陳興繼 魏后軍 范志宇 胡波 宋艷華 陳萌萌 仇汝龍 葛雷 王芳

摘要：為實現(xiàn)對兔出血癥病毒1型（RHDV1）和兔出血癥病毒2型（RHDV2）的有效鑒別診斷，從而有效預(yù)防和控制兔出血癥，將抗RHDV廣譜單抗2A11作為捕獲抗體包被于ELISA板，以HRP標記的抗RHDV1特異性單抗1D4、抗RHDV2特異性單抗6B3分別作為檢測抗體，經(jīng)條件優(yōu)化，建立了鑒別檢測兔出血癥病毒1型、2型的雙抗體夾心ELISA方法，并進行敏感性、特異性試驗，對送檢的60份兔肝臟樣品用該雙抗體夾心ELISA方法和RT-PCR方法進行檢測，比較這2種方法的符合率。結(jié)果顯示，該雙抗體夾心ELISA方法的最佳工作條件為：捕獲抗體濃度為 4 μg/mL，2種HRP標記的檢測抗體的濃度均為0.5 μg/mL；判定標準為：以檢測抗體HRP-1D4檢測樣品D值>0.195 判為RHDV1陽性，以檢測抗體HRP-6B3檢測樣品D值>0.166判為RHDV2陽性；通過特異性和敏感性試驗發(fā)現(xiàn)，該雙抗體夾心ELISA方法具有較強特異性和較高敏感性。檢測60份送檢的兔肝臟樣品，發(fā)現(xiàn)本方法與 RT-PCR 方法相比，檢測RHDV1陽性樣品的符合率為100%（9/9），RHDV2陽性樣品的符合率為82.61%（19/23），陰性樣品的符合率為87.5%（28/32），總符合率為93.33%（56/60），且該方法陽性樣品檢出率高于RT-PCR方法。本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法可有效地鑒別檢測RHDV1和RHDV2這2種不同基因型的病毒，為兔出血癥的流行病學研究提供有力的技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞：兔出血癥病毒；雙抗體夾心ELISA；單抗；鑒別檢測

中圖分類號：S852.2? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）24-0161-07

兔出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）是由兔出血癥病毒（rabbit haemorrhagic disease virus，RHDV）引起的一類危及兔類健康的急性傳染病，又被稱為兔出血性肺炎、兔瘟，它的致死性極強，可以導(dǎo)致多個品種的兔子大面積死亡，典型癥狀包括全身實質(zhì)器官的水腫、出血和瘀血等［1］。目前，RHDV有RHDV1（基因型GI.1）和RHDV2（基因型GI.2）2種基因型。1984年，中國江蘇地區(qū)首次報道了RHDV1，并在全國大部分地區(qū)和全球范圍內(nèi)快速傳播［2］。2010年，法國首次報道RHDV2［3］，并蔓延傳播至歐洲多個國家，研究發(fā)現(xiàn)，其已取代RHDV1成為優(yōu)勢基因型［4-5］。RHDV2感染宿主范圍更廣，除了家兔外，還感染野兔等嚙齒類野生動物，且所有年齡階段的家兔對其都易感，可導(dǎo)致2～3周齡幼兔死亡，且潛伏期更長。2020年筆者所在團隊首先發(fā)現(xiàn)并報道了RHDV2在我國暴發(fā)［6-7］。感染RHDV1或RHDV2的家兔在臨床表現(xiàn)上大致相同，常于感染后24～72 h死亡，最常見的病變?yōu)楦螇乃?、脾腫大、肺和氣管充血和出血等［8］；通過臨床癥狀難以鑒別診斷。目前，針對兔出血癥的臨床診斷方法可以劃分為2類：一類是病毒核酸檢測，主要是RT-PCR［9］和qRT-PCR［10-11］等方法，具有操作簡單、檢測準確性較高的優(yōu)勢，但由于需要使用特殊的試劑、儀器以及專業(yè)的操作技術(shù)，使得應(yīng)用受到了一定的局限，從而阻礙了基層及大規(guī)模臨床樣本的檢測。另一類是抗原檢測，主要是紅細胞凝集試驗［12］、膠體金試紙條［13］以及夾心ELISA［14-16］等方法，但這些方法并不能鑒別檢測RHDV1、RHDV2。

