唐怡 ，周立分 ，嚴(yán)志宏 ，邵堅 （1.江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，南昌 000；.江西中醫(yī)藥大學(xué)實驗室服務(wù)中心，南昌 0004；.江中藥業(yè)股份有限公司，南昌 0096）

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Eillis的干燥成熟果實[1]，具有清熱、涼血、解毒的功效[2]。梔子苦寒，易傷脾胃，故入藥的梔子需炮制。從古至今，梔子的炮制品有生梔子、炒梔子、焦梔子、姜梔子、梔子炭、鹽梔子、蜜梔子、酒梔子、童便炒梔子、甘草水炒梔子等[3]。其中，酒梔子可以利用黃酒的性大熱、味甘辛、氣味芳香、能升能散的性質(zhì)緩解梔子的苦寒收斂，與其他炙法相比還可矯正苦寒、宣行藥勢[3―4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，梔子生品和炒制品以及梔子不同提取部位都具有保肝作用[5―6]，至于酒梔子是否也有保肝作用，目前尚不清楚?；诖?，本實驗采用水蒸氣蒸餾法提取生梔子和酒梔子中的揮發(fā)油，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀鑒定并比較梔子酒炙前后揮發(fā)油成分的變化，并以四氯化碳建立肝損傷大鼠模型，比較生梔子和酒梔子的保肝作用，以期為酒梔子的臨床應(yīng)用提供理論支持。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ME204T/02型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；L-500型低速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Agilent 8890型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）；AU480型全自動生化分析儀和AllegraTM64R型高速離心機（美國貝克曼庫爾特有限公司）；UV-1800型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；T10型分散機（德國艾卡公司）；BA410EF-UPR型顯微鏡（麥克奧迪實業(yè)集團有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

梔子藥材采集于江西樟樹天齊堂中藥材規(guī)范化種植基地，2021年9月果實成熟時采收，除去果柄及雜質(zhì)，沸水中略燙，取出，干燥，經(jīng)江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科唐莉華副主任中藥師鑒定為茜草科植物梔子G. jasminoides Ellis的干燥成熟果實。山西桂花黃酒[酒精度15%（V/V）]購自山西省四達(dá)酒類飲料有限責(zé)任公司；聯(lián)苯雙酯滴丸（批號A02130315，規(guī)格1.5 mg）購自萬邦德制藥集團股份有限公司；蘇木精-伊紅（HE）染液和丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20201215、2014121、20141025；腺苷脫氨酶（adenosine deaminase，ADA）、堿性磷酸酶（alkaline phospholipase，ALP）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、總蛋白（total protein，TP）、前白蛋白（prealbumin，PA）檢測試劑盒均購自南昌百特生物高新技術(shù)股份有限公司，批號分 別 為 141107、141015、141022、141013、141021、140930、140929、140519、141016、140910；二氯甲烷（分析純）購自西隴化工股份有限公司；無水硫酸鈉（分析純）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；四氯化碳、無水乙醇和甲醛均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；水為蒸餾水。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量（200±20）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004。

2 方法

2.1 藥材預(yù)處理

2.1.1 生梔子 稱取梔子藥材1 kg，研碎，過六號篩。

2.1.2 酒梔子 將生梔子與黃酒混合，拌勻，至酒盡，于180 ℃下炒制3 min左右，至藥材表面呈金黃色，取出，放涼。每500 g生梔子用100 g黃酒。

2.2 梔子酒炙前后揮發(fā)油成分的變化考察

2.2.1 揮發(fā)油成分提取 分別稱取生梔子或酒梔子粉末100 g，置于圓形揮發(fā)油提取器中，加6倍量蒸餾水浸泡過夜，后置于1 000 mL電熱套中，提取6 h至揮發(fā)油量不再增加為止。收集蒸餾液，置于分液漏斗中，取等量二氯甲烷萃取3次后，用無水硫酸鈉除水濃縮至1 mL左右，再用0.45 μm濾膜過濾，即得。經(jīng)計算，生梔子和酒梔子的揮發(fā)油質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.8、0.9 μL/g。

