吳祝華 詹德智 施季森 席夢利

摘要：以宜昌百合為材料，通過在百合組織培養(yǎng)基中加入不同體積質(zhì)量濃度的尖孢鐮刀菌毒素粗提液培養(yǎng)百合組培苗，建立了高效的百合抗尖孢鐮刀菌鱗莖腐爛病的鑒定體系，即在MS附加0.2 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA+蔗糖3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）+瓊脂6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），pH值為5.8的培養(yǎng)基中，加入100? mg/L尖孢鐮刀菌毒素粗提液，接種百合組培苗，觀察發(fā)病情況與計(jì)算病情指數(shù)來確定百合材料的抗病能力。以此鑒定體系對20份百合材料進(jìn)行抗病鑒定，認(rèn)為初夏、藥百合、淡黃花百合、岷江百合、雨荷、毛百合等為高抗種質(zhì)，適合選為抗性育種親本；南川百合、瀘定百合、卷丹、川百合為中抗種質(zhì)；卷丹（宜興百合）、青島百合、野百合、渥丹、金角、布魯內(nèi)羅為中感種質(zhì)，百合丹東種源、宜昌百合、細(xì)葉百合及百合為高感種質(zhì)。本研究結(jié)果為百合抗性育種提供親本選擇的參考。

關(guān)鍵詞：尖孢鐮刀菌；毒素；百合；病情指數(shù)；抗性

中圖分類號：S682.2+65.01? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-1302（2023）24-0090-05

百合是世界第五大鮮切花，在我國廣泛生產(chǎn)栽培，但是尖孢鐮刀菌百合?；停‵usarium oxysplorum f. sp.lilii）引起的鱗莖腐爛病一直是影響百合切花生產(chǎn)的產(chǎn)量與質(zhì)量的主要因素［1-2］。為了培育抗病新品種，育種研究者希望能找到高抗種質(zhì)。而我國百合資源豐富，對我國的百合資源進(jìn)行尖孢鐮刀菌的抗性評價(jià)是獲得高抗種質(zhì)的基礎(chǔ)。百合的抗性評價(jià)多采用田間接種觀察分級的方法，如李潤根等利用盆插鱗片接種菌塊，然后形態(tài)觀察鱗片感病程度并進(jìn)行分級，來鑒定9種食用百合種質(zhì)資源對枯萎病的抗性能，認(rèn)為蘭州為高抗，鐵炮卷丹、 廣西高片、萬載柳片為中抗［3］。但該方法受栽培環(huán)境生態(tài)因子的影響。致病過程中起重要作用的毒素（如fusaric acid），尤其在病菌侵入寄主后，可引致維管束細(xì)胞產(chǎn)生褐變、壞死等病理變化［4-5］。以一定濃度的毒素粗提液添加到MS培養(yǎng)基中，離體培養(yǎng)百合鱗片，觀察其生長致病情況，對其抗性進(jìn)行評價(jià)。該方法比田間接種方法更容易控制，環(huán)境與生長因子一致，使結(jié)論更科學(xué)客觀。彭綠春等采用百合尖孢鐮刀菌培養(yǎng)濾液，在瓶內(nèi)對百合組培苗8 個(gè)品種進(jìn)行鐮刀菌枯萎病抗性鑒定［6］。丁丁等對2個(gè)東方百合品種的愈傷組織附加不同濃度的枯萎病菌毒素粗提液，用于抗尖孢鐮刀菌無性系的離體篩選［7］。張藝萍等測定了百合抗病無性系和感病無性系在用尖孢鐮刀菌毒素誘導(dǎo)后的POD、PAL、PPO、β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶的活性變化，以揭示毒素篩選無性系的生化抗性機(jī)制，但前人的研究涉及種及品種較少［8］。我國百合資源豐富，是世界百合資源中心，筆者在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步改進(jìn)百合品種鐮刀菌枯萎病抗性室內(nèi)鑒定體系，對筆者所在實(shí)驗(yàn)室收集、保存的16、2個(gè)品種及筆者所在實(shí)驗(yàn)室選育的2個(gè)新品種進(jìn)行抗性鑒定。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

