吳小軍 汪漢成 劉亭亭 蔡劉體 孟建玉 彭麗娟

摘要：為研究煙葉不同部位葉際微生物群落在嘧菌酯處理后不同時(shí)期的變化規(guī)律，采用高通量測(cè)序和Biolog代謝表型技術(shù)分別測(cè)定了煙葉不同部位葉際微生物在嘧菌酯處理前后不同時(shí)期的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及代謝功能。結(jié)果表明，相較于處理前，250 g/L嘧菌酯SC（0.15 kg a.i./hm2）處理后0～15 d內(nèi)，葉際真菌群落中，感病與健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌屬種類(lèi)均增加。感病煙葉葉際鏈格孢屬、殼多孢菌屬和莖點(diǎn)霉屬相對(duì)豐度均先增加后降低；枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora則先降低后增加。健康煙葉葉際鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora相對(duì)豐度均先降低后增加；殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬則先增加，并在處理后5 d時(shí)成為新的優(yōu)勢(shì)菌屬。在細(xì)菌群落中，感病與健康煙葉葉際泛菌屬、馬賽菌屬和鞘脂單胞菌屬相對(duì)豐度均持續(xù)降低，感病煙葉葉際的假單胞菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬和甲基桿菌屬豐度先增加后降低。感病煙葉葉際真菌群落多樣性和豐富度持續(xù)增加，細(xì)菌群落多樣性先增加后降低，豐富度先降低后增加；健康煙葉葉際真菌群落多樣性和豐富度先增加后降低，細(xì)菌群落多樣性先降低后增加，豐富度先增加后降低。嘧菌酯處理后5 d時(shí)對(duì)感病煙葉葉際微生物的碳源代謝抑制作用較健康煙葉弱，但10 d時(shí)則均表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制作用。研究結(jié)果揭示了嘧菌酯施用后15 d內(nèi)煙葉葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、多樣性及代謝功能的時(shí)序變化規(guī)律，為了解嘧菌酯防控?zé)煵莩嘈遣〉奈⒂^作用機(jī)制提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：嘧菌酯；煙草赤星?。蝗郝浣Y(jié)構(gòu)；代謝功能；微生物多樣性

中圖分類(lèi)號(hào)：S182；S435.72? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）24-0123-10

煙草（Nicotiana tabacum L.）是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，煙草赤星?。╰obacco brown spot）是國(guó)內(nèi)外煙葉生產(chǎn)中危害較大的真菌性病害，易在上部葉成熟期暴發(fā)，病斑呈黃褐色，具明顯同心輪紋［1-2］。該病害病原菌為鏈格孢屬（Alternaria sp.）真菌，目前已報(bào)道的病原物種類(lèi)有Alternaria alternata、A. longipes和A. tenuissim等［3-4］。當(dāng)前，甲氧基丙烯酸酯類(lèi)殺菌劑嘧菌酯（azoxystrobin）在我國(guó)部分煙葉產(chǎn)區(qū)用于煙草赤星病防治，該藥劑主要作用于細(xì)胞色素Bcl向細(xì)胞色素c的電子轉(zhuǎn)移，抑制病菌線粒體的呼吸作用，從而達(dá)到對(duì)病菌的殺滅作用；對(duì)子囊菌門(mén)、擔(dān)子菌門(mén)和卵菌綱的多種病原菌均有較強(qiáng)的殺菌效果，在防治真菌性病害方面具有較大應(yīng)用前景［5-8］。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)已有關(guān)于嘧菌酯及其復(fù)配劑防控?zé)煵莩嘈遣〉膱?bào)道。Wang等研究發(fā)現(xiàn)嘧菌酯0.094、0.190、0.280 kg a.i./hm2施用3次后，對(duì)煙草赤星病防效可達(dá)86.00%～89.67%［9］。陳杰等報(bào)道32.5%（苯醚甲環(huán)唑+嘧菌酯）懸浮劑對(duì)煙草赤星病防效可達(dá)83.84%［10］。煙草葉斑類(lèi)病害發(fā)生與葉際微生物群落結(jié)構(gòu)和代謝功能變化密切相關(guān)。劉暢等研究發(fā)現(xiàn)，煙草赤星病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌屬為鏈格孢屬［11］，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為泛菌屬（Pantoea）［12］。Dai等研究發(fā)現(xiàn)，煙葉在感染煙草赤星病后其葉際鏈格孢屬隨病情的發(fā)展相對(duì)豐度增加，微生物群落結(jié)構(gòu)呈復(fù)雜的動(dòng)態(tài)變化，且對(duì)碳源的利用率降低［13］。病害防治過(guò)程中施用的化學(xué)藥劑能有效改善植物葉際菌群結(jié)構(gòu)。Qin等研究發(fā)現(xiàn)，噴施生防菌劑可改善煙草葉片微生物群落結(jié)構(gòu)并有效防治煙草野火?。?4］。劉天波等研究發(fā)現(xiàn)，拮抗菌群處理煙葉后其葉際假單胞菌屬（Pseudomonas）和寡氧單胞菌屬（Stenotrophomonas）等菌屬相對(duì)豐度顯著改變，群落多樣性增加［15］。Chen等研究發(fā)現(xiàn)噴施菌核凈后煙葉葉際鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）、寡養(yǎng)單胞菌屬和沙雷氏菌屬（Serratia）等細(xì)菌相對(duì)豐度降低［16］。當(dāng)前，嘧菌酯防控?zé)煵莩嘈遣〉男Ч嗍腔诓∏橹笖?shù)的宏觀評(píng)價(jià)，缺乏從微觀層面分析嘧菌酯對(duì)葉際微生物的影響，特別是藥劑施用后一定時(shí)期內(nèi)煙草葉際微生物群落結(jié)構(gòu)與代謝功能的時(shí)序性變化規(guī)律缺乏認(rèn)識(shí)。因此，本研究采用高通量測(cè)序和Biolog代謝表型技術(shù)分別測(cè)定了嘧菌酯藥劑施用后不同時(shí)期煙葉不同部位葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)、多樣性及代謝功能，從微觀層面揭示嘧菌酯施用后煙葉組織微生態(tài)的變化規(guī)律，以期為煙草赤星病的精準(zhǔn)化學(xué)防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試煙草品種、藥劑及試驗(yàn)器材