2.2.2 陰性對照溶液制備 精確移取5 mL黃酒于離心管中，加入3 mL二氯甲烷和1 g氯化鈉，4 000 r/min離心10 min，吸取下層相，同法再萃取1次，合并2次萃取液于15 mL離心管中。在離心管中加入約l g無水硫酸鈉，充分混勻，吸取有機層，濃縮至0.5 mL，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

2.2.3 氣相色譜條件 氣相色譜條件如下：采用石英毛細(xì)管柱（0.25 μm×250 μm×30.0 m），載氣為高純氦氣（99.999%），柱流速為1.0 mL/min，汽化室溫度為250 ℃。升溫程序如下：50 ℃保持15 min，以4 ℃/min升溫到130 ℃，再以10 ℃/min升溫到220 ℃，再以10 ℃/min升溫到280 ℃，保持10 min；分流比為50∶1，進(jìn)樣量為1.0 μL。

2.2.4 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜條件如下：采用電子轟擊離子源，電子能量為70 eV，質(zhì)量掃描范圍為m/z 50.00～500.00，柱箱溫度為40.0 ℃，進(jìn)樣溫度為280.0 ℃，進(jìn)樣模式為分流，流量控制模式為總流量14.0 mL/min、柱流量1.00 mL/min、吹掃流量3.0 mL/min，壓力為49.5 kPa，離子源溫度為200 ℃，接口溫度為250 ℃，四極桿溫度為230 ℃，檢測模式為全離子掃描監(jiān)測，溶劑延遲時間為3.5 min。

2.2.5 化合物鑒定 總離子流圖中的各色譜峰經(jīng)質(zhì)譜掃描后得到相應(yīng)的質(zhì)譜圖，經(jīng)過計算機質(zhì)譜數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索（質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫：NIST17庫），結(jié)合各個物質(zhì)的美國化學(xué)會的下設(shè)組織化學(xué)文摘社（Chemical Abstracts Service，簡稱CAS）號比對相關(guān)信息，確定其歸屬。

2.3 梔子酒炙前后保肝作用考察

2.3.1 藥液制備 稱取生梔子或酒梔子150 g，加10倍量55%乙醇回流2次，每次60 min[7]，趁熱抽濾，合并濾液，置于水浴鍋中蒸發(fā)，后恒溫減壓干燥處理，制成生梔子或酒梔子的凍干粉。臨用時，用蒸餾水將相應(yīng)凍干粉溶解制成所需濃度的藥液。

2.3.2 動物分組、給藥與建模 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為正常組，模型組，陽性對照組（聯(lián)苯雙酯混懸液35 mg/kg[5―6]），生梔子低、高劑量組[1、2 g/kg（以生藥量計）[5―6]]，酒梔子低、高劑量組[1、2 g/kg（以生藥量計）[5―6]]，每組10只。正常組和模型組大鼠灌胃蒸餾水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥液，給藥體積為0.02 mL/g，連續(xù)給藥7 d。末次給藥2 h后，除正常組外其余各組大鼠腹腔注射40%四氯化碳3 mL/kg[5―6]，建立肝損傷模型。

2.3.3 生化指標(biāo)檢測 大鼠注射給藥后，禁食不禁水16 h，觀察其狀態(tài)后眼球取血，2 000 r/min離心15 min，取上層血清，于4 ℃密封保存。采用AU480型全自動生化分析儀檢測各組大鼠血清中ADA、AST、ALT、ALP、LDH、TBA、TBIL、DBIL、TP、PA的水平。取血后脫頸處死大鼠，摘取肝組織。取部分肝組織制成勻漿，以2 000 r/min離心15 min，取上清液。按試劑盒說明書操作，采用紫外可見分光光度計檢測各組大鼠肝組織勻漿上清液中SOD和MDA的水平。

2.3.4 肝組織病理檢查 取剩余的肝組織用10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度約4.5 μm），脫蠟，用HE染色，脫水，光學(xué)樹脂膠封片，顯微鏡下觀察肝組織病理變化。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 梔子酒炙前后的揮發(fā)油成分

