陳瑞鑫 ，蔣運(yùn)斌 ，陳文莉 ，康點點 ，李蕊 ，蔣桂華 ， （.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院/西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 67；.西南大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 40075；.成都中醫(yī)藥大學(xué)國學(xué)院，成都67）

獨一味為唇形科植物獨一味Lamiophlomis rotata（Benth.）Kudo的干燥地上部分，藏藥名為“達(dá)巴”，系藏族習(xí)用藥材，也常作為中藥使用。2020年版《中國藥典》載其具有活血止血、祛風(fēng)止痛的功效，可用于治療跌打損傷、風(fēng)濕痹痛、黃水病等。獨一味具有多種化學(xué)成分，主要包括環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯乙醇苷類以及多糖類[1]。黃酮類成分為廣泛存在于自然界植物中的次生代謝產(chǎn)物，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明該類成分具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、抗菌等多種藥理活性[2]。目前已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)獨一味黃酮類成分具有較好的抗血小板聚集活性[3]和抗炎作用[4]。結(jié)合獨一味功效，本課題組前期通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)獨一味黃酮類成分可能在其抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的過程中發(fā)揮了重要作用，特別是木犀草素[5]；且現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明木犀草素具有抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的活性[6]。為確證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果，本課題組前期基于佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果表明獨一味黃酮類成分是獨一味抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一[7]。

獨一味總黃酮具有潛在的藥效，但目前國內(nèi)外學(xué)者研究獨一味主要圍繞其環(huán)烯醚萜類成分進(jìn)行[8―9]，對其黃酮類成分的研究較為匱乏，不利于從中醫(yī)藥整體觀角度對獨一味質(zhì)量進(jìn)行評價和控制。為有效控制獨一味黃酮類提取物的質(zhì)量，本研究通過滲漉法提取、聚酰胺柱純化了15批不同產(chǎn)地獨一味的總黃酮，采用紫外分光光度法對其含量進(jìn)行測定，通過高效液相色譜（HPLC）法對其指紋圖譜進(jìn)行研究，并運(yùn)用化學(xué)計量學(xué)對不同產(chǎn)地獨一味總黃酮的質(zhì)量進(jìn)行評價，旨在為獨一味總黃酮質(zhì)量評價奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BP121S型電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]、DZKW-4型電子恒溫水浴鍋[中興偉業(yè)儀器（北京）有限公司]、RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器[亞榮生化儀器（上海）廠]、KQ-500VDE型雙頻數(shù)控超聲波清洗器[超聲儀器（昆山）有限公司]、UEF1010033型紫外-可見分光光度計[美譜達(dá)儀器（上海）有限公司]、Ultimate3000型HPLC儀[賽默飛世爾科技（美國）公司]。

1.2 主要藥品與試劑

木犀草苷對照品（批號MUST-21111817，純度≥99.0%）、木犀草素對照品（批號MUST-21072311，純度≥98.0%）均購于成都曼思特生物科技有限公司；蘆丁對照品（批號AF21020854，純度≥98.0%）購于成都埃法生物科技有限公司；甲醇、乙腈均為色譜純；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉及乙醇均為分析純；水為超純水。15批獨一味藥材經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院蔣桂華教授鑒定均為唇形科植物L(fēng). rotata（Benth.）Kudo的干燥地上部分，樣品來源信息見表1。

表1 獨一味樣品來源信息

2 方法與結(jié)果

2.1 獨一味總黃酮的制備

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[10]及前期工作基礎(chǔ)，取獨一味粉末100 g加入滲漉桶中，加入95%乙醇沒過粉末，靜置24 h后開始提取。95%乙醇適當(dāng)流速滲漉，收集滲漉液，于50 °C減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，待回收約30 mL時將濃縮的滲漉提取液與預(yù)處理的聚酰胺粉（50 g）混勻，50 °C水浴蒸干，上樣于已處理好的聚酰胺層析柱中，放置24 h。先以高純水（3倍柱體積）洗脫至無色，然后用70%乙醇溶液（14倍柱體積）洗脫，并收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮，即得獨一味總黃酮。