供試煙草品種為云煙105，供試藥劑為250 g/L嘧菌酯懸浮劑（SC），購(gòu)自先正達(dá)南通作物保護(hù)有限公司。DNA提取試劑盒（Fast DNA Spin Kit for Soil），購(gòu)自MP Biomedicals生物醫(yī)學(xué)公司；Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns建庫(kù)試劑盒（貨號(hào)：4471252）和GeneJET膠回收試劑盒（貨號(hào)：K0691），均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司（美國(guó)）；Biolog ECO代謝板（貨號(hào)：#1056），購(gòu)自Biolog公司（美國(guó)，CA，Hayward）。背負(fù)式電動(dòng)噴霧器（型號(hào)：3WBD-20L），購(gòu)自超農(nóng)力智慧科技有限公司（浙江，中國(guó)）；自動(dòng)氣象站［由雨量計(jì)（MC-YL）、溫度計(jì)（MC-KWS）和濕度計(jì)（MC-KWS）等組成］，購(gòu)自北京新紅科技有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

試驗(yàn)于2020年8月29日至9月16日在貴州省畢節(jié)市威寧縣黑石頭鎮(zhèn)煙區(qū)進(jìn)行，選擇明顯感染煙草赤星病的煙田開(kāi)展試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 藥劑處理

本試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，各小區(qū)隨機(jī)排列，小區(qū)內(nèi)煙株長(zhǎng)勢(shì)一致且煙葉發(fā)病情況基本一致。每個(gè)小區(qū)80株煙，小區(qū)四周設(shè)保護(hù)行。嘧菌酯制劑的用量為40 g/666.67 m2（0.15 kg a.i./hm2），用水量為60 L/666.67 m2，使用背負(fù)式噴霧器對(duì)煙株正、反葉面進(jìn)行均勻噴施，以見(jiàn)藥液均勻分布至煙葉正反面為準(zhǔn)。

1.2.2 環(huán)境因子與病情指數(shù)的調(diào)查

使用自動(dòng)氣象站調(diào)查并記錄試驗(yàn)點(diǎn)的環(huán)境因子（降水量、溫度、空氣相對(duì)濕度）。同時(shí)分別在處理前（0 d），處理后5、10、15 d各小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取10株煙調(diào)查煙葉的發(fā)病情況，計(jì)算病情指數(shù)［17］。

