王麗 王鋒超 張玲 王潔 董飚 王軍 陳嘉皓 王健

摘要：為建立番鴨成肌細胞體外分離培養(yǎng)和鑒定體系，選取不同胚齡黑羽番鴨為材料，利用Ⅱ型膠原酶和胰酶消化鴨胚腿肌獲得成肌細胞，再經(jīng)過3次差速貼壁進一步純化，最后采用含2%馬血清的培養(yǎng)基對分離純化的成肌細胞進行分化誘導(dǎo)，結(jié)合細胞形態(tài)的觀察、成肌細胞增殖期及分化期的標志基因的表達情況的檢測鑒定分離的成肌細胞。結(jié)果顯示，分離純化得到的成肌細胞在貼壁后呈現(xiàn)紡錘形，進行分化處理后出現(xiàn)細胞融合。從E17鴨胚腿肌中獲得的成肌細胞較E15、E16和E18中分離培養(yǎng)的效果更好，且經(jīng)差速貼壁法純化后大部分細胞中均檢測到標志基因Desmin的表達，表明純化后成肌細胞純度較好。成肌細胞誘導(dǎo)分化處理48 h后，成肌調(diào)控因子MyoD的表達顯著上調(diào)；成肌細胞增殖期特異性表達的Myf5顯著性降低；分化期特異性表達的基因MyHC、MyoG以及MRF4均顯著性增加。綜上所述，本試驗成功分離和鑒定了黑羽番鴨成肌細胞，可為研究番鴨肌肉發(fā)育和分子調(diào)控機制提供參考。

關(guān)鍵詞：黑羽番鴨；成肌細胞；細胞分離培養(yǎng)；細胞分化；細胞鑒定

中圖分類號：S834.1? 文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）24-0155-06

隨著我國家禽養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，人們對優(yōu)質(zhì)肉鴨的需求逐漸上升，品質(zhì)優(yōu)良肉鴨的開發(fā)成為水禽育種者的重點工作之一。黑羽番鴨是利用原產(chǎn)于南美洲和中美洲番鴨資源，進行羽色和經(jīng)濟性狀選育形成，具有“五黑”，即黑羽、黑喙、黑蹼、黑脛和黑爪特色，味道鮮美、肉質(zhì)細嫩、生長速度快及抗逆性好［1］。本研究以黑羽番鴨鴨胚為試驗材料，建立黑羽番鴨成肌細胞體外分離培養(yǎng)和鑒定的體系，為黑羽番鴨的進一步選育和生產(chǎn)性能提升提供研究模型。

成肌細胞是來源于中胚層的肌組織前體干細胞，其胞質(zhì)中含有肌絲，具有多向分化能力。增殖分化后會融合為多核肌管，形成多核肌纖維，廣泛用于肌肉生長發(fā)育和相關(guān)的疾病或營養(yǎng)調(diào)控的研究。成肌細胞的增殖和分化的過程受到許多生肌因子的調(diào)控，其中，發(fā)揮關(guān)鍵作用的是成肌調(diào)控因子。成肌調(diào)控因子家族成員有生肌決定因子（MyoD）、肌細胞生成素（MyoG）、成肌因子5（Myf5）、成肌調(diào)節(jié)因子（MRF4），在肌肉組織中特異性表達，參與調(diào)控多種肌肉細胞的發(fā)育［2］。MyoD是在成肌細胞分化過程早期表達的基因之一，促使中胚層細胞轉(zhuǎn)化為成肌細胞，也可促進成纖維細胞和平滑肌細胞等多種類型的細胞向成肌細胞轉(zhuǎn)化［3］。MyoD在8～12 d的金定鴨鴨胚骨骼肌中的表達平穩(wěn)，在13～23 d的鴨胚中隨著成肌細胞的分化，其表達呈現(xiàn)先增加后降低直至平穩(wěn)的趨勢，在17 d鴨胚骨骼肌中表達量最高［4-5］。Myf5是成肌調(diào)控因子家族中最早誘導(dǎo)表達的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控機體多個組織的發(fā)育［3］。MyoG在成肌細胞分化末期高表達，是其定向分化的標志基因，促進多核肌管的形成，進而參與調(diào)控成肌細胞分化為肌纖維［6］。MRF4在骨骼肌中的表達量遠高于其他成肌調(diào)控因子家族成員。當同時敲除Myf5與MyoD，MRF4能夠代償性表達，促進起始肌肉的形成［7］。結(jié)蛋白（Desmin）是肌細胞特異性表達的細胞骨架蛋白，可作為成肌細胞的標志蛋白用于成肌細胞的鑒定［8］。此外，肌球蛋白重鏈（MyHC）是骨骼肌中肌球蛋白的重要組成部分，被稱為肌纖維分化標志蛋白，是常用的鑒定成肌分化的標記基因［9］。