雙抗體夾心ELISA方法被廣泛應(yīng)用于動物疫病診斷中，具有高靈敏度和專一性，并且不需要預(yù)先純化抗原。此外，操作簡單，適用于基層和大批樣品檢測。本研究以RHDV廣譜單抗捕獲RHDV1、RHDV2，以HRP標記的RHDV1特異性單抗、RHDV2特異性單抗分別作為檢測抗體，建立雙抗體夾心ELISA方法用于快速鑒別檢測RHDV1、RHDV2。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

2022年10—12月于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院獸醫(yī)研究所家兔重大疫病防控創(chuàng)新團隊實驗室進行試驗。

1.2 抗體及樣品

筆者所在實驗室制備：2株抗RHDV廣譜單克隆抗體（1B8、2A11）、2株HRP標記的抗RHDV1特異性單克隆抗體（HRP-1D4、HRP-5F3）及2株HRP標記的抗RHDV2特異性單克隆抗體（HRP-6B3、HRP-4F1）；筆者所在實驗室保存健康兔肝臟樣品和RHDV1、RHDV2、兔波氏桿菌（Bb）、兔巴氏桿菌（Pm）、兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（CpA）、腸炎沙門氏菌（Se）、輪狀病毒（RV）感染死亡兔肝臟樣品；送檢的死亡兔肝臟樣品來自四川省、山東省、河南省等各兔養(yǎng)殖場。

1.3 試劑

脫脂乳、BSA、干酪素鈉和底物顯色液（TMB）購自北京索萊寶公司；明膠購自北京金沙生物公司。

1.4 樣品的處理

兔肝臟樣品與PBS按質(zhì)量體積比1 g ∶10 mL充分研磨制成勻漿，8 000 r/min離心15 min后取上清保存。

1.5 雙抗體夾心ELISA方法的建立

1.5.1 抗體配對試驗 將抗RHDV廣譜單克隆抗體2A11和1B8分別作為捕獲抗體用包被液（pH值9.6，0.05%碳酸鹽緩沖液）稀釋至8 μg/mL，加入100 μL/孔，4 ℃過夜，用PBST（pH值7.4，含0.05%Tween 20）洗滌3次，每次持續(xù)5 min，拍干；然后加入200 μL/孔封閉液（5%脫脂乳），37 ℃下作用2.0 h，用PBST洗滌3次，每次持續(xù)5 min，拍干；分別加入100 μL/孔兔出血癥病毒1型、2型陽性肝臟研磨上清和陰性肝臟研磨上清，37 ℃作用 1.0 h，用PBST洗滌3次，每次持續(xù)5 min，拍干；然后分別加入 100 μL/孔用PBST稀釋至1 μg/mL HRP標記的RHDV1檢測抗體（HRP-1D4、HRP-5F3）、HRP標記的RHDV2檢測抗體（HRP-6B3、HRP-4F1），37 ℃ 作用1.0 h，用PBST洗滌3次，每次持續(xù) 5 min，拍干；加入100 μL/孔底物顯色液，37 ℃避光反應(yīng)10 min，加入50 μL/孔終止液（2 mol/L H2SO4），置于酶標儀上測定D450 nm，其中陽性抗體的D450 nm用P表示，陰性用N表示。根據(jù)P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值最大，確定鑒別檢測RHDV1的抗體組合；根據(jù)P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值最大，確定鑒別檢測RHDV2的抗體組合。

1.5.2 肝臟樣品的稀釋倍數(shù) 按“1.5.1”節(jié)試驗確定的抗體配對組合，用包被液將捕獲抗體按照 8 μg/mL 進行包被，將RHDV1、RHDV2陽性肝臟和陰性肝臟分別按1 ∶10、1 ∶20、1 ∶40、1 ∶80進行稀釋，然后分別加入稀釋至1 μg/mL的HRP標記的RHDV1檢測抗體和HRP標記的RHDV2檢測抗體，最后用酶標儀測定D450 nm。根據(jù)用HRP標記的RHDV1檢測抗體檢測樣品時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值；以及用HRP標記的RHDV2檢測抗體檢測樣品時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值，綜合確定肝臟樣品最佳稀釋倍數(shù)。

