胡 盼，程 瑤，王遠(yuǎn)迎，茍小琴，劉 華，左 麗，吳 寧

貴州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院1生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，2實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，3免疫教研室，貴州 貴陽550004

登革病毒（DENV）是黃病毒科的RNA病毒，可編碼膜蛋白（prM）、包膜蛋白（E）和衣殼蛋白（C）3種結(jié)構(gòu)蛋白和NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B 和NS5七種非結(jié)構(gòu)蛋白［1］。DENV 可分為4 種血清型，即DENV-1、DENV-2、DENV-3和DENV-4［2］，其中DENV-2是最主要的血清型［3］。DENV主要在伊蚊居住的地區(qū)快速傳播，可引起輕度癥狀的登革熱（DF）或嚴(yán)重的登革出血熱（DHF）甚至是危及生命的登革休克綜合征（DSS）［4-6］。據(jù)估計(jì)，有36億人口居住在DF傳播風(fēng)險(xiǎn)的區(qū)域，其中我國(guó)有將近28個(gè)省份受到DF的威脅［7］，主要區(qū)域?yàn)槲髂虾蜄|南沿海地區(qū)以及海南省。2014年廣東地區(qū)DENV 感染數(shù)是2013 年感染的10 倍，累計(jì)報(bào)告DENV感染數(shù)高達(dá)四千多例，死亡病例6例［8］。兒童和青少年受病毒感染病例呈指數(shù)增長(zhǎng)［9］。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，截止2019年DF被認(rèn)為是威脅全球健康的十大因素之一。

DENV 感染是一個(gè)極其復(fù)雜的過程，目前認(rèn)為DENV發(fā)病機(jī)制與抗體依賴增強(qiáng)作用（ADE）、非結(jié)構(gòu)蛋白1（NS1）病毒抗原、登革病毒基因組變異和亞基因組RNA等相關(guān)［10］。但目前對(duì)DENV的感染機(jī)制尚存在爭(zhēng)議，由于感染機(jī)制的不明，因此仍然沒有有效疫苗可用，雖然已有登革熱疫苗正在被研發(fā)，但目前并沒有疫苗或藥物被FDA認(rèn)可［11-14］。

蛋白質(zhì)組學(xué)在多種疾病和病毒的研究中被廣泛運(yùn)用，而磷酸化修飾是研究最廣泛的翻譯后修飾，在蛋白質(zhì)的激活和失活、調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、粘附和細(xì)胞通訊中發(fā)揮作用［15］。因此，通過磷酸化TMT 蛋白質(zhì)組學(xué)探究DENV-2感染HUVEC過程中磷酸化蛋白質(zhì)可能的調(diào)控機(jī)制，對(duì)DENV-2的發(fā)病機(jī)制研究具有重要意義。本研究采用TMT定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)，利用相關(guān)生物信息學(xué)分析手段，為DENV-2的致病機(jī)制研究提供了新的見解。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

HUVEC、C6/36和DENV-2 NGC株均由實(shí)驗(yàn)室常規(guī)保存。

1.2 材料與儀器

ECM 培養(yǎng)基（Sciencell）；ECGS（Sciencell）；FBS（Sciencell）；RPMI 1640培養(yǎng)基（Gibco）；p-AΚT1（Abcam），p-JUN（Abcam），p-MEΚ2（Abclonal），β-actin（Abclonal）。

數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（上海天能）；超凈工作臺(tái)（蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司）；SDS-Acryl/Bis蛋白電泳儀（上海天能）。

1.3 HUVEC細(xì)胞和C6/36細(xì)胞的培養(yǎng)

取液氮保存的HUVEC和C6/36，置于37 ℃水浴鍋中快速融化，再將細(xì)胞分別轉(zhuǎn)移至盛有5 mL ECM完全培養(yǎng)基（10%FBS，1%ECGS，1%P/S）的培養(yǎng)瓶和5 mL 1640完全培養(yǎng)基（10%FBS，1%P/S）的培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。直到細(xì)胞生長(zhǎng)至90%融合度時(shí)，加入適量0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，1000 r/min，10 min 收集細(xì)胞，重懸后在培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 DENV-2的擴(kuò)增、鑒定與毒力測(cè)定

