維化水平［19］。此外，抑制miRNA-155可通過減少巨噬細胞炎癥減弱內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的心肌梗死后心肌細胞凋亡［20］。研究進一步證實miR-155在心梗后的心肌纖維化過程中同樣發(fā)揮重要作用［21］。miR-155可通過對TP53INP1表達的調(diào)控，誘導心肌成纖維細胞的表型轉(zhuǎn)化并抑制其凋亡，從而促進心臟成纖維細胞增殖及膠原合成，加重心肌纖維化與重構。本研究中發(fā)現(xiàn)與上述研究一致的現(xiàn)象，即miR-155-5p可通過靶向SOCS1促進HOMF細胞向成纖維表型轉(zhuǎn)化。本研究中還值得關注的是檳榔堿并非直接改變HOMF細胞內(nèi)miR-155-5p水平，而是通過上調(diào)THP-1細胞外泌體中miR-155-5p后，由HOMF細胞攝取外泌體而間接上調(diào)HOMF細胞內(nèi)miR-155-5p，引起細胞內(nèi)氧化還原失衡并最終向活化表型轉(zhuǎn)化。

外泌體在調(diào)控細胞間信號轉(zhuǎn)導、物質(zhì)轉(zhuǎn)運等方面的作用正受到越來越多研究人員的關注。外泌體中所包含的種類豐富的miRNA不僅參與細胞生物功能的調(diào)控，還為疾病診斷和預后評估提供了潛在生物標志物［22］。研究發(fā)現(xiàn)miR-155 可在耐藥細胞中的外泌體內(nèi)富集，并跟隨外泌體轉(zhuǎn)移到乳腺癌細胞［23］。急性肺損傷小鼠的血清外泌體可以將miR-155 傳遞到巨噬細胞，分別通過靶向SHIP1 和SOCS1 促進巨噬細胞增殖和炎癥［24］。

本研究中，我們首次證實檳榔堿可誘導THP-1細胞分泌富含miR-155-5p的外泌體，該外泌體可進一步被HOMF細胞攝取并促進細胞向成纖維表型轉(zhuǎn)化。這一發(fā)現(xiàn)拓展了檳榔堿誘導OSF的發(fā)病機制，口腔黏膜下炎癥細胞與口腔成纖維細胞間外泌體通訊可能是治療檳榔堿相關OSF的新靶點。