尖孢鐮刀菌百合?；椭虏【隇樵颇限r(nóng)科院花卉所惠贈。百合材料為近年來南京林業(yè)大學(xué)百合課題組實(shí)驗(yàn)室從我國西南、西北、華中、東北等地收集的野生百合種及栽培品種（表1）。其中，百合野生種有南川百合（L. rosthornii）、淡黃花百合（L. sulphureum）、岷江百合（L. regale）、宜興百合（L. lancifolium）、細(xì)葉百合（L. pumilum）、川百合（L. davidii）等16種；栽培品種有金角（Golden Horn）、布魯內(nèi)羅（Brunello）以及筆者所在課題組選育的新品種初夏（Mid-May）、雨荷（Water Lily Dew）。供試的20種（含品種）百合均選擇鱗莖直徑約1 cm且具有數(shù)張基生葉的組培苗進(jìn)行抗性鑒定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 百合?；图怄哏牭毒舅貫V液的制備 試驗(yàn)于2019年3—6月在南京林業(yè)大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。百合?；图怄哏牭毒舅貫V液的制備參照文獻(xiàn)［5-6］中的方法并略加修改。供試菌株（FOX-2）接種于PSA平板培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，用內(nèi)徑5 mm的打孔器沿菌落邊緣取菌片，接種于含200 mL改良Richard液體培養(yǎng)基的三角瓶中，每瓶接種5個(gè)菌片，置于25 ℃、120 r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)28 d，每個(gè)處理重復(fù)3次。培養(yǎng)液經(jīng)過4層紗布過濾除去菌絲體，收集濾液，再經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜過濾，棄去沉淀，上清液即為尖孢鐮刀菌毒素濾液。取少量毒素在HEλIOSγ型紫外可見分光光度計(jì)上測濾液中的鐮刀菌酸（FA）濃度，剩余毒素濾液保存于4 ℃冰箱中。

1.2.2 鐮刀菌毒素濾液中FA含量的測定 以Sigma公司的鐮刀菌酸（fusaric acid，F(xiàn)A）為標(biāo)準(zhǔn)品，用HEλIOSγ型紫外分光光度計(jì)測定不同濃度（10、25、50、100 mg/L）下標(biāo)準(zhǔn)FA的紫外（λ=268 nm）吸收圖譜及吸光度，以光密度為縱坐標(biāo)、FA濃度為橫坐標(biāo)繪制FA標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程。在HEλIOSγ型分光光度計(jì)上測定并計(jì)算濾液中FA的含量。在同一條件下測定毒素試樣的吸光度（D），根據(jù)以下公式計(jì)算出其中的毒素含量（以鐮刀菌酸計(jì)，mg/L）。

試樣鐮刀菌酸（FA）含量=（試樣D×標(biāo)樣鐮刀菌酸含量）/標(biāo)樣D。

1.2.3 MS-FA毒素篩選平臺的建立 將制備的百合?；图怄哏牭毒舅貫V液按不同體積比加入百合MS組織培養(yǎng)基［MS附加0.2 mg/L 6-BA+ 0.5 mg/L NAA+蔗糖3%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）+瓊脂6%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同），pH值5.8］中，配制成含毒素劑量分別為60、80、100? mg/L的毒素培養(yǎng)基，以宜昌百合為材料，將宜昌百合組培苗用刀片切去鱗莖基部一薄層后植入含毒素培養(yǎng)基中，每個(gè)處理5瓶，每瓶3株組培苗，以不含毒素的培養(yǎng)基為對照。毒素處理7 d后統(tǒng)計(jì)組培苗的發(fā)病率及病情指數(shù)。以每個(gè)處理3次重復(fù)的平均值作為結(jié)果。找出致病的最佳毒素濃度，而后用該濃度的FA-MS培養(yǎng)基對所有材料進(jìn)行抗病評價(jià)。