1.4.1 DENV-2的擴(kuò)增 待C6/36細(xì)胞長(zhǎng)成90%左右融合。棄去細(xì)胞培養(yǎng)液后加入DENV-2毒液500 μL，置于28 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h，搖晃1次/15 min，去掉毒液后用Hanks液洗滌2次，加入5 mL 2%維持液（2%FBS，1%P/S）置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察現(xiàn)象，若出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變現(xiàn)象即空泡拉絲，即可收集毒液。收毒：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于-80 ℃中，流水沖淋手搖至沙冰狀，重復(fù)3次。液體收集于離心管中，2000 r/min，離心10 min，收集上清分裝于凍存管中，凍于-80 ℃，然后轉(zhuǎn)移到液氮中保存。

1.4.2 DENV-2的鑒定 根據(jù)NCBI提供的DENV2 NSl區(qū)核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，利用常規(guī)Trizol法提取C6/36總RNA，試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA 后經(jīng)PCR 特異性擴(kuò)增，普通瓊脂糖凝膠確定擴(kuò)增部分序列大小為321 bp。

IoT更高級(jí)別的安全防護(hù)都是以密碼學(xué)為基礎(chǔ)的，而當(dāng)前安全密鑰的創(chuàng)建與分發(fā)都是過度依賴集中式的基礎(chǔ)設(shè)施，而這類設(shè)施極易成為黑客攻擊的首選目標(biāo)，成為威脅IoT系統(tǒng)安全的重要因素?；趨^(qū)塊鏈的去中心化密鑰基礎(chǔ)設(shè)施可以更好地保障系統(tǒng)密鑰的安全，為IoT密鑰的創(chuàng)建、管理和分發(fā)提供魯棒性更強(qiáng)、容錯(cuò)率更高的安全保障。

1.4.3 DENV-2的毒力測(cè)定 將C6/36細(xì)胞接種到96孔板中，28 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。將病毒液用無血清1640培養(yǎng)基進(jìn)行梯度稀釋（10-3～10-10），共8個(gè)濃度，向C6/36細(xì)胞中加入適量不同濃度的病毒液，每個(gè)濃度設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，棄上清，PBS洗滌2次，每孔添加200 μL 2%維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察并記錄細(xì)胞病變，5 d后統(tǒng)計(jì)各稀釋度病變孔數(shù)量，設(shè)置空白對(duì)照；根據(jù)Reed-Muench 法計(jì)算DENV2對(duì)C6/36細(xì)胞的毒力。

1.5 DENV-2感染HUVEC

HUVEC細(xì)胞棄掉培養(yǎng)基，加入適量DENV-2毒液（109TCID50），放入37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中，搖晃1次/30 min，重復(fù)4次，最后1次將上清倒出，加入足量的2%維持液并放回培養(yǎng)箱中。

1.6 樣品質(zhì)譜分析

SDT裂解法提取蛋白質(zhì)后進(jìn)行BCA蛋白質(zhì)定量，胰蛋白酶酶解后用TMT 標(biāo)記試劑盒對(duì)定量的肽段進(jìn)行標(biāo)記，隨后采用High-SelectTMFe-NTA Phosphopeptides Enrichment Κi試劑盒富集磷酸化肽段，富集后的肽段采用HPLC 液相系統(tǒng)Easy nLC 進(jìn)行分離，經(jīng)色譜分離后用Q-Exactive 系列質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.7 生物信息學(xué)分析

1.7.1 蛋白質(zhì)聚類分析和保守基序分析 對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行歸一化處理后采用層次聚類算法對(duì)差異表達(dá)磷酸化肽段進(jìn)行分組歸類，并以熱圖的形式展示。提取包含修飾位點(diǎn)及修飾位點(diǎn)上下游（+/-）6個(gè)氨基酸共計(jì)13 個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的序列信息，利用這些序列信息在MeMe網(wǎng)站軟件中預(yù)測(cè)可能存在的保守基序。

1.7.2 亞細(xì)胞定位和蛋白結(jié)構(gòu)域分析 采用CELLO方法進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，利用多重支持向量機(jī)的機(jī)器學(xué)習(xí)的方法對(duì)公共數(shù)據(jù)庫亞細(xì)胞定位信息已知的蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)建模，預(yù)測(cè)待檢索蛋白亞細(xì)胞定位信息。蛋白結(jié)構(gòu)域分析使用Pfam 數(shù)據(jù)庫，利用InterProScan 軟件包，以集成的方式從InterPro 數(shù)據(jù)庫運(yùn)行掃描算法對(duì)序列進(jìn)行功能表征，從而獲得目標(biāo)蛋白序列在Pfam 數(shù)據(jù)庫中的結(jié)構(gòu)域注釋信息。