依據(jù)上述氣相色譜和質(zhì)譜條件，得生梔子、酒梔子和陰性對照溶液（黃酒）的總離子流圖（圖1）。在默認(rèn)的積分設(shè)置下，生梔子和酒梔子均檢測到100多個化合物，但有一部分化合物的匹配度非常低。本研究僅選取匹配度≥85%，相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞1%的化合物進(jìn)行鑒定，用峰面積歸一化法測定其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見表1。

表1 生梔子、酒梔子和黃酒的揮發(fā)油成分及其相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖1 生梔子、酒梔子、黃酒的揮發(fā)油的總離子流圖

3.2 梔子酒炙前后保肝作用比較

3.2.1 大鼠狀態(tài) 正常組和陽性對照組大鼠無明顯異常，狀態(tài)良好。模型組大鼠出現(xiàn)活動減少、成群蜷臥、弓背神萎、皮毛無光澤等萎靡癥狀；相比模型組，生梔子和酒梔子的各劑量組大鼠上述萎靡癥狀均有不同程度改善。

3.2.2 血清生化指標(biāo) 與正常組比較，模型組大鼠血清中ADA、ALP、ALT、AST、DBIL、LDH、PA、TBA、TBIL水平均顯著升高，TP水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠血清中ADA、ALT、AST、DBIL、LDH、PA、TBA、TBIL水平均顯著降低，TP水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），但各給藥組大鼠上述大部分指標(biāo)都沒有恢復(fù)到正常組水平。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果（±s，n＝10）

表2 各組大鼠血清生化指標(biāo)結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.01；b：與正常組比較，P＜0.05；c：與模型組比較，P＜0.01；d：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組生梔子高劑量組生梔子低劑量組酒梔子高劑量組酒梔子低劑量組TP/（g/L）64.88±3.08 53.88±2.88b 55.49±3.78bd 59.99±4.20bd 57.97±5.81bd 57.36±4.07bd 56.56±4.99bd ADA/（U/L）3.66±0.67 12.25±2.35a 3.83±0.67c 4.39±0.20bc 4.79±1.88bc 4.61±1.07bc 4.46±1.02dbc ALP/（U/L）231.81±24.06 304.91±56.07b 297.11±33.45b 289.33±70.62b 315.07±27.86b 308.11±54.33b 317.95±82.91b ALT/（U/L）62.19±17.89 1 200.10±192.46a 213.27±69.67ac 430.39±97.66ac 411.32±63.58ac 411.12±82.34ac 423.72±105.25ac AST/（U/L）154.33±24.73 2 442.15±385.64a 526.49±135.29ac 1 202.83±99.28ac 1 099.31±144.68ac 1 219.22±72.23ac 1 099.99±103.42ac DBIL/（μmol/L）0.22±0.02 5.14±0.65a 1.74±0.31ac 3.08±1.40ad 3.44±1.31ad 3.40±0.67ad 3.60±1.29ad LDH/（U/L）999.99±148.10 3 041.01±493.05a 1 529.49±381.71bc 1 441.59±353.83bc 1 684.96±219.32bc 1 818.34±368.02bc 1 659.78±289.64bc PA/（mg/mL）10.39±0.39 14.66±1.59b 10.08±1.08d 11.11±0.81d 10.78±1.34d 10.96±2.63d 11.87±2.83d TBA/（μmol/L）6.11±1.01 90.12±9.78a 59.59±10.48ad 69.28±8.06ad 78.23±10.97ad 68.33±8.55ad 76.65±11.40ad TBIL/（μmol/L）0.42±0.04 6.12±1.06a 2.14±0.11ac 3.88±0.19ac 3.59±0.74ac 4.22±0.42ad 4.30±1.01ad

3.2.3 肝組織生化指標(biāo) 與正常組比較，模型組大鼠肝組織中SOD水平顯著降低，MDA水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠肝組織中MDA水平均顯著降低（P＜0.05），SOD水平有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠肝臟中SOD和MDA水平測定結(jié)果（±s，n＝10）