2.2 獨一味總黃酮的含量測定及純度計算

采用紫外分光光度法進(jìn)行獨一味總黃酮的含量測定，并計算其純度，含量測定方法參考2020年版《中國藥典》獨一味片總黃酮含量測定項方法。

2.2.1 供試品溶液的制備 取制備的獨一味總黃酮樣品50 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇30 mL，超聲（功率200 W，頻率60 kHz，下同）使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品10 mg，精密稱定，置于50 mL容量瓶中，加70%乙醇30 mL，超聲使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 線性關(guān)系的考察 準(zhǔn)確吸取對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別放入25 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液補(bǔ)充至10 mL，然后加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻后靜置6 min，加1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min，再加10 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液，用70%乙醇定容至25 mL，反應(yīng)15 min后，以相應(yīng)的溶液為空白參照，在其最大吸收波長處測定系列濃度下的吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)（X），吸光度為縱坐標(biāo)（Y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y＝10.674X，R2＝0.998 8，線性范圍為8.0～48.0 μg/mL。結(jié)果表明，當(dāng)蘆丁質(zhì)量濃度在8.0～48.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 獨一味總黃酮HPLC指紋圖譜研究

2.3.1 色譜條件 以 Waters Symmetry C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）為色譜柱；以乙腈（A）-0.2%甲酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～15 min，8%A→13%A；15～30 min，13%A；30～40 min，13%A→17%A；40～75 min，17%A→38%A；75～76 min，38%A→8%A；76～85 min，8%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為245 nm；進(jìn)樣量為10 μL。記錄75 min的色譜圖。

2.3.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取木犀草苷、木犀草素對照品各適量，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容，混勻，配制成0.3 mg/mL的對照品溶液，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.3 供試品溶液的制備 精密稱取獨一味總黃酮樣品0.1 g，置于25 mL容量瓶中，加甲醇超聲使溶解，定容，混勻，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.4 精密度考察 精密稱取樣品（S1）0.1 g，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.3.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果顯示，以木犀草苷為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD在0.06%～0.19%之間，相對峰面積RSD在0.14%～3.84%之間，表明儀器精密度良好。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 按照“2.3.3”項下方法制備供試品溶液（S1），分別在制備后在室溫放置0、4、8、12、18、24 h時按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，以木犀草苷為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD在0.07%～0.49%之間，共有峰相對峰面積RSD在0.05%～5.50%之間，表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.3.6 重復(fù)性考察 按照“2.3.3”項下方法平行制備6份供試品溶液（S1），按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示，以木犀草苷為參照峰，各共有峰相對保留時間RSD在0.04%～0.22%之間，相對峰面積RSD在0.55%～3.52%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.7 指紋圖譜的建立及樣品分析 按照“2.3.3”項下方法制備15批獨一味總黃酮供試品溶液，并按“2.3.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件。設(shè)置S4樣品圖譜為參照圖譜，選擇中位數(shù)法，時間窗口寬度為0.1 min，通過多點校正和Mark峰匹配生成指紋圖譜的疊加圖譜及對照指紋圖譜（R），結(jié)果見圖1；15批獨一味總黃酮中共確定了5個共有峰，其中3號峰為木犀草苷，詳見圖2。

圖1 15批獨一味總黃酮HPLC疊加圖譜及對照指紋圖譜（R）

圖2 獨一味總黃酮樣品和木犀草苷、木犀草素對照品的HPLC圖

由圖1顯示，3號峰（木犀草苷）是獨一味總黃酮中主要含有的成分，其苷元即為木犀草素。部分獨一味總黃酮色譜圖中雖出現(xiàn)了木犀草素的峰，但其峰面積較小。有些批次如S2、S9、S10獨一味總黃酮的色譜圖中未出現(xiàn)木犀草素的峰，這可能是由于天然黃酮類化合物多以苷類形式存在[11]，且有研究表明，黃酮苷類化合物口服后常被腸道菌群產(chǎn)生的水解酶代謝以苷元的形式吸收入血[12]。木犀草苷作為共有峰能為總黃酮質(zhì)量控制提供較大貢獻(xiàn)。

2.3.8 相似度評價 將15批獨一味總黃酮色譜圖導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）》軟件，計算其與對照指紋圖譜的相似度。結(jié)果顯示，S1～S15批次獨一味總黃酮與對照指紋圖譜的相似度分別為0.999、0.953、0.999、0.999、0.997、1.000、1.000、0.983、0.925、0.992、0.995、0.991、0.996、0.996、0.976，表明15批獨一味總黃酮的質(zhì)量穩(wěn)定，但仍然存在差異。

2.4 獨一味總黃酮的化學(xué)模式識別分析

2.4.1 聚類分析 以5個共有峰峰面積為變量，利用SPSS 20.0軟件，先對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，再采用組間平均數(shù)聯(lián)結(jié)法進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。當(dāng)判別距離為15時，15批獨一味總黃酮可聚為4類，S1、S3～S9為第1類，為青海省和西藏自治區(qū)樣品；S14、S15為第2類，均為云南省樣品；S10～S13為第3類，均為四川省樣品；S2為第4類，表明15批獨一味總黃酮的質(zhì)量存在一定的差異性，具有明顯地域性。