1.7.3 GO功能注釋和ΚEGG通路注釋 利用Blast2GO對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行基因本體注釋，GO 功能注釋主要分為3 類：生物過程（BP），分子功能（MF）和細(xì)胞組分（CC）。利用ΚAAS 軟件，對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)集合進(jìn)行ΚEGG通路注釋。

1.7.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 基于STRING(http://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中的信息查找目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的直接和間接相互作用關(guān)系，并使用CytoScape 軟件（版本號(hào)：3.2.1）生成相互作用網(wǎng)絡(luò)并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.8 Western blot

從CO2培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞，棄掉上清，用預(yù)冷PBS清洗2～3次，細(xì)胞刮刮脫細(xì)胞，收集至離心管中離心，棄掉上清，再加入細(xì)胞裂解液，用移液槍反復(fù)吹打至蛋白析出，離心后分裝上清，保存于-80 ℃冰箱。通過BCA檢測(cè)蛋白濃度，采用SDS-PAGE分離。孵育抗體p-AΚT1、p-JUN、p-MEΚ2和β-actin過夜，再孵育二抗2 h后，進(jìn)行顯色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 DENV-2 感染HUVEC細(xì)胞的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析

將采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行鑒定與定量結(jié)果分析，磷酸化蛋白質(zhì)組鑒定到2477個(gè)修飾蛋白上的5745個(gè)可定量的磷酸化肽段和6730個(gè)可定量的磷酸化位點(diǎn)（表1）。在磷酸化的氨基酸中，絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸是影響蛋白質(zhì)磷酸化功能的主要氨基酸。對(duì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在絲氨酸處發(fā)生磷酸化的比列為89.3%，蘇氨酸處的為10.5%，酪氨酸處的為0.21%（圖1A）。在2477個(gè)磷酸化蛋白中，有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)及以上的蛋白有48.53%，其中SMRR2蛋白質(zhì)上含有高達(dá)366個(gè)修飾位點(diǎn)（圖1B）。每100個(gè)氨基酸修飾位點(diǎn)的平均分布為0.47（圖1C）。

表1 鑒定與定量結(jié)果統(tǒng)計(jì)表Tab.1 Statistics of identification and quantitative results

圖1 修飾位點(diǎn)分布分析圖Fig.1 Distribution analysis of the modification sites.A: S/T/Y phosphorylation modification site distribution ratio.B:Number distribution of phosphorylation modification sites.C:Distribution frequency map of phosphorylation modification sites.Among all the identified modified proteins,the average number of phosphorylation modification sites per 100 amino acids is 0.47.

利用Corrplot包和Pheatmap包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析和聚類分析。結(jié)果顯示DENV感染組與正常組相比，兩組之間的數(shù)據(jù)模式相似性較低，而組內(nèi)的數(shù)據(jù)模式相似性較高，因此可以有效區(qū)分組別，且能說明差異表達(dá)磷酸化肽段篩選能夠代表生物學(xué)處理對(duì)樣本的影響（圖2A、B）。為了分析不同組間具有表達(dá)差異的磷酸化蛋白，對(duì)鑒定到的2477個(gè)磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行差異篩選，1385 個(gè)顯著差異的磷酸化蛋白上檢測(cè)出2918 個(gè)差異顯著的修飾肽段（P＜0.05），其中有1346顯著個(gè)上調(diào)（FC＞1.2且P＜0.05），1572個(gè)顯著下調(diào)（FC＜0.83且P＜0.05）（圖2C）。同時(shí)為了直觀的比較組間磷酸化修飾肽段的顯著性差異，以表達(dá)差異倍數(shù)和P(t-test)兩個(gè)因素為標(biāo)準(zhǔn)繪制火山圖（圖2D）。

圖2 磷酸化組學(xué)差異蛋白數(shù)量分析Fig.2 Quantitative analysis of differentially phosphorylated proteins.A: Correlation coefficient diagram.B: Cluster analysis of differentially expressed phosphorylated peptides.C: Histogram of quantitative difference results of phosphorylated peptides.D:Volcano map.