病情調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)和病害嚴(yán)重度分級標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［7］中的方法。病害嚴(yán)重度：0級，無病癥；1級，<25％ 葉片黃化，鱗莖基部變褐色；2級，≥25％～50％葉片黃化，鱗莖外層鱗片腐爛；3級，≥50％～75％葉片黃化，鱗莖中度腐爛；4級，≥75％ 葉片黃化，鱗莖嚴(yán)重腐爛；5級，鱗莖完全腐爛，整株枯死。

病情指數(shù)計(jì)算公式為：病情指數(shù)=［∑（病級苗數(shù)×病級）/（苗數(shù)總和×發(fā)病最重級）］×100。

百合品種（種）抗性等級按樣本的平均病情指數(shù)劃分：高抗（HR）<20.0，中抗（MR） 20.0～<50.0，中感（MS）50.0～<80.0，高感（HS）≥80.0。

1.2.4 試驗(yàn)材料抗性鑒定 以“1.2.3”節(jié)中建立的篩選平臺對20種（含品種）百合組培苗進(jìn)行抗性測定。百合組培苗移植到含毒素培養(yǎng)基上，處理7 d后統(tǒng)計(jì)組培苗的發(fā)病率及病情指數(shù)。每個(gè)處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適培養(yǎng)基毒素濃度篩選

根據(jù)鐮刀菌酸標(biāo)準(zhǔn)品在紫外分光光度計(jì)上于268 nm處測定的吸光度值繪制鐮刀菌酸（FA）濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出FA濃度與其吸光度值的線性回歸方程：y=0.027 1 x+0.265 7，相關(guān)系數(shù)r=0.971 8，其中：y為吸光度；x為FA濃度，mg/L。

根據(jù)鐮刀菌酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算鐮刀菌培養(yǎng)濾液中FA的濃度，將濾液添加到百合MS培養(yǎng)基中，配制成FA濃度分別為60、80、100 mg/L的 FA-MS 培養(yǎng)基，接種宜昌百合組培苗并觀察記錄發(fā)病情況。7 d后接種的組培苗相繼發(fā)病，其中含100 mg/L FA培養(yǎng)基上組培苗發(fā)病最早，病情也最為嚴(yán)重，80 mg/L FA培養(yǎng)基的病情次之，60 mg/L FA培養(yǎng)基上百合組培苗發(fā)病最晚，15 d后才表現(xiàn)出明顯發(fā)病癥狀（表2）。

由不同濃度毒素對宜昌百合組培苗的致病性結(jié)果（表2）可見，培養(yǎng)基中毒素濃度越高，對百合的致病作用越強(qiáng)。隨著毒素處理時(shí)間的延長，百合組培苗的病情逐漸加重。

與接菌處理試驗(yàn)相比，在毒素培養(yǎng)基上接種的百合組培苗發(fā)病所需時(shí)間較短，以宜昌百合為例，接種10 d左右即表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀，而直接接菌往往需要15 d或更長時(shí)間才能表現(xiàn)出明顯的發(fā)病癥狀，說明采用尖孢鐮刀菌毒素濾液代替病原菌進(jìn)行抗性試驗(yàn)?zāi)軌蚩s短試驗(yàn)周期，可實(shí)現(xiàn)對品種抗性的快速鑒定。

試驗(yàn)表明，當(dāng)培養(yǎng)基中FA濃度為60 mg/L時(shí)，培養(yǎng)后15 d宜昌百合組培苗表現(xiàn)輕度萎蔫，葉片卷曲，鱗莖外層鱗片軟腐；當(dāng)培養(yǎng)基中FA濃度為 80 mg/L 時(shí)，組培苗表現(xiàn)中度萎蔫，基本鱗片褐色，呈輕度腐爛；當(dāng)FA濃度達(dá)100 mg/L時(shí)，組培苗葉片大部分枯萎，鱗莖重度腐爛（圖1）。