1.2.3 樣品采集

于處理前0 d及處理后5、10、15 d，分別在經(jīng)嘧菌酯處理的3個(gè)小區(qū)內(nèi)隨機(jī)取樣，用經(jīng)消毒的剪刀剪取中上部煙葉的感病部位與健康部位煙葉樣品（10 g），分別裝入50 mL無(wú)菌離心管中，將從同一小區(qū)內(nèi)采集的感病與健康煙樣分別混合作為感病組與健康組中1個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，以感病組與健康組之間互為對(duì)照。樣品采集后放入低溫保存箱，并迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，一部分用于代謝功能研究（5 g），另一部分放置-80 ℃冰箱保存用于擴(kuò)增子測(cè)序，樣品編號(hào)詳情見(jiàn)表1。

1.2.4 煙草葉際微生物基因組測(cè)序分析

參照DNA提取試劑盒說(shuō)明對(duì)不同時(shí)期所取煙葉樣品中微生物基因組DNA進(jìn)行提取，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其純度和濃度。再將提取的DNA用無(wú)菌水稀釋至濃度為1 ng/μL，并以此為模板，分別使用真菌引物ITS1-1F-R（5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′）和ITS1-5F-F（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′）及細(xì)菌引物806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）和515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′），參照Huang等的PCR擴(kuò)增體系及程序?qū)λ悠氛婢鶬TS1區(qū)域與細(xì)菌V4區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增［18］。參照Dai等的方法［13，19］進(jìn)行測(cè)序分析，樣品中真菌、細(xì)菌分別與Unit（v7.2）和SSUrRNA數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)注釋?zhuān)⑶覍?duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理，分析各樣本在門(mén)屬水平上的群落組成；使用Qiime軟件計(jì)算α多樣性指數(shù)，使用corr.test函數(shù)計(jì)算環(huán)境因子與微生物α多樣性及物種間的相互變化關(guān)系數(shù)值并進(jìn)行Spearman分析，此過(guò)程在北京諾禾致源科技股份有限公司完成。原始測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至GenBank（BioProject ID：PRJNA882617、Biosample accession ID：SUB12086680和BioProject ID：PRJNA882598、Biosample accession ID：SUB120 85061）。

1.2.5 煙草葉際微生物碳源代謝功能分析

分別取不同時(shí)期感病與健康混合煙樣各2 g，分別置于盛有100 mL 0.8%無(wú)菌生理鹽水的300 mL三角瓶中，在28 ℃、180 r/min振蕩2 h，將振蕩液靜置 30 min。用移液槍吸取100 μL上清液加入到ECO代謝板的測(cè)試孔中，將接完菌的ECO代謝板密封并置于OmniLog恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃下培養(yǎng)7 d。使用Biolog D5E_OKA_data.exe軟件收集該過(guò)程中代謝孔內(nèi)顏色變化值，使用HemI軟件根據(jù)代謝孔顏色變化值制作熱圖分析，對(duì)不同時(shí)期煙葉樣品的微生物代謝功能進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

使用DPS 7.5與Excel 2017軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 環(huán)境因子及病情指數(shù)

試驗(yàn)開(kāi)展期間該地區(qū)大部分時(shí)間有小雨。自動(dòng)氣象站測(cè)量結(jié)果顯示，在處理前0 d及處理后0～[JP3]5、5～10、10～15 d的日平均降水量（R）分別為13.60、19.00、11.3、25.4 mm；日平均氣溫（T）分別為18.32、18.97、17.51、16.54 ℃；日平均空氣相對(duì)濕度分別為82.49%、83.81%、78.99%和90.98%。處理前 0 d 及處理后5、10、15 d的病情指數(shù)（DI）分別為44.44、48.14、63.58、70.55；處理后5、10、15 d的相對(duì)防效分別為81.75%、53.93%和54.95%（表2）。