表3 各組大鼠肝臟中SOD和MDA水平測定結(jié)果（±s，n＝10）

a：與正常組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05

組別正常組模型組陽性對照組生梔子高劑量組生梔子低劑量組酒梔子高劑量組酒梔子低劑量組MDA/（nmol/mg）1.68±0.07 2.75±0.21a 1.63±1.86b 1.32±0.12b 1.66±0.65b 1.01±0.27b 1.49±0.87b SOD/（U/mg）466.66±44.54 392.03±53.32a 376.12±84.04a 366.77±58.10a 326.01±77.55a 376.89±19.84a 333.33±69.96a

3.2.4 肝組織病理變化 正常組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、呈正常的放射狀整齊排列，細(xì)胞形態(tài)正常；模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)氣球樣變化，高度腫脹，多數(shù)細(xì)胞的胞漿內(nèi)有很大的空泡（肝細(xì)胞變性的特征），細(xì)胞核聚集且增多；各給藥組大鼠肝細(xì)胞變性較模型組均有不同程度的改善。顯微圖見圖2。

圖2 生梔子和酒梔子對模型大鼠病理改變的影響（HE，×200）

4 討論

4.1 梔子酒炙前后揮發(fā)油總離子流圖比較

從圖1可以看出，生梔子和酒梔子的揮發(fā)油總離子流圖較為相似。生梔子和酒梔子揮發(fā)油的差異主要集中在16.44～19.59、20.83～25.51、38.80～41.01 min。在這3個時間段，酒梔子揮發(fā)油的離子流強度均弱于生梔子揮發(fā)油，這可能與梔子經(jīng)酒炙后有些揮發(fā)油成分經(jīng)高溫破裂或隨著黃酒的加入一起揮發(fā)減少有關(guān)。另酒梔子揮發(fā)油和黃酒在4.88、7.43 min時均顯示有峰，而生梔子揮發(fā)油卻沒有顯示，且黃酒在此時間段的離子流強度高于酒梔子，結(jié)合表1發(fā)現(xiàn)，酒梔子和黃酒共有2個醇類成分，且酒梔子中的含量低于黃酒，說明這些成分可能來源于黃酒。

4.2 梔子酒炙前后揮發(fā)油成分變化

本實驗鑒定出了生梔子揮發(fā)油成分23個，酒梔子揮發(fā)油成分25個，黃酒揮發(fā)油成分2個，其中生梔子和酒梔子共有揮發(fā)油成分18個。生梔子炮制至酒梔子的過程中，有17個揮發(fā)油成分含量降低，這可能也與梔子經(jīng)酒炙后有些揮發(fā)油成分經(jīng)高溫破裂或隨者黃酒的加入一起揮發(fā)減少有關(guān)。另外，生梔子炮制至酒梔子的過程中，亞甲基異佛爾酮的含量升高，這可能是隨著炮制溫度的提高和黃酒的升散性質(zhì)，藥材組織變得蓬松，從而致使其含量升高。

4.3 梔子酒炙前后保肝作用比較

血清生化指標(biāo)結(jié)果顯示，生梔子和酒梔子均可顯著降低肝損傷模型大鼠的ADA、ALT、AST、DBIL、LDH、PA、TBA、TBIL水平，提高TP水平，可見生梔子和酒梔子具有明顯的降肝酶能力，還可改善肝臟蛋白質(zhì)合成功能，具有一定的保肝作用。

SOD作為體內(nèi)重要的自由基-超氧自由基的天然清除劑，是免除自由基損傷的主要防御酶，其水平高低可間接反映清除氧自由基的能力；MDA作為脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，其水平高低可間接反映機體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度，肝組織中二者水平能有效指示肝功能的狀況[8―10]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織中SOD水平顯著低于正常組，MDA水平顯著高于正常組，表明肝損傷建模成功。各給藥組大鼠肝組織中MDA水平顯著低于模型組。結(jié)合血清生化指標(biāo)、肝組織生化指標(biāo)和肝組織病理圖片，可知生梔子和酒梔子的各給藥組大鼠雖然大部分指標(biāo)都沒有恢復(fù)到正常組水平，但相比模型組，均有一定的肝保護(hù)作用。

綜上所述，生梔子炮制至酒梔子的過程中，有17個共有揮發(fā)油成分含量降低，有1個共有揮發(fā)油成分含量升高。酒梔子具有一定的保肝作用。