從表2、圖1可以看出，隨著培養(yǎng)基中FA濃度的升高，宜昌百合組培苗的發(fā)病程度逐漸加重。培養(yǎng)基中FA濃度達(dá)60 mg/L時(shí)，組培苗病情指數(shù)較低，10 d時(shí)病情指數(shù)僅15.3，20 d后病情指數(shù)仍在30以下，F(xiàn)A低濃度時(shí)材料發(fā)病癥狀不夠明顯，這會導(dǎo)致品種間的病情指數(shù)區(qū)分度較低。當(dāng)培養(yǎng)基中FA濃度達(dá)100 mg/L以上時(shí)，材料病癥明顯，10 d時(shí)組培苗病情指數(shù)為44.8，20 d后病情指數(shù)達(dá)75.2，材料病癥明顯，便于觀測記錄，表明培養(yǎng)基中FA濃度100 mg/L為較適宜的抗性鑒定濃度。

2.2 百合不同品種對鐮刀菌毒素的抗性

以附加尖孢鐮刀菌毒素濾液的FA-MS培養(yǎng)基（含F(xiàn)A 100 mg/L）為篩選平臺，對20種（含品種）百合組培苗進(jìn)行抗性測定。百合組培苗移植到含毒素培養(yǎng)基7 d后開始發(fā)病，主要表現(xiàn)為葉片枯黃，鱗片基部變褐腐爛。據(jù)百合莖腐病發(fā)病等級標(biāo)準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)病情指數(shù)，依據(jù)百合莖腐病病情分級標(biāo)準(zhǔn)對20個(gè)百合種（品種）進(jìn)行抗性分級（表3）。

抗性鑒定結(jié)果表明，不同百合種（品種）的抗性水平存在顯著差異。淡黃花百合等6個(gè)百合種（品種）對尖孢鐮刀菌毒素濾液表現(xiàn)高抗，而百合丹東種源、宜昌百合等品種對尖孢鐮刀菌毒素濾液表現(xiàn)高感。據(jù)病情分級標(biāo)準(zhǔn)鑒定出高抗種（品種）6個(gè)，中抗種（品種）4個(gè)，中感種（品種）6個(gè)，高感種（品種）4個(gè)。方差分析結(jié)果表明，不同百合種質(zhì)的病情指數(shù)存在顯著差異（表3）。

由表4可以看出，20種百合材料的病情指數(shù)存在顯著差異，而病情指數(shù)客觀反映了百合品種的抗病性，因而試驗(yàn)結(jié)果也說明百合不同品種的抗性存在著顯著差異，在此基礎(chǔ)上依據(jù)病情指數(shù)對20種百合材料抗病性的差異進(jìn)行多重比較（表5）。

由表5可以看出，初夏、藥百合、淡黃花百合及岷江百合的抗性較強(qiáng)，它們與雨荷、毛百合等高抗種（品種）差異極顯著。而高抗種（品種）雨荷、毛百合，中抗種南川百合、瀘定百合差異不顯著。而百合（丹東種源）、宜昌百合、細(xì)葉百合及百合等對鐮刀菌莖腐病的抗性較差，與其他材料達(dá)極顯著差異。

3 結(jié)論與討論

尖孢鐮刀菌及其產(chǎn)毒素的致病性對比試驗(yàn)表明，鐮刀菌培養(yǎng)后的毒素濾液可以代替病原菌進(jìn)行品種的抗性鑒定。將毒素濾液添加到百合組培培養(yǎng)基中制成的FA-MS培養(yǎng)基可以作為百合種質(zhì)抗性鑒定的平臺，運(yùn)用此方法可以快速篩選出對百合莖腐病有較強(qiáng)抗性的百合種質(zhì)資源。在一定濃度范圍內(nèi)，百合組培苗的病情指數(shù)與毒素濾液中鐮刀菌酸（FA）的濃度成正比，隨毒素處理時(shí)間延長而病情加重。FA-MS培養(yǎng)基中適宜的FA濃度為 100 mg/L 左右，F(xiàn)A濃度過低或過高均不利于百合抗性的鑒定。