2.2 煙草葉際真菌和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

2.2.1 OTU聚類(lèi)

Venn圖分析結(jié)果表明，在OTU水平，感病與健康煙葉葉際真菌群落共有的OTU數(shù)分別為15、25種（圖1-A、圖1-B），葉際細(xì)菌群落共有的OTU數(shù)分別為9、5種（圖1-C、圖1-D）。感病與健康煙葉葉際共有的真菌屬為鏈格孢屬、亞隔孢殼屬（Didymella）、枝孢霉屬（Cladosporium）和附球菌屬（Epicoccum）等，而健康煙葉葉際特有的真菌屬為尾孢屬（Cercospora）、盤(pán)菌屬（Botryotinia）和黑團(tuán)孢屬（Periconia）等，感病與健康煙葉葉際共有的細(xì)菌屬為泛菌屬，感病煙葉特有的細(xì)菌屬為假單胞菌屬、鞘脂單胞菌屬和腸桿菌屬（Enterobacter）等。在處理前0 d和處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際真菌群落特有的OTU數(shù)分別為8、4、10、48種；細(xì)菌群落特有的OTU數(shù)分別為12、4、143、32種。健康煙葉葉際真菌特有的OTU數(shù)分別為38、75、45、39種；細(xì)菌群落特有的OTU數(shù)分別為15、5、100、80種。以上結(jié)果表明，感病煙葉葉際真菌群落共有OTU數(shù)低于健康煙葉；細(xì)菌群落共有OTU數(shù)高于健康煙葉。嘧菌酯處理后感病煙葉葉際真菌群落特有OTU數(shù)均呈先降低后增加趨勢(shì)；健康煙葉葉際真菌群落特有OTU數(shù)呈先增加后降低趨勢(shì)，感病與健康煙葉葉際細(xì)菌群落特有OTU數(shù)均呈先降低后增加再降低趨勢(shì)。

2.2.2 煙草葉際真菌和細(xì)菌門(mén)水平群落結(jié)構(gòu)

在真菌群落門(mén)水平上，處理前0 d，感病（AJB0）與健康（AJJ0）煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌門(mén)均為子囊菌門(mén)（Ascomycota，93.38%和62.84%）和擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota，2.63%和6.74%）。在處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度分別為92.52%和1.04%、92.43%和1.75%、80.61%和3.83%；健康煙葉葉際子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度分別為66.27%和3.74%、61.55%和2.24%、50.86%和5.21%。其中，在處理前，感病煙葉葉際擔(dān)子菌門(mén)相對(duì)豐度均明顯低于健康煙葉，而在處理前后不同時(shí)期，感病煙葉葉際子囊菌門(mén)相對(duì)豐度均明顯高于健康煙葉（圖2-A）。

在細(xì)菌群落門(mén)水平上，處理前0 d，感?。ˋJB0）煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌門(mén)（Proteobacteria，38.38%）；健康（AJJ0）煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為變形菌門(mén)（6.96%）和厚壁菌門(mén)（Firmicutes，16.05%），其中，感病煙葉葉際變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于健康煙葉。在處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際變形菌門(mén)相對(duì)豐度分別為32.66%、12.79%和34.90%；健康煙葉葉際變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度分別為4.60%和0.11%、2.24%和0.79%、12.35%和6.85%；感病煙葉葉際厚壁菌門(mén)（2.24%）在處理后10 d增加成為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)，其在處理后15 d相對(duì)豐度為12.01%。處理前0 d和處理后5、10 d，感病煙葉葉際變形菌門(mén)相對(duì)豐度顯著高于健康煙葉（圖 2-B）。

2.2.3 煙草葉際真菌和細(xì)菌屬水平群落結(jié)構(gòu)

在真菌群落屬水平，在處理前0 d和處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌及相對(duì)豐度分別為鏈格孢屬（84.10%、86.61%、67.80%和73.84%）、枝孢霉屬（6.62%、2.21%、1.07%和2.21%）、殼多孢菌屬（Stagonosporopsis，0.43%、0.86%、10.60%和0.55%）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma，0.00%、0.46%、6.10%和0.06%）和Symmetrospora（2.27%、1.04%、1.16%和3.58%），健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌及相對(duì)豐度分別為鏈格孢屬（35.66%、25.92%、49.30%和39.49）、枝孢霉屬（14.83%、10.05%、2.76%和2.27%）、亞隔孢殼屬（Didymella，2.67%、1.04%、1.32%和0.89%）、殼多孢菌屬（0.55%、2.94%、2.33%和0.52%）、假絲酵母屬（Candida，0.00%、0.77%、1.99%和11.12%）、浪梗霉屬（Polythrincium，0.00%、6.99%、0.00%和0.00%）、Symmetrospora（5.61%、1.56%、2.02%和4.69%）、蠟殼菌屬（Sebacina，0.00%、1.10%、0.00%和0.00%）和Diutina（0.00%、0.15%、0.31%和1.38%）（圖3-A）。其中，在處理前后各個(gè)時(shí)期，感病煙葉葉際鏈格孢屬相對(duì)豐度均明顯高于健康煙葉；在處理后5 d，健康煙葉葉際假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬相對(duì)豐度顯著高于感病煙葉以及其他各個(gè)取樣時(shí)期的健康煙葉；在處理前0 d，健康煙葉葉際亞隔孢殼屬和枝孢霉屬相對(duì)豐度明顯高于感病煙葉以及處理后10、15 d的感病煙葉。

