鐘亮 鄒萌萌 錢志紅 李建龍 姜海

摘要：為了深入探究白三葉-作物-根瘤菌共生互輪系統(tǒng)對不同重金屬污染農(nóng)田土壤的生態(tài)修復(fù)與作物輪作效應(yīng)，通過2017年盆栽預(yù)備試驗，在獲得理想效果的基礎(chǔ)上，又于2018—2019年多點對比盆栽進行+正式試驗，比較不同土壤鉛添加量（0、50、100、200、400 mg/kg）下，白三葉在是否接種根瘤菌的情況下，對其葉綠素含量與地下部和地上部的鮮質(zhì)量、氮含量、鉛含量以及作物（小麥）生長的影響，進而同步移植到江蘇省張家港市進行大田不同對比區(qū)域驗證試驗。結(jié)果表明，在不同程度鉛脅迫下，接菌組較不接菌組的白三葉地下部和地上部鮮質(zhì)量分別增加15.2%～54.1%、15.1%～44.6%，表明鉛脅迫對白三葉生物量的抑制作用在接種根瘤菌后能有效降低。在不同程度鉛脅迫下，接菌組較不接菌組的白三葉葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量分別增加0.6%～20.3%、7.2%～35.4%、0.8%～27.6%，表明接種根瘤菌能夠促進白三葉光合作用過程，提高代謝效率，增加葉綠素的合成。在不同程度鉛脅迫下，接菌組白三葉的地下部氮含量普遍高于不接菌組，表明接種根瘤菌能夠促進白三葉的地下部固氮增加。隨著鉛脅迫的增加，2組白三葉鉛含量的富集均呈現(xiàn)上升趨勢，其中最佳接菌組較不接菌組的白三葉地下部和地上部鉛含量分別增加29.1%～45.7%、11.5%～48.9%，表明接種理想根瘤菌對白三葉鉛含量的富集特性顯著高于不接種根瘤菌組。結(jié)果還表明，接種根瘤菌不僅能夠促進白三葉根莖生長，還能夠促進白三葉對農(nóng)田土壤鉛的大量吸收，遷移積累觀測，從而降低土壤中的鉛含量，并在下一個試驗促進小麥的生長，該白三葉-作物-根瘤菌互輪系統(tǒng)初步獲得對重度鉛污染農(nóng)田土壤的生態(tài)修復(fù)效果。因此，該生態(tài)互輪設(shè)計模式對土壤重金屬污染農(nóng)田具有良好的生態(tài)修復(fù)作用，具有進一步驗證和研究的價值。

關(guān)鍵詞：白三葉；小麥；根瘤菌；互輪系統(tǒng)；根系活性；重金屬污染；多年盆栽試驗；生態(tài)修復(fù)