成肌細胞最初是在蛙骨骼肌中發(fā)現(xiàn)并分離得到，隨后在人、小鼠、大鼠、豬、綿羊和山羊中建立了成熟的體外分離和培養(yǎng)體系［9］。家禽成肌細胞的體外分離和培養(yǎng)技術(shù)也逐步發(fā)展起來，由于家禽與哺乳動物的生理特性不同，不同品種間家禽的生理差異也比較大，使不同品種家禽成肌細胞的分離和培養(yǎng)仍有待完善。關(guān)于黑羽番鴨成肌細胞體外分離和純化培養(yǎng)相關(guān)的研究相對較少，限制了黑羽番鴨肌肉發(fā)育機理的研究。膠原酶和胰蛋白酶相結(jié)合的方法是骨骼肌成肌細胞消化分離最主要的方法，該方法快速簡便［10］。而成肌細胞純化最常用的方法是差速貼壁法和梯度密度離心法［11-12］。梯度密度離心法所需要的原始細胞數(shù)量較多，且存在需要多次純化分離或?qū)毎钚杂杏绊懙膯栴}，然而差速貼壁法利用了成肌細胞貼壁速度較其他雜細胞速度慢的特點，可獲得純度較高的成肌細胞，還能保障細胞的生長狀態(tài)良好和穩(wěn)定［9］。

本研究選用黑羽番鴨鴨胚腿肌組織作為試驗材料，采用Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶消化法結(jié)合差速貼壁法對腿肌中的成肌細胞進行分離和純化。為鑒定獲得成肌細胞，利用細胞免疫熒光檢測了Desmin的表達定位情況。采用2%馬血清對獲得的成肌細胞進行分化處理，再用熒光定量PCR檢測了MyoD、MyoG、Myf5、MRF4和MyHC的基因表達情況，進一步鑒定分離獲得的為成肌細胞，建立黑羽番鴨成肌細胞的分離培養(yǎng)體系，為黑羽番鴨肌肉發(fā)育和機理研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年5—9月在江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院科創(chuàng)基地實驗室進行。新鮮黑羽番鴨受精蛋由江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院國家水禽基因庫（江蘇）饋贈。

DEME高糖培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）、孕馬血清（HS）、谷氨酰胺替代物Gluta MAXTM-Ⅰ（100×）購自Gibco公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）、0.25%胰蛋白酶溶液購自Hyclone公司；青-鏈霉素混合液購自Biosharp公司；兔多克隆一抗Desmin和FITC標記的山羊抗兔二抗，均購自武漢博士德公司；細胞組織RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，購自南京諾唯贊公司；膠原酶Ⅱ型、DABCO，購自Sigma公司；離心管、細胞培養(yǎng)板/瓶，購自康寧公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養(yǎng)液配制

基礎(chǔ)培養(yǎng)液：在DMEM高糖培養(yǎng)基中FBS、谷氨酰胺替代物和青-鏈霉素混合液的占比分別為15%、1%和1%。

分化培養(yǎng)液：在DMEM高糖培養(yǎng)基中HS、谷氨酰胺替代物和青-鏈霉素混合液的占比分別為2%、1%和1%。

1.2.2 酶消化法進行成肌細胞的分離

將鴨胚蛋用醫(yī)用乙醇棉進行清洗和消毒，再用刀柄鈍頭將蛋殼大頭敲開，剝離蛋殼后將鴨胚緩慢取出，置于75%乙醇中浸泡清洗1次，然后將其放入含有雙抗的 PBS 中，清洗2～3 次，最終放置在盛有PBS的干凈培養(yǎng)皿中。使用鑷子將腿肌分離并移入另一個干凈的培養(yǎng)皿中，PBS清洗2～3 次后，采用刀片將分離出來的腿肌切成肉糜，并添加適量PBS制成腿肌肉糜混合液。將肉糜混合液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，置于離心機中1 500 r/m離心5 min。棄上清，向離心管中加入DMEM高糖培養(yǎng)基，然后加入適量0.25%胰蛋白酶和0.1%膠原蛋白酶Ⅱ。將混合液置于37 ℃水浴消化10～15 min。其中，每2～3 min觀察下肉糜的消化情況，待肉糜完全消化成絮狀時，加入含有血清的高糖DMEM 終止消化。隨后，室溫離心1 500 r/m離心5 min，棄上清后，采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基吹打混勻，過70 μm細胞濾篩，將得到的較純凈細胞懸液于1 500 r/m離心5 min后，再采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基清洗1次。將獲得的細胞沉淀用基礎(chǔ)培養(yǎng)基進行懸浮，并轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、39 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 差速貼壁法進行成肌細胞的純化培養(yǎng)