1.5.3 捕獲抗體和檢測抗體最適工作濃度的確定 采用方陣滴定法確定捕獲抗體和檢測抗體的最適工作濃度。用包被液將捕獲抗體稀釋至12、8、4、2 μg/mL，將RHDV1、RHDV2陽性肝臟和陰性肝臟分別按“1.5.2”節(jié)中確定的最佳稀釋倍數(shù)稀釋，用PBST將HRP標記的RHDV1檢測抗體和HRP標記的RHDV2檢測抗體稀釋至1、0.5、0.25、0.125 μg/mL，最后用酶標儀測定D450 nm。選擇P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值最大的捕獲抗體和檢測抗體濃度作為檢測RHDV1的最適工作濃度；選擇P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值最大的捕獲抗體和檢測抗體作為檢測RHDV2的最適工作濃度。

1.5.4 最佳封閉液的確定 以上述試驗確定的作用條件進行雙抗體夾心ELISA，選擇PBST稀釋的5%脫脂乳、1%BSA、2%明膠、1%干酪素鈉作為封閉液，37 ℃下作用2.0 h，根據(jù)用HRP標記的RHDV1檢測抗體檢測樣品時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值；以及用HRP標記的RHDV2檢測抗體檢測樣品時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值，綜合確定合適的封閉液。

1.5.5 抗原最佳作用時間的確定

以上述試驗確定的作用條件進行雙抗體夾心ELISA，分別選擇 37 ℃ 下0.5、1.0、1.5、2.0 h作為抗原作用時間，根據(jù)用HRP標記的RHDV1檢測抗體檢測樣品時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值；以及用HRP標記的RHDV2檢測抗體檢測樣品時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值，綜合確定抗原作用時間。

1.5.6 檢測抗體最佳作用時間的確定 以上述試驗確定的作用條件進行雙抗體夾心ELISA，分別選擇37 ℃下40、60、90、120 min作為檢測抗體作用時間，根據(jù)用HRP標記的RHDV1檢測抗體檢測樣品時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值；以及用HRP標記的RHDV2檢測抗體檢測樣品時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1） 值，綜合確定檢測抗體作用時間。

1.5.7 陰性和陽性標準的確定 用建立的雙抗體夾心ELISA方法對30份RHDV陰性健康兔肝臟樣品進行檢測，測定D450 nm的平均值（x）和標準差（s），以“x+3s”作為陰性和陽性的分界線。

1.6 特異性試驗

用建立的雙抗體夾心ELISA方法檢測RHDV1、RHDV2、兔波氏桿菌（Bb）、兔巴氏桿菌（Pm）、兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（CpA）、腸炎沙門氏菌（Se）、輪狀病毒（RV）感染死亡兔肝臟樣品，評價方法的特異性。

1.7 敏感性試驗

將1 ∶10的RHDV1、RHDV2陽性樣品倍比稀釋至1 ∶20 480，用建立的雙抗體夾心ELISA方法對不同稀釋度樣品測定D450 nm，同時將結(jié)果與紅細胞凝集試驗（HA）對比，從而確定所建立的檢測方法的敏感性。

1.8 臨床樣品檢測試驗

對四川省、山東省、河南省各兔場送檢的60份死亡兔肝臟樣品用建立的雙抗體夾心ELISA方法進行檢測，同時用RT-PCR方法［9］進行檢測，比較2種方法的符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗體配對試驗

抗體配對試驗結(jié)果（表1）顯示，單克隆抗體2A11作為捕獲抗體，HRP-1D4作為RHDV1檢測抗體，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值最大；單克隆抗體2A11作為捕獲抗體，HRP-6B3作為RHDV2檢測抗體，P（RHDV2）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV1）值最大。