中圖分類號：S181；X53? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）24-0190-06

隨著工業(yè)化的迅速發(fā)展，土壤環(huán)境污染問題越來越突出，嚴重威脅生態(tài)系統(tǒng)安全［1-2］。其中土壤重金屬污染具有遷移緩慢、毒性強且不可逆轉(zhuǎn)等特性，隨著食物鏈逐漸累積，最終被人體攝入并積累，也會引起嚴重的健康問題［3-4］。2014年全國土壤污染狀況調(diào)查公報顯示，我國土壤總體超標率達16.1%［5］，受土壤重金屬污染影響，每年損失約 1 200萬t 糧食作物［6］。因此，土壤重金屬污染已成為我國亟待解決的環(huán)境問題，受到政府和學者們的廣泛關(guān)注［7-9］。利用具有超富集特征或耐受性的植物，可以將污染土壤中的重金屬進行提取、固定和揮發(fā)過程達到生態(tài)修復(fù)的目的，其因經(jīng)濟有效且能改善和美化土壤環(huán)境，應(yīng)用前景廣闊［10-11］。但大部分植物對重金屬的耐受性較低，而具有超富集特性的植物又普遍生長緩慢且生物量小，需要較長的修復(fù)周期，難以實現(xiàn)快速有效修復(fù)的目的［12］。牧草具有生長快和生物量大等特征而受到人們的關(guān)注［13］，目前，已有研究結(jié)果表明白三葉［14］、香根草［15］、黑麥草［16］等對重金屬的脅迫具有較好的富集性和耐受性。近年來，植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)充分綜合了植物修復(fù)和微生物修復(fù)的優(yōu)點［17］，通過形成互作系統(tǒng)加速土壤重金屬的修復(fù)效果，其修復(fù)途徑主要有3個：（1）增加微生物有利于植物從土壤中進行固氮和吸收養(yǎng)分，從而使超富集植物生長得更好，提高生物量，進而提高修復(fù)效率；（2）利用微生物的代謝產(chǎn)酸特性，能夠?qū)⑼寥乐亟饘龠M行活化，提高其生物有效性，從而促進超富集植物的吸收和積累；（3）當超富集植物生長狀況良好時，土壤養(yǎng)分的利用率得到提高，土壤肥力增加；同時也使得微生物活性提高，此時根系發(fā)達，對土壤重金屬的替換和降解作用旺盛，提高修復(fù)效率，從而達到生態(tài)修復(fù)的目的［18］。目前，該技術(shù)在大多數(shù)研究中表現(xiàn)出較好的修復(fù)效果，如劉曉青認為，接種根瘤菌后白三葉地上部重金屬鎘的富集量和轉(zhuǎn)運系數(shù)顯著提高，有利于提高白三葉對重金屬鎘的修復(fù)效率［19］；鄒萌萌等認為，根瘤菌能夠促進白三葉生長及其對土壤中銅的吸收，有利于白三葉對銅污染土壤的修復(fù)［20］；孫楠等發(fā)現(xiàn)，擬青霉菌、嗜麥芽窄食單胞菌均能促進鉛脅迫下黑心菊和黑麥草的生長，從而有效緩解鉛對植物的毒害［21］；姚潔等認為，寡養(yǎng)單胞菌分別與袖珍椰子和鳳尾蕨構(gòu)建聯(lián)合修復(fù)體系能夠增強植物對鉛的耐受性，加快土壤中重金屬鉛的吸收與轉(zhuǎn)運，從而提高對鉛污染土壤的修復(fù)效率［22］。為了深入探究白三葉-作物-根瘤菌共生互輪系統(tǒng)對不同重金屬污染農(nóng)田土壤的生態(tài)修復(fù)與作物輪作效應(yīng)效果，通過2017年盆栽預(yù)備試驗，在獲得理想效果的基礎(chǔ)上，又于2018—2019年多點對比盆栽正式試驗，比較不同土壤鉛添加量（0、50、100、200、400 mg/kg）下，白三葉在是否接種根瘤菌的情況下，對其葉綠素含量和地下部和地上部的鮮質(zhì)量、氮含量、鉛含量以及作物（小麥）生長的影響，并進而同步移植到張家港市，于2019—2022年進行大田不同對比區(qū)域驗證試驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及準備

預(yù)備試驗于2017年開始，主要包括試驗材料收集與處理、白三葉苗體種植、菌懸液制備、白三葉-根瘤菌共生體系檢測、根瘤菌耐鉛能力檢測等。供試白三葉種子（購自北京中農(nóng)百綠農(nóng)業(yè)科技集團有限公司），經(jīng)過蒸餾水浸泡、75%乙醇消毒以及無菌水沖洗后作為備用。供試三葉草根瘤菌來自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心。使用酵母甘露醇瓊脂（YMA）固體培養(yǎng)基先將根瘤菌活化，再接種到Y(jié)MA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃條件下150 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，分別獲得濃度為2.7×109、2.3×109? CFU/mL的菌懸液。試驗前對根瘤菌的耐鉛能力進行檢測，該菌株在鉛濃度為 2 mmol/L 的YMA固體培養(yǎng)基上能夠正常生長。

在南京大學生命科學學院后山取表層（0～20 cm）土壤，經(jīng)自然風干和過篩處理后，按2 ∶[KG-*3]1的質(zhì)量比將其與營養(yǎng)土（購自南京斑馬實驗器材有限公司）均勻混合后作為盆栽基質(zhì)。選取小麥種子作為培養(yǎng)和供試對象進行盆栽試驗，土壤樣品在實驗室中自然風干，并去除沙礫和植物碎片，然后過 6 mm 尼龍篩，將校園土和營養(yǎng)土以1 ∶[KG-*3]2混合均勻，外源添加不同處理濃度水平的重金屬鉛溶液，濃度梯度為0（CK）、50、100、200、400 mg/kg，每個濃度梯度設(shè)置3個平行樣，混勻后靜置7 d備用。在盆栽試驗中，土壤的理化性質(zhì)為：pH值7.15，有機質(zhì)含量32.7 g/kg，總氮含量為2.43 g/kg，有效態(tài)氮含量74.26 mg/kg，有效態(tài)磷含量0.18 g/kg，有效態(tài)鉀含量0.18 g/kg，總銅含量36.31 mg/kg，有效態(tài)銅含量0.16 mg/kg。將配制的土壤裝入底部有孔的塑料培養(yǎng)盆中，每盆為1.5 kg（以風干土計），施入0.18 g/盆氮，0.12 g/盆磷和0.18 g/盆鉀（即稱取0.97 g/盆尿素、1.32 g/盆KH2PO4和0.14 g/盆KCl），加水混合，直至盆底部的小孔溢出為止。小麥種子用 10%次氯酸鈉溶液浸泡后，在培養(yǎng)皿內(nèi)進行室內(nèi)發(fā)芽，小麥幼苗生長到一定高度后移栽進入塑料培養(yǎng)盆中，最終留6株/盆小麥植株，越冬期過后進行1次追肥，之后生長期間不再施肥，每天澆灌蒸餾水直至收獲。