將分離得到的成肌細胞在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，將細胞培養(yǎng)基吸取并輕移至一個新的培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng)，并放入5% CO2、39 ℃的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，此時細胞培養(yǎng)基中含有未貼壁的成肌細胞。進行3次這樣的差速貼壁所獲得的成肌細胞純度高，形態(tài)一致。

將純化的成肌細胞置于5% CO2、39 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h更換細胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液，并觀察細胞形態(tài)和狀態(tài)。當細胞密度達80%時進行細胞傳代，吸去培養(yǎng)液后采用PBS清洗2～3 次，每個培養(yǎng)瓶（2.5 cm2）中加入1 mL 0.25%胰蛋白酶和 1 mL PBS，置于CO2培養(yǎng)箱中3～5 min后，采用含有FBS的培養(yǎng)液終止消化，吸取培養(yǎng)液吹打瓶壁，使細胞脫落更完全，將細胞懸液收集于15 mL離心管中1 500 r/min離心5 min，棄上清，再采用PBS懸浮清洗2次，每次5 min，離心轉(zhuǎn)速為1 500 r/min，最后采用基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸浮細胞沉淀，并按照需求進行分瓶培養(yǎng)或移入細胞培養(yǎng)板，于5% CO2、39 ℃的細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 馬血清誘導(dǎo)成肌細胞的分化

當成肌細胞密度達80%以上時，去除基礎(chǔ)培養(yǎng)液，加入含2% HS的分化培養(yǎng)液，每隔24 h觀察成肌細胞的形態(tài)和肌管融合的情況，并更換細胞培養(yǎng)液。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測基因表達

按照細胞組織RNA提取試劑盒說明書步驟提取細胞組織總RNA，使用超微量分光光度計（NanoPhotometer[KG-*3]N60）儀器檢測RNA濃度和純度，RNA樣品的D260 nm/D280 nm 全部在1.8～2.2范圍內(nèi)。

根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser）說明書步驟，總反應(yīng)體系為 20 μL，分2步進行，第1步去除基因組DNA：4 μL 4×gDNA Wiper Mix、1 μL oligo（dT）23VN、1 μL Random hexamers、10 μL總RNA，反應(yīng)條件42 ℃，2 min；第2步cDNA的合成：在第1步反應(yīng)后的溶液中加入2 μL 10×RT Mix、2 μL Hiscript Ⅱ Enzyme Mix。反應(yīng)條件：50 ℃ 15 min；85 ℃ 2 min；-20 ℃保存。

目標基因的引物委托生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息見表1。進行熒光定量PCR，反應(yīng)體系總體積 20.0 μL：10.0 μL SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL上游引物、0.4 μL下游引物、2.0 μL cDNA模板、7.2 μL ddH2O；反應(yīng)條件為 95 ℃ 預(yù)變性 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。熔解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。

1.2.6 成肌細胞Desmin細胞免疫熒光鑒定

取適量分離的成肌細胞，鋪于12孔板中，待細胞密度達60%～80%后即可利用Desmin的抗體進行細胞免疫熒光化學(xué)鑒定。具體步驟：采用預(yù)冷的PBS清洗細胞3次，每次5 min。再用4%多聚甲醛固定細胞10～15 min，PBS清洗3次，每次5 min。采用0.1% Triton X-100透膜10 min，PBS清洗3次，每次 5 min。用含2% BSA的PBS封閉非特異性位點 1～2 h，于4 ℃用Desmin的兔多克隆一抗（1 ∶50稀釋）孵育12～16 h。PBST（PBS溶液中添加1‰的吐溫-20）清洗3次，每次5 min。于37 ℃采用山羊抗兔FITC標記的二坑孵育1～2 h。PBST清洗3次，每次5 min。DAPI染色5～10 min。PBS清洗3次，每次5 min，加入適量防熒光淬滅劑DABCO后，于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 27.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行獨立樣本t檢驗分析，數(shù)據(jù)結(jié)果表示為“平均值±標準誤”，α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑羽番鴨腿肌成肌細胞分離的時間確定