2.2 雙抗體夾心ELISA法的建立與優(yōu)化

2.2.1 肝臟樣品最佳稀釋倍數(shù)的確定 以捕獲抗體2A11、RHDV1檢測抗體HRP-1D4、RHDV2檢測抗體HRP-6B3，對1 ∶10、1 ∶]20、1 ∶40、1 ∶80稀釋RHDV1、RHDV2陽性肝臟和陰性肝臟進行檢測。結(jié)果顯示，用RHDV1檢測抗體HRP-1D4檢測 1 ∶40 稀釋的肝臟樣品時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值最大；用RHDV2檢測抗體HRP-6B3檢測1 ∶40稀釋的肝臟樣品時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值最大。因此，確定肝臟樣品最佳稀釋倍數(shù)為1 ∶40（表2）。

2.2.2 捕獲抗體和檢測抗體最適工作濃度的確定 通過方陣滴定法確定捕獲抗體和檢測抗體的最適工作濃度。結(jié)果顯示，捕獲抗體2A11濃度為 8 μg/mL 或4 μg/mL，RHDV1檢測抗體HRP-1D4濃度為0.5 μg/mL時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值較大；捕獲抗體2A11濃度為4 μg/mL、RHDV2檢測抗體HRP-6B3濃度為0.5 μg/mL時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值最大。綜合考慮確定捕獲抗體2A11濃度為4 μg/mL，檢測抗體HRP-1D4、HRP-6B3濃度均為0.5 μg/mL（表3）。

2.2.3 最佳封閉液的確定 對比5%脫脂乳、1%BSA、2%明膠、1%干酪素鈉作為封閉液的ELISA檢測結(jié)果。用5%脫脂乳作為封閉液，以RHDV1檢測抗體HRP-1D4檢測樣品時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值最大；同時用5%脫脂乳作為封閉液，以RHDV2檢測抗體HRP-6B3檢測樣品時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1） 值最大。因此，確定最佳封閉液為5%脫脂乳（表4）。

2.2.4 最佳抗原作用時間的確定 對比抗原37 ℃下作用0.5、1.0、1.5、2.0 h 的ELISA檢測結(jié)果。以RHDV1檢測抗體HRP-1D4進行試驗，抗原作用1.0 h時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2）值最大；以RHDV2檢測抗體HRP-6B3進行試驗，抗原作用1.0 h或1.5 h時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值較大。因此，綜合考慮確定最佳抗原作用時間為1.0 h（表5）。

2.2.5 最佳檢測抗體作用時間的確定 對比檢測抗體37 ℃下作用40、60、90、120 min 的ELISA檢測結(jié)果。RHDV1檢測抗體HRP-1D4作用60 min或 90 min 時，P（RHDV1）/N值及P（RHDV1）/P（RHDV2） 值較大；RHDV2檢測抗體HRP-6B3作用60 min時，P（RHDV2）/N值及P（RHDV2）/P（RHDV1）值最大。因此，綜合考慮最佳檢測抗體作用時間為60 min（表6）。

2.3 陰陽性臨界值的確定

檢測30份RHDV陰性的健康兔肝臟，檢測抗體HRP-1D4檢測樣品平均值（x）為0.113，標準差（s）為0.027，陰性、陽性臨界值為0.195，則待檢樣品D450 nm≥0.195判為RHDV1陽性，D450 nm＜0.195判為RHDV1陰性；檢測抗體HRP-6B3檢測樣品平均值（x）為0.093，標準差（s）為0.024，則待檢樣品D450 nm≥0.166判為RHDV2陽性，D450 nm＜0.166判為RHDV2陰性。

2.4 試驗的特異性

對兔常見病原樣品用建立的雙抗夾心ELISA方法進行檢測，結(jié)果顯示，檢測RHDV1陽性樣品為RHDV1陽性、RHDV2陰性，檢測RHDV2陽性樣品為RHDV2陽性、RHDV1陰性；檢測兔波氏桿菌（Bb）、兔巴氏桿菌（Pm）、兔A型產(chǎn)氣莢膜梭菌（CpA）、腸炎沙門氏菌（Se）、輪狀病毒（RV）感染死亡兔肝臟樣品，均為陰性，說明該方法特異性良好（表7）。