在細(xì)菌群落屬水平，在處理前0 d和處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌及相對(duì)豐度分別為泛菌屬（22.78%、5.95%、3.59%和10.77%）、假單胞菌屬（5.61%、20.76%、1.57%和0.56%）、鞘脂單胞菌屬（6.17%、1.57%、0.67%和0.11%）和馬賽菌屬（Massilia，2.13%、1.35%、0.56%和0.00%）、甲基桿菌屬（Methylobacterium，0.00%、0.00%、3.14%和0.11%）、乳球菌屬（Lactococcus，0.00%、0.00%、1.57%和11.56%）和腸桿菌屬（Enterobacter，0.22%、0.79%、1.01%和6.06%），健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)細(xì)菌屬為泛菌屬（6.73%、0.56%、0.45%和3.37%）、魏斯氏菌屬（Weissella，15.38%、0.00%、0.00%和0.00%）、乳球菌屬（0.00%、0.00%、0.45%和5.16%）和腸桿菌屬（0.00%、0.22%、0.45%和3.82%）（圖3-B）。其中，處理前0 d，健康煙葉葉際魏斯氏菌屬明顯高于健康煙葉以及其他各個(gè)取樣時(shí)期的健康煙葉；處理后5 d感病煙葉葉際假單胞菌屬明顯高于健康煙葉以及其他各個(gè)取樣時(shí)期的感病煙葉。

2.3 煙草葉際真菌和細(xì)菌α多樣性

本研究所測(cè)感病與健康煙葉樣品中葉際真菌和細(xì)菌的覆蓋度指數(shù)均大于0.82，表明本次樣品的

測(cè)序結(jié)果能夠合理反映其葉際微生物的多樣性。嘧菌酯處理后，感病與健康煙葉葉際微生物多樣性（香濃指數(shù)）與豐富度（Chao1與ACE指數(shù)）指數(shù)均不同程度發(fā)生改變（表3）。于真菌方面，在處理前 0 d，感?。ˋJB0）煙葉葉際真菌多樣性和豐富度指數(shù)均顯著低于健康煙葉（AJJ0）（P<0.05，下同）。在處理后0～15 d，感?。ˋJB）煙葉葉際真菌多樣性指數(shù)呈先降低后增加趨勢(shì)，豐富度指數(shù)呈持續(xù)增加趨勢(shì)；健康（AJJ）煙葉葉際真菌多樣性指數(shù)呈先增加后降低再增加趨勢(shì)，豐富度指數(shù)呈先增加后降低趨勢(shì)。其中，在處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際真菌群落多樣性指數(shù)均顯著低于健康煙葉；在處理后5、10 d，感病煙葉葉際真菌豐富度指數(shù)均顯著低于健康煙葉。

細(xì)菌方面，在處理前0 d，感病煙葉葉際細(xì)菌多樣性和豐富度指數(shù)均高于健康煙葉，但差異不顯著。在處理后0～15 d，感病煙葉葉際細(xì)菌多樣性指數(shù)呈先增加后降低趨勢(shì)，豐富度指數(shù)呈先降低后增加再降低趨勢(shì)；健康煙葉葉際細(xì)菌多樣性指數(shù)呈先降低后增加趨勢(shì)，豐富度指數(shù)呈先增加后降低趨勢(shì)。其中，在處理后5、10、15 d，感病煙葉葉際細(xì)菌多樣性指數(shù)均高于健康煙葉，在處理后5、10 d，感病煙葉葉際細(xì)菌豐富度指數(shù)均高于健康煙葉，在處理后15 d，感病煙葉葉際細(xì)菌豐富度指數(shù)低于健康煙葉，但差異均不顯著。

2.4 Spearman相關(guān)性

本研究對(duì)樣品的取樣時(shí)間、環(huán)境因子（平均溫度、相對(duì)濕度、降水量）及病情指數(shù)與其葉際top50的菌屬進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，來(lái)研究環(huán)境因子與微生物α多樣性和物種之間的相互變化關(guān)系。結(jié)果表明，在真菌屬水平，取樣時(shí)間與伊薩酵母屬（Issatchenkia）相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與靈芝屬（Ganoderma）相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)，與Hannaella相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。降水量與Filobasidium相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。溫度與靈芝屬相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)。病情指數(shù)與鏈格孢屬相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)，與亞隔孢殼屬、黑團(tuán)孢霉屬（Periconia）、尾孢菌屬、鐮刀菌屬（Fusarium）相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與曲霉屬（Aspergillus）、殼二孢屬（Ascochyta）、小不整球殼屬（Plectosphaerella）及雙足囊菌屬（Dipodascus）相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)（圖4-A）。