圖3 15批獨一味總黃酮的聚類分析圖

2.4.2 主成分分析 將15批獨一味總黃酮色譜圖中5個共有峰的相對峰面積導(dǎo)入SPSS 20.0軟件進(jìn)行主成分分析，分析得到的特征值及方差貢獻(xiàn)率見表2。根據(jù)特征值＞1，共提取到2個主成分，包含了樣品指紋圖譜中74.031%的信息。

表2 15批獨一味總黃酮的特征值及累計方差貢獻(xiàn)率

為更直觀地評價各產(chǎn)地獨一味總黃酮的質(zhì)量，采用方差貢獻(xiàn)率對15批獨一味總黃酮進(jìn)行綜合評價，主成分1和主成分2的得分計算公式分別為：y1＝0.549x1+0.476x2+0.399x3+0.534x4+0.196x5，y2＝－0.255x1+0.920x2－0.462x3+0.233x4+0.811x5，其中 y1和 y2代表主成分1、2 的得分，x1～x5為5個共有峰的峰面積，y1和y2的各項系數(shù)為主成分1、2的載荷值與特征值開平方的比值；按照公式“y＝0.513 54y1+0.226 77y2”計算綜合得分（y），y值越高表示獨一味總黃酮的質(zhì)量越好。結(jié)果見表3。由綜合得分排序和聚類分析可知，第1類和第4類即青海省和西藏自治區(qū)的獨一味總黃酮質(zhì)量較優(yōu)。

表3 15批獨一味總黃酮主成分分析綜合得分表

2.4.3 正交偏最小二乘法-判別分析 將15批獨一味總黃酮5個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件，通過正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares-discriminant analysis，OPLS-DA），根據(jù)其變量重要性投影（variable importance in the projection，VIP）參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖4。以VIP值＞1作為標(biāo)準(zhǔn)[13]，由圖可知，2、5、3號峰（木犀草苷）VIP值均大于1，表明這3個成分為導(dǎo)致15批獨一味總黃酮差異性的主要成分。

圖4 15批獨一味總黃酮OPLS-DA的VIP圖

3 討論

本課題組前期對相關(guān)文獻(xiàn)[11，14]記載的獨一味總黃酮提取方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)聚酰胺樹脂對獨一味總黃酮的吸附、解吸效果優(yōu)于D-101大孔樹脂。在此基礎(chǔ)上本研究結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)考察的洗脫條件提取了15批不同產(chǎn)地獨一味的總黃酮，通過紫外分光光度法測定其含量，計算得到15批獨一味總黃酮純度平均值為77.72%，表明15批獨一味總黃酮純度較高，可用于獨一味總黃酮指紋圖譜研究。15批獨一味總黃酮含量差異較大，可能是聚酰胺樹脂對不同類型黃酮化合物的吸附作用不同以及各批次獨一味樣品中不同類型黃酮化合物含量有差異造成的[15]。

本研究前期考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.2%甲酸溶液和甲醇-0.2%甲酸溶液4種流動相以及不同流動相梯度對獨一味總黃酮指紋圖譜的影響，以基線平穩(wěn)、色譜峰多且分離好為標(biāo)準(zhǔn)，最終選擇了乙腈-0.2%甲酸溶液作為流動相。

由指紋圖譜共有峰相關(guān)分析和相似度評價可知，15批獨一味總黃酮的相對峰面積RSD較大，相似度雖然在0.925～1.000之間，但各批次間仍然存在差異。為進(jìn)一步明確引起差異性的主要原因，本研究采用聚類分析、主成分分析和OPLS-DA 3種化學(xué)計量學(xué)方法對15批獨一味總黃酮進(jìn)行質(zhì)量評價。聚類分析表明，15批獨一味總黃酮可根據(jù)產(chǎn)地聚為4類，表明地域性可引起獨一味總黃酮的質(zhì)量差異；通過主成分分析進(jìn)一步得到第1類和第4類產(chǎn)地即青海省和西藏自治區(qū)的獨一味總黃酮質(zhì)量較好，與《中國植物志》[16]記載的獨一味主產(chǎn)區(qū)一致；通過OPLS-DA篩選出3個影響?yīng)氁晃犊傸S酮質(zhì)量的主要成分，其中1個成分為木犀草苷，也暗示木犀草苷等3個主要成分的含量高低與獨一味總黃酮的質(zhì)量密切相關(guān)。

綜上所述，青海省和西藏自治區(qū)的獨一味總黃酮質(zhì)量較好。本研究可為不同產(chǎn)地獨一味總黃酮的質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。