2.5 試驗的敏感性

RHDV1型陽性樣品HA效價為1 ∶2 560、1 ∶10 240 稀釋時，雙夾心ELISA檢測結(jié)果為陽性，此后為陰性（圖1）。RHDV2陽性樣品HA效價為 1 ∶2 560、1 ∶5 120稀釋時，雙夾心ELISA檢測結(jié)果為陽性，此后為陰性（圖2）。與HA試驗相比，所建立的ELISA方法具有較高的敏感性。

2.6 臨床樣品檢測

對四川省、山東省、河南省各兔場送檢的60份死亡兔肝臟樣品用建立的雙抗體夾心ELISA方法

進行檢測，檢測結(jié)果顯示，RHDV1陽性樣品9份，RHDV2陽性樣品23份，陰性樣品28份；RT-PCR方法檢測結(jié)果顯示，RHDV1陽性樣品9份，RHDV2陽性樣品19份，陰性樣品32份。2種方法檢測RHDV1陽性樣品的符合率為100%（9/9），RHDV2陽性樣品的符合率為82.61%（19/23），陰性樣品的符合率為87.5%（28/32），總符合率為93.33%（56/60）（表8）。

3 討論與結(jié)論

養(yǎng)兔業(yè)是我國畜牧業(yè)的重要組成部分，在養(yǎng)殖業(yè)中具有不可替代的地位，但RHD的發(fā)生與流行，給全球兔養(yǎng)殖業(yè)帶來了嚴重威脅。2010年，RHDV2首次在法國報道。我國于2020年4月首次發(fā)現(xiàn)RHDV2。研究顯示，RHDV1抗原制備的疫苗不能對RHDV2毒株提供有效的交叉保護作用［17］，而國內(nèi)尚無商品化的RHD2疫苗。本研究中采用建立的雙抗體夾心ELISA法和RT-PCR方法［9］對2022年送檢的死亡兔肝臟樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)RHDV2陽性樣品明顯多于RHDV1陽性樣品，應(yīng)引起重視；同時，RT-PCR對RHDV2的檢出率低于雙抗體夾心ELISA，推測可能是因為RT-PCR中擴增RHDV2基因序列的引物是參考法國毒株（GenBank：HE800529.1）設(shè)計，并不能很好地適用于國內(nèi)流行毒株的檢測，這需要對陽性樣品中RHDV2的基因進行測序驗證；也可能是單抗識別的表位在所有試驗用毒株都存在。

目前，國內(nèi)已建立的檢測RHDV的雙抗體夾心ELISA方法［15-16］，使用的是用RHDV1的VP60蛋白作為免疫原制備的單抗，并不適用于RHDV1、RHDV2的鑒別檢測；國外報道有特異性檢測RHDV2的雙抗體夾心ELISA方法［14］，在檢測臨床樣品時，需配合特異性檢測RHDV1雙抗體夾心ELISA方法，而且能否用于國內(nèi)RHDV2流行毒株的檢測需進一步確認。

本研究建立的雙抗體夾心ELISA方法在試驗中只需包被的同時，針對RHDV1和RHDV2的單克隆抗體2A11作為捕獲抗體，分別以HRP標記的RHDV1型特異性單抗1D4、RHDV2型特異性單抗6B3作為檢測抗體，提升了抗原抗體反應(yīng)的特異性，從而減少了假陽性的發(fā)生。由于RHDV1與RHDV2感染引起的家兔臨床癥狀極為相似，通過臨床癥狀難以鑒別診斷，本試驗建立的雙夾心ELISA方法有效針對RHDV1與RHDV2進行鑒別診斷，極大方便了臨床樣品的大規(guī)模檢測，而且該方法具備高敏感性、強特異性、易于操作等優(yōu)點，為下一步開發(fā)鑒別檢測RHDV1和RHDV2快速診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。

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