1.2 試驗設(shè)計

盆栽試驗于2018年、2019年在南京大學生命科學學院露天陽臺開展。制備供試基質(zhì)中鉛添加量分別為0、50、100、200、400 mg/kg，沒有添加鉛溶液的供試基質(zhì)作為對照，塑料花盆中裝入1.5 kg/盆基質(zhì)，并在常溫條件下靜置14 d。將白三葉種子均勻分成2組，接菌組在2.7×109 CFU/mL根瘤菌菌懸液中浸泡10 min；不接菌組在經(jīng)過滅菌的菌懸液中浸泡10 min。再按30粒/盆白三葉種子均勻播撒在花盆基質(zhì)中，覆上0.5～1 cm土壤，每個鉛處理組設(shè)置6盆，各3次重復(fù)。當種子發(fā)芽至2～3 cm時，通過注射器對接菌組沿植株根部接入2.3×109 CFU/mL根瘤菌菌懸液8 mL，進行2次接種。等長至10 cm后留長勢良好的15株幼苗，之后定期澆水，基質(zhì)中保持60%～70%的持水量。

2019年對不同處理盆栽白三葉小區(qū)中補種小麥品種，2020年對其白三葉-作物-根瘤菌共生互輪系統(tǒng)對不同鉛污染程度農(nóng)田土壤的生態(tài)修復(fù)效果進行系統(tǒng)測定，并獲得滿意的效果。另外，2年盆栽試驗結(jié)束后，在農(nóng)田中進行實地驗證生態(tài)修復(fù)效果。

1.3 測定指標和方法

生態(tài)修復(fù)效果通過白三葉葉綠素含量以及地上部和地下部的鮮質(zhì)量、氮含量來反映受不同程度鉛脅迫下白三葉的生長狀況，通過地上部和地下部的鉛含量來反映白三葉對土壤中鉛的吸收和積累情況。其中，白三葉鮮質(zhì)量和葉綠素含量的測定方法參照文獻［18］，氮含量通過半微量凱氏定氮法測定，鉛含量通過電感耦合等離子體發(fā)射光譜法測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)整理與匯總采用Excel 2016軟件完成；數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析利用SPSS 22.0軟件中Duncans多重比較法進行差異顯著分析（α=0.05）。本研究采用Origin Pro 9.1繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 作物根瘤菌對不同程度鉛脅迫下白三葉生物量的影響

根瘤菌對鉛脅迫下白三葉生物量的影響結(jié)果見圖1。由圖1-a可知，隨著土壤中鉛添加量的逐漸增加，2組白三葉地下部鮮質(zhì)量波動變化，且均在鉛添加量為100 mg/kg時達到最大值；同時，接菌組白三葉地下部鮮質(zhì)量均高于不接菌組，分別較不接菌組增加15.2%、51.4%、32.7%、54.1%、27.0%，其中鉛脅迫為50、100、200 mg/kg時呈顯著差異（P<0.05），表明接種根瘤菌能降低鉛脅迫對白三葉地下部鮮質(zhì)量的抑制作用。

由圖1-b可知，隨著土壤中鉛添加量的逐漸增加，2組白三葉地上部鮮質(zhì)量波動變化，接菌組和不接菌組分別在鉛添加量為200、0 mg/kg時達到最大值；同時，接菌組均高于不接菌組，分別較不接菌組增加18.2%、23.0%、44.6%、42.7%、15.1%，其中鉛脅迫為100、200 mg/kg時呈顯著差異（P<0.05），表明接種根瘤菌能降低鉛脅迫對白三葉地上部鮮質(zhì)量的抑制作用。