在細(xì)菌屬水平，取樣時(shí)間與乳球菌屬和腸桿菌屬相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)，與腸球菌屬（Enterococcus）和Serratia相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與魏斯氏菌屬相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。降水量和空氣相對(duì)濕度均與果膠桿菌屬（Pectobacterium）相對(duì)豐度極顯著正相關(guān)，與腸球菌屬和Serratia相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)，與擬桿菌屬（Bacteroides）相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與Alloprevotella相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。溫度與乳球菌屬相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)，與腸桿菌屬、Serratia和腸球菌屬相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)。病情指數(shù)與馬賽菌屬和假單胞菌屬相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)（圖4-B）。

2.5 煙草葉際微生物碳源代謝

Biolog ECO代謝板中含有可供自然界中大部分微生物利用的碳源物質(zhì)，其中包括氨基酸、有糖類(lèi)和羧酸類(lèi)等共31種碳源。嘧菌酯對(duì)感染煙草赤星病煙葉葉際微生物代謝功能的影響如圖5所示，在處理前，感病（AJB0）煙葉葉際微生物可高效代謝（顏色值變化值>200）除α-丁酮酸（α-ketobutyric acid）及L-蘇氨酸（L-threonine）外的29種碳源，健康（AJJ0）煙葉葉際微生物可高效代謝除α-丁酮酸外的30種碳源。

在嘧菌酯處理后的5、10、15 d內(nèi)，感病與健康煙葉葉際微生物對(duì)31種碳源代謝均受到不同程度抑制。在感病煙葉葉際微生物代謝方面，處理后 5 d，其葉際微生物（AJB1）可高效代謝26種碳源，主要包括N-乙酰-D-葡萄糖胺（N-acetyl-D-Glucosamine）、D-葡萄糖胺酸（D-galacturonic acid）和L-苯基丙氨酸（L-phenylalanine）等，5種碳源代謝受到抑制，包括D-木糖（D-xylose）、α-丁酮酸和I-赤蘚糖醇（I-erythritol）等；處理后 10 d，其葉際微生物（AJB2）的代謝功能進(jìn)一步受到抑制，無(wú)可高效代謝的碳源；處理后15 d，其葉際微生物（AJB3）的大部分代謝功能恢復(fù)，可高效代謝28種碳源，包括D-半乳糖酸內(nèi)酯（D-galactonic acid lactone）、4-羥基苯甲酸（4-hydroxy benzoic acid）和L-天冬酰胺酸（L-asparagine）等，代謝仍受到抑制的碳源有D-木糖、2-羥基苯甲酸（2-hydroxy benzoic acid）及4-羥基苯甲酸。

在健康煙葉葉際微生物代謝方面，處理后5 d，其葉際微生物（AJJ1）可高效代謝11種碳源，包括 β-甲基-D-葡萄糖苷（β-methyl-D-glucoside）、D-葡萄糖胺酸和γ-羥基丁酸（γ-hydroxybutyric acid）等，對(duì)20種碳源代謝受到抑制，包括丙酮酸甲酯、2-羥基苯甲酸和α-丁酮酸等；處理后10 d，其葉際微生物（AJJ2）的代謝功能進(jìn)一步受到抑制，僅可高效代謝L-天冬酰胺酸和 D-[JP+1]蘋(píng)果酸（D-malic acid）2 種碳源，29種碳源代謝受到抑制；處理后15 d，其葉際微生物（AJJ3）代謝功能大部分恢復(fù)，可高效代謝除α-丁酮酸、4-羥基苯甲酸、D-木糖、2-羥基苯甲酸4種碳源外的27種碳源。