2.2 氨基酸保守基序分析

利用MEME軟件進(jìn)行Motif分析，結(jié)果顯示，共得到49 個(gè)磷酸化保守基序，包括43 個(gè)pSer 基序和6 個(gè)pThr基序。[sPExxΚ]、[RxxsPE]和[sPRs]基序在磷酸化肽段富集最為顯著（圖4A）。在43 個(gè)pSer 基序中[x_S_Px]、[xG_S_x]和[Rxx_S_Px]基序占磷酸化修飾肽段比列最高，分別為770、240 和223 個(gè)（圖4B）。DENV-2感染組和正常組相比，上調(diào)的差異磷酸化蛋白的磷酸化肽段顯著富集的Motif 是[x_S_PxxxxΚ]、[Dxxx_S_Px]和[Lxx_S_Px]。而在下調(diào)的磷酸化蛋白肽段中顯著富集的是[x_T_Px]、[xL_S_Px] 和[xQx_S_Px]（圖3C）。

圖3 保守基序分析Fig.3 Conserved motif analysis.A: Predicted conservative motif enrichment statistics (top 20).B: Prediction of the number of phosphorylated modified peptides corresponding to motif (top 20).C: Up-regulated and down-regulated phosphorylated peptides are significantly enriched in the top 3 motifs.

2.3 亞細(xì)胞定位分析

利用亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件CELLO對(duì)所有差異表達(dá)的磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，并以餅狀圖形式展示各亞細(xì)胞器中的差異表達(dá)修飾肽段所屬蛋白質(zhì)數(shù)目（圖4）。1097、265、108、49和48個(gè)差異表達(dá)的磷酸化修飾肽段分別位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、細(xì)胞外和線粒體中，而位于其余部分如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、過氧化物酶體的磷酸化肽段有共11個(gè)。

圖4 差異表達(dá)修飾肽段所屬蛋白亞細(xì)胞定位餅圖Fig.4 Pie chart of subcellular localization of proteins to which the differentially expressed modified peptides belong.

2.4 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析

利用結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件Interproscan對(duì)差異表達(dá)修飾肽段所屬蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，RNA識(shí)別基序（又稱RRM、RBD或RNP結(jié)構(gòu)域）、蛋白激酶結(jié)構(gòu)域和PH結(jié)構(gòu)域富集到的差異磷酸化肽段最多，分別為48、43、和31（圖5A）。進(jìn)一步用Fisher精確檢驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)修飾所屬蛋白質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)域富集分析。結(jié)果顯示，14-3-3蛋白質(zhì)、PDZ域（也稱為DHR或GLGF）、連接組蛋白H1和H5家族、鈣調(diào)素同源結(jié)構(gòu)域和B盒鋅指結(jié)構(gòu)富集度最為顯著（圖5B）。

圖5 結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Domain analysis.A:Analysis of protein domains of differentially expressed modified peptides(top 20).B:Domain enrichment analysis diagram.

2.5 差異表達(dá)磷酸化蛋白的GO功能分類

受到調(diào)控的差異磷酸化蛋白參與了廣泛的細(xì)胞生物過程，注釋到了13 到25 個(gè)功能組（圖6A）。利用Fisher 精確檢驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)修飾所屬蛋白質(zhì)進(jìn)行GO功能富集分析。結(jié)果顯示在生物過程的范疇中，差異磷酸化蛋白質(zhì)在刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，含核堿基的小分子生物合成過程，NAD生物合成過程，轉(zhuǎn)運(yùn)體活性的正調(diào)節(jié)，煙酰胺核苷酸生物合成過程等重要生物學(xué)過程顯著富集，在分子功能分類中，蛋白質(zhì)結(jié)合，酶結(jié)合，核苷三磷酸酶調(diào)節(jié)活性，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合，鈣粘蛋白結(jié)合等分子功能顯著富集到了差異磷酸化蛋白。在細(xì)胞組分分類中，大多數(shù)磷酸化蛋白質(zhì)富集于突觸后，不對(duì)稱突觸，突觸后密度，突觸后特化，神經(jīng)元間突觸等（圖6B、D）。

圖6 GO功能分析圖Fig.6 GO function analysis diagram.A: GO annotation statistics of proteins to which the differentially expressed modified peptide belongs.B: GO function enrichment bubble diagram (biological process,BP)under biological process classification.C: GO function enrichment bubble diagram (MF) under molecular function classification.D: GO function enrichment bubble diagram (cellular component,CC) under cell component classification.