采用Ⅱ型膠原酶和胰酶混合液消化不同孵化天數(shù)鴨胚腿肌，將收集到的混合細胞培養(yǎng)24 h后觀察，呈現(xiàn)不規(guī)則紡錘形或細長梭形，利用細胞免疫熒光檢測肌細胞特異性表達蛋白Desmin的表達情況。由圖1可知，Desmin蛋白經(jīng)FITC標記后經(jīng)激發(fā)呈現(xiàn)綠色，細胞核經(jīng)DAPI染色后經(jīng)激發(fā)呈現(xiàn)藍色，在E15、E16、E17和E18的鴨胚腿肌分離的未經(jīng)純化的成肌細胞中均有Desmin的表達，且E17腿肌中分離的細胞中有較多的細胞顯示出Desmin的表達。因此，后續(xù)試驗選擇E17的腿肌進行試驗。

2.2 黑羽番鴨腿肌成肌細胞的形態(tài)特征

將17 d鴨胚腿肌進行酶消化處理后，再用差速貼壁法進一步純化3次。由圖2可知，分離得到成肌細胞呈現(xiàn)細長形或者紡錘形，在采用2% HS分化處理48 h后有肌管融合的現(xiàn)象。將差速貼壁處理時，在30 min內(nèi)貼壁的細胞繼續(xù)培養(yǎng)，細胞呈現(xiàn)不規(guī)則紡錘形，進行2% HS處理48 h后細胞形態(tài)沒有變化，說明30 min內(nèi)貼壁的細胞不能被HS誘導(dǎo)分化，即這些快速貼壁的細胞不是成肌細胞，表明差速貼壁法可以有效純化成肌細胞。

2.3 黑羽番鴨成肌細胞中Desmin的表達定位情況

利用細胞免疫熒光技術(shù)檢測純化后的成肌細胞中Desmin的表達情況，由圖3可知，Desmin蛋白經(jīng)FITC標記后經(jīng)激發(fā)呈現(xiàn)綠色，細胞核經(jīng)DAPI染色后經(jīng)激發(fā)呈現(xiàn)藍色，95% 細胞均能顯示Desmin的表達，即呈現(xiàn)綠色，表明分離的黑羽番鴨腿肌成肌細胞純度較好。

2.3 成肌細胞增殖和分化階段特異性表達基因的mRNA表達水平

將分離純化后的成肌細胞利用2% HS進行誘導(dǎo)分化處理48 h，對照組采用基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集細胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后利用熒光定量PCR檢測成肌細胞增殖和分化階段特異性表達基因的mRNA表達水平。由圖4可知，分化處理48 h后，MyoD、MyoG、MyHC、MRF4的mRNA表達水平顯著升高，而Myf5的mRNA表達水平顯著降低。

3 討論

成肌細胞的生長發(fā)育對于肉鴨的生長性狀有著重要影響，關(guān)于肉鴨體外分離成肌細胞培養(yǎng)方法的完善，對肉鴨肌肉發(fā)育的生長發(fā)育研究具有重要意義。

成肌干細胞比例是影響成肌細胞分離成功的重要因素之一，不同品種的水禽孵化期有所不同，肌纖維中肌源干細胞的比例也會隨著蛋胚的發(fā)育而改變。研究表明，在馬崗鵝的鵝胚中分離成肌細胞時，從E23的胸腿肌中分離出成肌細胞的效率明顯比E15中分離的低，且39 ℃較37 ℃更有利于水禽成肌細胞的發(fā)育［10］。櫻桃谷鴨鴨胚發(fā)育至13 d時，比較適合分離培養(yǎng)成肌細胞［3］。研究發(fā)現(xiàn)，在僅利用酶消化法從黑羽番鴨E15、E16、E17、E18腿肌中分離成肌細胞時，細胞免疫熒光結(jié)果顯示，Desmin在從15 d至18 d的鴨胚腿肌中分離獲得的細胞中均有表達，且在E17腿肌分離的細胞中表達量最高，表明E17黑羽番鴨鴨胚最適合分離成肌細胞。酶消化法處理鴨胚腿肌時，會獲得除成肌細胞以外的細胞，主要是成纖維細胞，由于成纖維細胞貼壁的速度較成肌細胞快。因此，在使用酶消化法獲取到成肌細胞混合液后，需要利用差速貼壁法對成肌細胞進行純化。經(jīng)3次差速貼壁處理后，大部分獲取的成肌細胞中均能檢測到Desmin，表明純化效果較好，這與陳凱凱等從肉雞雞胚中分離成肌細胞時的結(jié)果［9］相符合。