3 討論與結(jié)論

煙草葉斑類(lèi)病害的發(fā)生與其葉際微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，煙葉發(fā)病后其葉際菌群落結(jié)構(gòu)隨之發(fā)生改變［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，嘧菌酯處理前，感病與健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌均為鏈格孢屬、枝孢霉屬和Symmetrospora等，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌均為泛菌屬。結(jié)果與劉暢等關(guān)于煙草赤星病煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌和細(xì)菌報(bào)道結(jié)果類(lèi)似［11-12］，進(jìn)一步驗(yàn)證鏈格孢屬為感赤星病煙葉葉際絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。本研究發(fā)現(xiàn)煙葉葉際還存在另一種葉斑病病原菌亞隔孢殼屬［18］。嘧菌酯處理后0～15 d內(nèi)，感病煙葉葉際鏈格孢屬、殼多孢菌屬和莖點(diǎn)霉屬相對(duì)豐度先增加后降低，枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora相對(duì)豐度先降低后增加，健康煙葉葉際鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora相對(duì)豐度均先降低后增加，殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬相對(duì)豐度先增加后降低。此結(jié)果與何濤等報(bào)道施用烯酰嗎啉后葡萄葉際白粉菌屬和赤霉屬等真菌屬豐度上升，枝孢屬和鏈格孢屬等真菌屬豐度下降類(lèi)似［21］?；瘜W(xué)藥劑的使用是植物葉際微生物群落結(jié)構(gòu)改變的一個(gè)重要影響因素［22］。本研究中，嘧菌酯處理后煙葉葉際致病菌鏈格孢屬和亞隔孢殼屬等多個(gè)病原菌菌屬較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)處于較低豐度，表明該藥劑對(duì)多種煙草葉斑病害均有較好防效，同時(shí)也進(jìn)一步說(shuō)明了該藥劑的廣譜性和持效性［23-24］。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)在處理后5 d煙葉葉際殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬相對(duì)豐度顯著增加。有研究報(bào)道，自然界有部分特殊微生物能夠降解農(nóng)藥并利用農(nóng)藥作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)［25］。微生物群落生物量增加后可通過(guò)拮抗和競(jìng)爭(zhēng)等作用機(jī)制抑制病菌生長(zhǎng)［22］。推測(cè)嘧菌酯抑制了部分病原菌的生長(zhǎng)，同時(shí)為殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬等增殖創(chuàng)造了條件，但上述菌屬是否能降解并利用嘧菌酯作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。

微生物作為葉際微生態(tài)的重要組成部分［26］，在長(zhǎng)期的自然選擇下，真菌和細(xì)菌分別適應(yīng)煙葉葉際環(huán)境形成了一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)［22］。研究表明，煙葉真菌性病害發(fā)生后，其葉際真菌豐富度和多樣性均降低，而細(xì)菌性病害則相反［27-29］。本研究發(fā)現(xiàn)，處理前感病煙葉葉際真菌豐富度和多樣性指數(shù)均低于健康煙葉，感病煙葉葉際細(xì)菌豐富度和多樣性指數(shù)則高于健康煙葉，結(jié)果與前人研究基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了煙葉感病后豐富度和多樣性的變化規(guī)律。嘧菌酯處理后，感病與健康煙葉葉際真菌群落豐富度和多樣性增加，細(xì)菌群落豐富度和多樣性短時(shí)間內(nèi)降低后隨時(shí)間延長(zhǎng)迅速增加。嘧菌酯被報(bào)道主要用于真菌性病害和卵菌病害的防治，其對(duì)葉際細(xì)菌微生態(tài)的改變，可能是由于其影響了葉際真菌菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也隨之變化，已有的研究發(fā)現(xiàn)嘧菌酯能夠通過(guò)抑制與藍(lán)藻存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系的綠藻促進(jìn)藍(lán)藻的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，改變水體環(huán)境中微生物群落結(jié)構(gòu)［30］。因此，嘧菌酯是否也對(duì)煙草葉際細(xì)菌具有抑菌活性有待下一步通過(guò)敏感性測(cè)定進(jìn)行驗(yàn)證。

植物葉際菌群結(jié)構(gòu)與所處環(huán)境密切相關(guān)，溫度、紫外線、降雨等環(huán)境因子均影響著葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)，植物葉際真菌和細(xì)菌復(fù)雜的時(shí)空分布是各種環(huán)境因子與寄主植物相互作用的結(jié)果［20］。本文發(fā)現(xiàn)，病情指數(shù)與真菌群落中的鏈格孢屬及細(xì)菌群落中的馬賽菌屬和假單胞菌屬相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)，取樣時(shí)間與真菌群落中的靈芝屬及細(xì)菌群落中的乳桿菌屬和腸桿菌屬相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)。[JP+1]推測(cè)隨著煙葉病情的發(fā)展，病原菌鏈格孢屬與亞隔孢殼屬和鐮孢菌屬間存在某種復(fù)雜的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。微生物在植物葉際定殖存在優(yōu)先效益［31］。已有的研究發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬為葉際初級(jí)定殖菌，可保護(hù)次級(jí)定殖菌抵御環(huán)境脅迫［32］。該發(fā)現(xiàn)與本文中取樣時(shí)間與各菌屬之間的相關(guān)性基本符合。表明煙草葉際菌群演替過(guò)程還受到微生物優(yōu)先效益影響。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)溫度與真菌群落中的靈芝屬及細(xì)菌群落中的乳桿菌屬相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)，這與韓秋影等報(bào)道假單胞菌屬和Thalassospira等細(xì)菌屬隨溫度升高數(shù)量急劇降低類(lèi)似［33］，進(jìn)一步說(shuō)明了本研究嘧菌酯對(duì)葉際微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響中，環(huán)境因子也起到了一定影響。