百合對尖孢鐮刀菌的抗性與寄主植物發(fā)育階段、病原菌生理小種及環(huán)境條件等多種因素有關(guān)。百合在苗期的抗性與其在成株期的抗性是否完全一致目前尚不明確。但由于百合苗期植株抗病力相對較弱，尖孢鐮刀菌容易侵染而致病，因而植物病原菌的抗性試驗(yàn)多在苗期進(jìn)行。百合田間抗性一般不很穩(wěn)定，受環(huán)境條件影響較大。本試驗(yàn)主要研究百合屬部分種質(zhì)資源對百合專化型尖孢鐮刀菌的垂直抗性，而非水平抗性，由于百合?；顽牭毒辽侔l(fā)現(xiàn)具有3個(gè)生理小種，除百合?；图怄哏牭毒?，還有茄腐皮鐮刀菌［F. solani （Mart） Sacc］、串珠鐮刀菌（F. moniliform Sheldon）、三線鐮刀菌（F. tricinctum）［9］和 富士鐮刀菌（F. fujikuroi）［10］，它們的發(fā)生頻率遠(yuǎn)低于尖孢鐮刀菌，但它們有時(shí)和尖孢鐮刀菌復(fù)合發(fā)生。對尖孢鐮刀菌有較強(qiáng)抗性的百合品種是否也對后2種鐮刀菌有較強(qiáng)抗性還不清楚，尚有待進(jìn)一步研究。

本研究依據(jù)不同百合種（品種）百合對尖孢鐮刀菌毒素濾液的病理反應(yīng)將供試的20個(gè)百合品種分為4類，初夏、藥百合、淡黃花百合、岷江百合、雨荷、毛百合等為高抗種（品種），適合選為抗性育種親本。南川百合、瀘定百合、卷丹、川百合為中抗種質(zhì)。卷丹（宜興百合）、青島百合、野百合、渥丹、金角、布魯內(nèi)羅為中感種質(zhì)，百合（丹東種源）、宜昌百合、細(xì)葉百合及百合為高感種質(zhì)。本研究結(jié)果與李潤根等的研究［3］表明卷丹為中抗種質(zhì)相一致。

筆者所在課題組選育的新品種初夏、雨荷均比親本金角、布魯內(nèi)羅抗性增強(qiáng)，可能是由于親本為二倍體與四倍體，而子代為三倍體增強(qiáng)了抗性。

近年來，隨著基因與蛋白組學(xué)研究的進(jìn)步，百合尖孢鐮刀菌抗性基因挖掘工作相繼展開，王自娥認(rèn)為岷江百合defensin抗菌肽基因LrDef1是一個(gè)尖孢鐮刀菌抗性基因，LrWRKY3通過與LrDef1啟動子中的W-bo特異性結(jié)合并激活其轉(zhuǎn)錄，調(diào)控LrDef1的表達(dá)參與岷江百合與尖孢鐮刀菌的分子互作［11］。李珊的研究表明，岷江百合幾丁質(zhì)酶基因LrCHI2響應(yīng)植物信號分子處理和尖孢鐮刀菌侵染。原核重組蛋白LrCHI2對包括尖孢鐮刀菌在內(nèi)的幾種病原真菌具有明顯的抑制活性［12］。

在蛋白組學(xué)方面，張藝萍等以東方百合品種卡薩布蘭卡抗病無性系和感病無性系為試驗(yàn)材料，開展百合抗尖孢鐮刀菌枯萎病的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)與防御反應(yīng)的病程相關(guān)蛋白（推定的抗病蛋白RPS2、推定的抗晚疫病同族蛋白R1C-3、過氧化物酶Q、抗壞血酸過氧化物酶和NBS-LRR類似蛋白）可能是百合抗病無性系介入抗病防御反應(yīng)的關(guān)鍵蛋白［13］。

但上述研究的材料集中在岷江百合與東方百合品種上，根據(jù)本研究結(jié)果可知，高抗種質(zhì)初夏、藥百合、淡黃花百合、毛百合以及品種雨荷等均可作為高抗種質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的抗性基因挖掘。

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