成肌細胞可被馬血清誘導(dǎo)分化，2%馬血清誘導(dǎo)分化的效果較1%和5%的效果更好［13］。本試驗中利用2%馬血清對分離獲得的成肌細胞進行誘導(dǎo)分化， 結(jié)果顯示在誘導(dǎo)分化48 h后， 成肌細胞的形態(tài)較對照組比出現(xiàn)肌管融合的現(xiàn)象，而分離培養(yǎng)時 30 min 內(nèi)貼壁的細胞受到馬血清處理后，細胞形態(tài)無變化，提示本試驗中分離純化的細胞是成肌細胞。為進一步確認，分離出來的成肌細胞被誘導(dǎo)處理，確實有開始分化。利用RT-PCR檢測了分化處理前后，成肌調(diào)控因子家族成員的表達及肌纖維分化標志蛋白MyHC的基因表達。結(jié)果顯示，分化處理48 h后，成肌細胞增殖期特異性表達的基因Myf5顯著性降低；分化期特異性表達的基因MyoG、MRF4及MyCH均顯著性增加。此外，成肌調(diào)控因子MyoD的表達也顯著上調(diào)，這與研究中顯示的MyoD的表達在早期分化處理時會出現(xiàn)上調(diào)的現(xiàn)象［14］相符合。

4 結(jié)論

本試驗發(fā)現(xiàn)，黑羽番鴨分離獲取成肌細胞的最佳時間在孵化17 d左右，通過檢測Desmin、成肌調(diào)控因子家族成員及肌纖維分化標志蛋白MyHC的表達，表明利用膠原酶Ⅱ和胰酶消化法結(jié)合多次差速貼壁法可得到純度較高的黑羽番鴨成肌細胞。

參考文獻：

［1］孫國波，董 飚，卞友慶，等. 黑羽番鴨不同飼養(yǎng)方式下生產(chǎn)性能的比較［J］. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（12）：73-74.

［2］Shirakawa T，Toyono T，Inoue A，et al. Factors regulating or regulated by myogenic regulatory factors in skeletal muscle stem cells［J］. Cells，2022，11（9）：1493.

［3］孫文強. Akirin基因調(diào)控鴨成肌細胞增殖與分化的作用研究［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2019：2-38.

［4］陶志云，朱春紅，姬改革，等. 鴨胚骨骼肌成肌細胞中MyoD1和Myf5基因的表達與分析［J］. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2014，43（3）：299-303.

［5］劉宏祥，胡 艷，單艷菊，等. 鴨胚胎發(fā)育早期MyoD和MSTN的表達變化規(guī)律［J］. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，46（6）：79-85.

［6］Vicente-García C，Hernández-Camacho J D，Carvajal J J. Regulation of myogenic gene expression［J］. Experimental Cell Research，2022，419（1）：113299.

［7］Kassar-Duchossoy L，Gayraud-Morel B，Gomès D，et al. Mrf4 determines skeletal muscle identity in Myf5：Myod double-mutant mice［J］. Nature，2004，431（7007）：466-471.

［8］Agnetti G，Herrmann H，Cohen S. New roles for desmin in the maintenance of muscle homeostasis［J］. The FEBS Journal，2022，289（10）：2755-2770.

［9］陳凱凱，張 成，趙 菲，等. 肉雞成肌細胞的分離培養(yǎng)與鑒定［J］. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2020，25（9）：72-79.

［10］王金輝，黃運茂，李秀金，等. 鵝成肌細胞的體外培養(yǎng)、鑒定及溫度對細胞增殖分化的影響［J］. 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報，2020，33（2）：21-27.

［11］喻宗崗，馬海明. 豬骨骼肌衛(wèi)星細胞體外分離培養(yǎng)研究進展［J］. 中國畜牧獸醫(yī)，2022，49（8）：2931-2942.

［12］劉璐璐，胡文萍，尚明玉，等. 湖羊胚胎來源成肌細胞的培養(yǎng)方法改良與特性分析［J］. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2022，41（7）：1440-1451.

［13］孟依然，史成良，宋春雨，等. 采用不同濃度馬血清誘導(dǎo)C2C12肌前體細胞分化的實驗研究［J］. 中國保健營養(yǎng)，2020，30（4）：25.

［14］Sun W Q，Hu S Q，Hu J W，et al. miR-365 inhibits duck myoblast proliferation by targeting IGF-I via PI3K/Akt pathway［J］. Bioscience Reports，2019，39（11）：BSR20190295.