在對生物量的影響方面，當鉛脅迫超過一定程度時，對白三葉的生物量產(chǎn)生抑制作用，主要是因為過量的鉛會侵害植物，導(dǎo)致植物生長萎縮、萎黃病發(fā)病、根系變黑，對白三葉產(chǎn)生毒害作用［23］。且接菌組白三葉的生物量均高于不接菌組，主要是因為根瘤菌能夠阻止重金屬離子進入細胞內(nèi)部［24］，如利用細胞膜和細胞壁上的多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)與重金屬離子形成復(fù)合物，同時降低重金屬的透過性，從而減少重金屬離子進入細胞內(nèi)部，進而有效降低鉛脅迫對白三葉生物量的抑制作用。

2.2 作物根瘤菌對不同程度鉛脅迫下白三葉葉綠素的影響

根瘤菌對鉛脅迫下白三葉葉綠素含量的影響結(jié)果見表1。從其對白三葉葉綠素a的影響可知，隨著土壤中鉛添加量的逐漸增加，接菌組均高于不接菌組，分別較不接菌組增加2.6%、0.6%、21.3%、10.5%、20.3%。

從其對白三葉葉綠素b含量的影響可知，隨著土壤中鉛添加量的逐漸增加，接菌組均高于不接菌組，分別較不接菌組增加16.1%、7.2%、35.4%、19.7%、14.3%，其中鉛添加量為100 mg/kg時呈顯著差異（P<0.05）。同時，在接菌組中，鉛添加量為 0 mg/kg 和100 mg/kg之間呈顯著差異（P<0.05）；在不接菌組中，鉛添加量為0 mg/kg和400 mg/kg之間呈顯著差異（P<0.05）。

從其對白三葉葉綠素總量的影響結(jié)果可知，隨著土壤中鉛添加量的逐漸增加，接菌組均高于不接菌組，分別較不接菌組增加4.2%、0.8%、27.6%、14.1%、16.9%。

從其對葉綠素的影響看，在不同程度鉛脅迫下，接菌組白三葉的葉綠素含量均高于不接菌組，主要是因為接種根瘤菌能夠促進白三葉光合作用過程，提高代謝效率，從而促進葉綠素的合成［25］。

2.3 作物根瘤菌對不同程度鉛脅迫下白三葉氮含量的影響

根瘤菌對鉛脅迫下白三葉氮含量的影響結(jié)果見圖2。由圖2-a可知，土壤中鉛添加量除 400 mg/kg 外，接菌組均高于不接菌組，其中鉛添加量為0、200 mg/kg時呈顯著差異（P<0.05）。此外，隨著土壤中鉛添加量的增加，2組白三葉地上部氮含量均波動變化，分別在200、400 mg/kg時達到最大值，且不接菌組在鉛添加量為400 mg/kg時與其他鉛添加量呈顯著差異（P<0.05）。

由圖2-b可知，土壤中鉛添加量為0、50、200 mg/kg 時，接菌組均低于不接菌組，分別較不接菌組降低6.4%、15.9%、3.5%；土壤鉛添加量為100、400 mg/kg時，接菌組高于不接菌組，分別較不接菌組增加14.2%、2.6%。此外，2組白三葉地上部氮含量在不同程度鉛脅迫下均無顯著差異，分別在100、50 mg/kg時達到最大值。

在對氮含量的影響方面，在不同程度鉛脅迫下，接菌組白三葉的地下部氮含量普遍高于不接菌組，主要是因為根瘤菌能夠通過固氮作用提供白三葉生長所需的氨、促進白三葉對營養(yǎng)元素的吸收、改變土壤理化性質(zhì)等方式促進白三葉的生長［26-27］。但這種促進作用主要在地下部體現(xiàn)更明顯，未能延續(xù)到地上部，可能是地上部白三葉由于受到鉛的脅迫、吸收效率、環(huán)境等多種因素的干擾，使得固氮作用并不明顯。

2.4 作物根瘤菌對不同程度鉛脅迫下白三葉鉛含量降解與積累的影響

由圖3-a可知，當土壤中鉛添加量為100、200、400 mg/kg時，2組白三葉地下部鉛含量均顯著高于對照組（P<0.05），且隨著鉛添加量增加均逐漸增加，表明鉛添加量的增加也會加強其對接菌組和不接菌組白三葉地下部鉛含量的富集；同時，當土壤中鉛添加量為0、100、200、400 mg/kg時，接菌組均高于不接菌組，分別較不接菌組增加29.1%、[JP3]30.1%、36.2%、42.7%，其中鉛脅迫為200、400 mg/kg時呈顯著差異（P<0.05），表明接種根瘤菌對白三葉地下部鉛含量的富集高于不接種根瘤菌。