2.6 差異表達(dá)磷酸化蛋白的ΚEGG功能分類

結(jié)果顯示差異磷酸化蛋白質(zhì)多注釋于癌癥，RNA轉(zhuǎn)運(yùn)，內(nèi)吞，剪接體，肌萎縮側(cè)索硬化等生物合成途徑（圖7A）。采用Fisher 精確檢驗(yàn)對(duì)差異表達(dá)磷酸化蛋白質(zhì)進(jìn)行ΚEGG 通路富集分析。結(jié)果表明，差異表達(dá)的磷酸化蛋白質(zhì)在輔助因子生物合成、利什曼病、吞噬體和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移等重要通路中發(fā)生了顯著發(fā)化（圖7B）。

2.7 DENV感染后蛋白質(zhì)相互作用分析

基于STRING 數(shù)據(jù)庫，利用Cytoscape_v3.7.2 軟件，對(duì)所有差異表達(dá)的磷酸化蛋白構(gòu)建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖8A）。以1346個(gè)上調(diào)的差異磷酸化蛋白制作PPIΚEGG分析網(wǎng)絡(luò)圖，途徑富集分析顯示10條ΚEGG通路（P＜0.05，圖8B），分別為剪接體、內(nèi)吞作用、軸突導(dǎo)向、粘著、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)、胰島素信號(hào)通路、細(xì)菌侵入上皮細(xì)胞、耶爾森菌感染、癌癥中的蛋白多糖和腎細(xì)胞癌。以1572個(gè)下調(diào)的磷酸化蛋白制作PPIΚEGG分析網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)果顯示富集到RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、緊密連接、白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移、致病性大腸桿菌感染和志賀菌病五條ΚEGG通路（P＜0.05，圖8C）。在這些富集通路中，對(duì)三個(gè)蛋白進(jìn)行了Western bolt分析，分別是屬于活化蛋白1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子家族的JUN、MAP激酶家族的MAP2Κ2和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶之一AΚT1。結(jié)果顯示，在DENV-2感染后，與正常組相比，MAP2Κ2和AΚT1磷酸化水平均顯著上調(diào)，JUN磷酸化水平顯著下調(diào)，這與組學(xué)結(jié)果一致（圖8D）。

圖8 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析圖及Western blot結(jié)果分析統(tǒng)計(jì)圖Fig.8 Protein interaction network analysis chart and Western blotting results.A: The interaction network of proteins to which the differentially expressed modified peptides belong.B: Significantly upregulated differentially phosphorylated protein network interaction map.C:Significantly downregulated differentially phosphorylated protein network interaction map.D:Effects of DENV-2 on p-JUN,p-MAP2K2 and p-AKT1 expressions.**P＜0.01,***P＜0.001,****P＜0.0001.

3 討論

登革病毒屬于黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒［16］。我國(guó)首次經(jīng)病原學(xué)證實(shí)的登革熱流行發(fā)生于1978年的廣東省佛山市。我國(guó)東南沿海地區(qū)、西南地區(qū)和海南省為主要流行地區(qū)［17,18］。但由于對(duì)其致病機(jī)制認(rèn)識(shí)不足，仍然沒有公認(rèn)的藥物或疫苗可用［11,19］。本研究是對(duì)DENV-2感染HUVEC后的差異磷酸化蛋白進(jìn)行分析。磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)共檢測(cè)到1385個(gè)差異顯著的磷酸化蛋白質(zhì)上2918個(gè)差異顯著的磷酸化修飾肽段，其中1346 個(gè)肽段顯著上調(diào)和1572 個(gè)肽段顯著下調(diào)。Motif分析結(jié)果顯示，在上調(diào)的磷酸化肽段中，顯著富集到[x_S_PxxxxΚ]、[Dxxx_S_Px]和[Lxx_S_Px]保守基序，下調(diào)的磷酸化肽段中[x_T_Px]、[xL_S_Px]和[xQx_S_Px]顯著富集，結(jié)果提示富集到的Motif 在DENV-2感染的過程中可能發(fā)揮了重要作用。亞細(xì)胞定位分析結(jié)果提示大部分的差異磷酸化修飾肽段位于細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和質(zhì)膜中，已有研究表明，DENV主要通過網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞，病毒膜與囊泡膜融合后允許核衣殼釋放入細(xì)胞質(zhì)，從而釋放直接用于病毒翻譯的RNA［20-22］。病毒的蛋白合成主要發(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中［23］，所以我們推測(cè)在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等中檢測(cè)出的差異磷酸化肽段與DENV 感染相關(guān)。利用Interproscan軟件進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果提示DENV-2感染過程中，可能與14-3-3蛋白質(zhì)、PDZ域等相關(guān)。已有研究表明，14-3-3蛋白與抗病毒相關(guān)，14-3-3蛋白家族可以促進(jìn)MAD5易位到線粒體，從而促進(jìn)抗病毒［24］。PDZ結(jié)構(gòu)域通常存在于細(xì)胞質(zhì)和膜轉(zhuǎn)接器蛋白中，參與維持細(xì)胞間連接、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞過程，對(duì)病毒感染具有重要意義［25］。在GO富集和ΚEGG通路分析中發(fā)現(xiàn)DENV的感染可能與刺激反應(yīng)的調(diào)節(jié)，含核堿基的小分子生物合成過程、輔助因子生物合成、吞噬體和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移途徑密切相關(guān)。近年來對(duì)DENV感染致病機(jī)制的研究處于熱門，在Velandia-Romero ML等的研究中表明DENV感染與免疫細(xì)胞遷移有關(guān)，這與DENV誘發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)性疾病密切相關(guān)［26］。已有研究證明DENV感染可以調(diào)節(jié)自噬［27］。自噬能夠改變細(xì)胞脂質(zhì)代謝來產(chǎn)生ATP，從而為DENV的復(fù)制提供有效的環(huán)境，幫助DENV的復(fù)制穩(wěn)固進(jìn)行。而本課題組前期已經(jīng)證實(shí)DENV-2感染能誘導(dǎo)HUVEC發(fā)生自噬［28］，但確切感染機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