碳源是微生物生長(zhǎng)代謝所必需的基本物質(zhì)，Biolog ECO代謝板內(nèi)含有自然界大部分微生物所能代謝的31種常見(jiàn)碳源［34］。本研究測(cè)定了感赤星病煙葉處理前及處理后不同時(shí)期感病與健康煙葉葉際微生物對(duì)糖類(lèi)、羧酸類(lèi)、氨基酸、聚合物類(lèi)、胺類(lèi)和酚類(lèi)等6類(lèi)共31種碳源代謝活性，發(fā)現(xiàn)處理前，感病與健康煙葉均可高效代謝除α-丁酮酸和L-蘇氨酸外的29種碳源。結(jié)果與劉亭亭等發(fā)現(xiàn)感病與健康煙葉葉際微生物均較弱代謝2-羥基苯甲酸和L-苯基丙氨酸等碳源結(jié)果類(lèi)似［35］。因此，是否可以通過(guò)使用α-丁酮酸和L-蘇氨酸來(lái)調(diào)控?zé)熑~葉際環(huán)境進(jìn)而防控?zé)煵莩嘈遣?，有待下一步?yàn)證。在嘧菌酯處理后，感病與健康煙葉葉際微生物碳源代謝活性差異較大，在5 d時(shí)對(duì)感病煙葉葉際微生物的碳源代謝活性抑制作用較弱，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，在10 d時(shí)對(duì)感病與健康葉際微生物的碳源代謝活性均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，結(jié)果與劉亭亭等報(bào)道的波爾多液處理可抑制煙草葉際微生物碳源代謝結(jié)果類(lèi)似［36］，表明該藥劑發(fā)揮作用所需較長(zhǎng)時(shí)間且具有持效性，適合發(fā)病初期使用。

本研究發(fā)現(xiàn)感赤星病煙葉與健康煙葉葉際微生物的群落結(jié)構(gòu)、多樣性和代謝功能在嘧菌酯施用后不同時(shí)期的變化規(guī)律存在共性與差異。在嘧菌酯處理后0～15 d內(nèi)，感病與健康煙葉葉際優(yōu)勢(shì)真菌屬種類(lèi)均增加，感病煙葉葉際鏈格孢屬、殼多孢菌屬和莖點(diǎn)霉屬相對(duì)豐度均先增加后降低；枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora則先降低后增加。健康煙葉葉際鏈格孢屬、枝孢霉屬、亞隔孢殼屬和Symmetrospora相對(duì)豐度均先降低后增加；殼多孢菌屬、假絲酵母屬、浪梗霉屬和蠟殼菌屬則先增加，并在處理后第5 d時(shí)成為新的優(yōu)勢(shì)菌屬。感病與健康煙葉葉際泛菌屬、馬賽菌屬和鞘脂單胞菌屬相對(duì)豐度均持續(xù)降低；感病煙葉葉際的假單胞菌屬、乳桿菌屬、腸桿菌屬和甲基桿菌屬豐度先增加后降低。感病煙葉葉際真菌群落多樣性和豐富度持續(xù)增加，細(xì)菌群落多樣性先增加后降低，豐富度先降低后增加；健康煙葉葉際真菌群落多樣性和豐富度先增加后降低，細(xì)菌群落多樣性先降低后增加，豐富度先增加后降低。

嘧菌酯處理后5 d時(shí)對(duì)感病煙葉葉際微生物的碳源代謝抑制作用較健康煙葉弱，但10 d時(shí)則均表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制作用。本文從微觀層面揭示了嘧菌酯施用后感病與健康煙葉葉際微生物在不同時(shí)期變化規(guī)律的差異，為煙草赤星病的精準(zhǔn)化學(xué)防控提供一定理論參考。

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