由圖3-b可知，在接菌組中，鉛脅迫為100、200、400 mg/kg時顯著高于對照組；在不接菌組中，鉛添加量為200、400 mg/kg時顯著高于對照組。接菌組和不接菌組隨著鉛添加量增加均逐漸增加，表明鉛脅迫的增加也會加強其對接菌組和不接菌組白三葉地上部鉛含量的富集；同時，接菌組白三葉地上部鉛含量均高于不接菌組，分別較不接菌組增加24.3%、11.5%、41.7%、48.9%、31.9%，表明接種根瘤菌對白三葉地上部鉛含量的富集高于不接種根瘤菌。

在對鉛含量的影響方面，無論接菌組還是不接菌組，隨著鉛脅迫的增加，白三葉鉛含量的富集均增加，主要是因為鉛易被白三葉吸收，進而在不同器官形成累積，這與田偉莉等的研究結(jié)果［28］一致。且接菌組白三葉的鉛含量大部分情況下高于不接菌組，主要是因為接種根瘤菌后，一方面更有利于白三葉固氮和吸收養(yǎng)分，促進白三葉生長，從而提高白三葉對土壤鉛的吸收量；另一方面根瘤菌通過代謝產(chǎn)酸活化重金屬鉛，提高鉛的生物有效性，進而促進白三葉對土壤重金屬的吸收和積累。

2.5 白三葉-根瘤菌互作系統(tǒng)對土壤重金屬污染農(nóng)田的生態(tài)修復(fù)效果分析

白三葉作為一種超富集的牧草植物，具有生長快、生物量大、積累重金屬量多以及耐受性強等特性。而根瘤菌是一種微生物，可以吸附、固定重金屬，減少植物地上部受重金屬的毒害。當根瘤菌與白三葉形成共生體系后，根瘤菌不僅能夠通過代謝產(chǎn)酸特性，活化土壤中的重金屬，提高其生物有效性，從而促進白三葉對土壤中重金屬的吸收和積累；且有利于白三葉從土壤中固氮和吸收養(yǎng)分，從而促進白三葉生長，提高修復(fù)效率。當白三葉生長狀況良好時，土壤養(yǎng)分的利用率得到提高，土壤肥力增加；同時也使得根瘤菌活性提高，此時白三葉根系發(fā)達，對土壤重金屬的替換和降解作用旺盛，從而形成白三葉-根瘤菌-土壤肥力的正反饋互作系統(tǒng)，提高生態(tài)修復(fù)效率。目前，研究發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌后，能夠有效促進白三葉生長及其對土壤中鎘和銅的吸收，有利于白三葉對重金屬鎘和氮污染土壤的修復(fù)［19-20］，但對重金屬鉛污染土壤的修復(fù)效果尚未有研究。而本研究充分利用白三葉和根瘤菌的優(yōu)勢特征，通過形成白三葉-根瘤菌互作系統(tǒng)觀察其對不同鉛污染程度土壤的生態(tài)修復(fù)效果。

3 結(jié)論

在不同程度鉛脅迫下，接菌組較不接菌組的白三葉地下部和地上部鮮質(zhì)量分別增加15.2%～54.1%、15.1%～44.6%，表明鉛脅迫對白三葉生物量的抑制作用在接種根瘤菌后能有效降低。

在不同程度鉛脅迫下，接菌組較不接菌組的白三葉葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總量分別增加0.6%～20.3%、7.2%～35.4%、0.8%～27.6%，表明接種根瘤菌能夠促進白三葉的光合作用過程，提高代謝效率，增加葉綠素的合成。

在不同程度鉛脅迫下，接菌組白三葉的地下部氮含量普遍高于不接菌組，表明接種根瘤菌能夠促進白三葉的地下部固氮增加。

隨著鉛添加量的增加，2組白三葉鉛含量的富集均呈現(xiàn)上升趨勢，其中最佳接菌組較不接菌組的白三葉地下部和地上部鉛含量分別增加29.1%～45.7%、11.5%～48.9%，表明接種理想根瘤菌對白三葉鉛含量的富集特性顯著高于不接種根瘤菌組。

通過研究證明，該生態(tài)互輪設(shè)計模式對土壤重金屬污染農(nóng)田具有良好的生態(tài)修復(fù)作用，具有進一步驗證和研究的價值。

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