通過對(duì)上調(diào)差異蛋白和下調(diào)差異磷酸化蛋白進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，JUN、MAP2Κ2和AΚT1三個(gè)能調(diào)控自噬的蛋白引起了我們注意。JUN又稱c-JUN，是第1個(gè)被稱為轉(zhuǎn)錄因子的原癌基因［29］。c-JUN是活化蛋白1（AP-1）轉(zhuǎn)錄因子家族的關(guān)鍵成員，在細(xì)胞增殖、凋亡中發(fā)揮作用［30］。MAPΚ介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，MAP2Κ2是MAPΚ信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要組成部分，能與白介素一起調(diào)節(jié)細(xì)胞成熟、免疫應(yīng)答［31］。AΚT1屬于絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，在代謝調(diào)節(jié)、細(xì)胞增值、存活、生長(zhǎng)等過程中發(fā)揮作用［32-34］。AΚT通路在癌癥中是最常見的通路之一，癌癥中的增值和生存信號(hào)主要是通過AΚT/MAPΚ信號(hào)傳導(dǎo)的。Sun 等［35］研究證明，JUN 與自噬相關(guān)。JUN的下調(diào)增加了PI3Κ/AΚT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化，從而增強(qiáng)自噬的發(fā)生。除此之外，JUN還可以激活Beclin-1，上調(diào)LC3II，調(diào)控自噬［36］。本實(shí)驗(yàn)Western bolt 結(jié)果中，DENV 組p-JUN 顯著下調(diào)，提示DENV感染后自噬的發(fā)生可能與JUN有關(guān)。此外，有研究表明，在饑餓和姜黃素治療的反應(yīng)中，RAS-RAFMAP2Κ/MEΚ-MAPΚ/ERΚ信號(hào)通路對(duì)自噬起著積極調(diào)解作用［37］。Chen等［38］證明，siRNA介導(dǎo)的MAP2Κ2可以抑制Cory誘導(dǎo)的自噬，并表明MAP2Κ2在神經(jīng)元自噬的調(diào)節(jié)中是必須的。因此，本次實(shí)驗(yàn)上調(diào)的p-MAP2Κ2調(diào)節(jié)自噬的發(fā)生可能與此途徑相關(guān)。而AΚT是自噬的上游調(diào)節(jié)因子，AΚT通過激活mTORC1來調(diào)節(jié)自噬。此外，研究表明，ATG3可以通過AΚT/mTOR信號(hào)通路下調(diào)鹽霉素誘導(dǎo)的自噬對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制［39］。

本次研究可以說明DENV-2感染HUVEC的機(jī)制與調(diào)節(jié)自噬的JUN、MAP2Κ2和AΚT1具有一定關(guān)系，DENV-2 感染HUVEC 后，能夠調(diào)節(jié)p-MAP2Κ2、p-JUN和p-AΚT1的表達(dá)，已有研究證明JUN能夠調(diào)控AΚT，而AΚT 也能通過調(diào)控MAPΚ 從而調(diào)控癌細(xì)胞增值與生長(zhǎng)，但JUN、MAP2Κ2和AΚT1三者之間是否存在相互調(diào)控作用目前尚不清楚。因此，本課題組將在此研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步證明JUN、MAP2Κ2和AΚT1三者之間調(diào)控自噬的作用以及對(duì)DENV 致病機(jī)制的影響。