馮 濤，孫嘉卿，王秀敏，夏賢水，朱 霖，姚凌云*

(1.上海應用技術大學，上海 201418；2.上海市農業(yè)技術推廣服務中心，上海 201103；3.上海大蓮湖果業(yè)專業(yè)合作社，上海 201799)

柚子花，花期早而且比較短，一般集中在每年的3月下旬至4月下旬開放，多為花苞。原產于東南亞，在我國已有3 000多年的栽培歷史，浙江、廣西、廣東、福建等均有栽種[1]。柚子花的花香清爽、甜美、馥郁，在我國產量巨大，是理想的香花資源[2]。柚子花作為一種常見的窨制輔料，在一些花茶的制作中有很好的應用[3]。

早期，日本的栽培技術針對水分脅迫和柚子花開花的關系有所研究[4]。近年來，福建琯溪蜜柚受到廣泛關注，張利軍等[5]研究了福建琯溪蜜柚的落花落果與營養(yǎng)物質之間的關系。葉鵬等[6]采用液液萃取和水蒸氣蒸餾法對琯溪蜜柚的柚子花風味物質進行了分析，共鑒定出19種風味物質。Vivian Goh等[7]對我國和東南亞各國產的柚子不同部位進行風味分析對比，對柚子花采用脂吸法和油萃取的方法進行前處理，再分別采用頂空固相微萃取和溶劑輔助風味蒸發(fā)的方法進行分析，發(fā)現(xiàn)油萃取的前處理方法相對更好。不同產地柚子花中均已經被鑒定出的主要風味物質有檸檬烯、β-羅勒烯、芳樟醇、香葉醇等[8]。而針對我國華東產區(qū)的柚子花以及不同樹齡對柚子花風味的影響的研究鮮見報道。

揮發(fā)性香氣物質對于鮮花品質是一項重要的指標。不同種類、產地、收獲季節(jié)、前處理方式等都會影響到其風味物質[9]。水蒸氣蒸餾法得到的鮮花精油是最常用的鮮花香氣物質的分析方法[10]。但對于一些沸點較低的易揮發(fā)性風味物質提取率相對較低。頂空固相微萃取技術(headspace solid phase microextraction，HS-SPME)集采樣、萃取、濃縮和進樣于一體，操作簡單且高效，富集效果較好[11]。氣相色譜-質譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)被廣泛應用于食品揮發(fā)性成分分析的檢測，具有所需樣品少、分析速度快、靈敏度高等特性，并可以檢測出特定的風味化合物[12]。雙柱定性法旨在對樣品中的極性以及非極性的揮發(fā)性風味物質進行全面的分析捕捉和驗證。香氣活力值(odor activity value，OAV)是揮發(fā)性物質濃度與其對應介質中氣味閾值的比值，其值越大，說明該物質對呈香越重要，是關鍵呈香成分分析的重要手段，此方法可通過理論值的計算來表征揮發(fā)性物質香氣的貢獻度[13]。該研究采用頂空固相微萃取技術與氣相質譜聯(lián)用的方法對2種樹齡的柚子花揮發(fā)性風味物質進行富集分析鑒定，采用雙柱法進行準確定性，采用內標法進行相對定量，能夠較為全面地對2種柚子花的風味物質進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑供試樣品為上海青浦4月大樹(10年樹齡)和小樹(5年樹齡)現(xiàn)場采摘的柚子花，采摘后迅速密封包裝，放入冷凍(-20 ℃)保藏運輸于實驗室，用于揮發(fā)性成分檢測；1，2-鄰二氯苯(100 mg/L)購于Sigma Aldrich(美國密蘇里州圣路易斯)公司。

1.2 儀器與設備7890B-5977B 型 GC-MS 聯(lián)用儀，安捷倫科技(中國)有限公司；色譜柱 HP-Innowax(60 m×0.25 mm×0.25 μm)和色譜柱DB-5(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，安捷倫科技(中國)有限公司；嗅聞儀(ODP 2)，德國 Gerstel公司。

1.3 試驗方法

1.3.1柚子花中香氣物質的萃取。準確稱取5.0 g新鮮解凍后的柚子花，置于20 mL帶有聚四氟乙烯瓶蓋的頂空小瓶中，加入10 μL內標溶液(100 mg/L，1，2-鄰二氯苯)，將頂空小瓶置于60 ℃的水浴中平衡20 min。使用50/30 μm DVB-CAR-PDMS萃取纖維頭，萃取時間為30 min。在使用之前，萃取纖維頭需在氣相色譜儀上預處理老化30 min，進樣口溫度為250 ℃，使得萃取纖維頭上無殘留其他氣味雜質。

1.3.2氣相色譜-質譜聯(lián)用(GC-MS)條件。采用安捷倫7890A氣相色譜儀和5975C質譜檢測器聯(lián)用。色譜柱采用HP-Innowax和DB-5分析熔融石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)。氣相色譜條件：進樣模式為不分流模式，進樣品解吸時間為3 min，進樣口解吸溫度為250 ℃；載氣為高純氦氣(純度>99.999%)，恒流量為1 mL/min，溶劑延遲3 min；升溫程序為50 ℃保持3 min，以5 ℃/min升至120 ℃保持 5 min，再以8 ℃/min升至200 ℃保持5 min，最后以3 ℃/min升至230 ℃保持3 min。質譜條件：電子電離能為70 ev；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃，全掃描模式，質量掃描范圍為30～450m/z。

1.3.3氣相色譜-嗅聞儀(GC-O)條件及評價方法。采用安捷倫7890A氣相色譜儀配置嗅聞儀，在嗅聞口對樣品進行嗅聞記錄。氣相色譜條件同“1.3.2”，載氣恒流量為 2 mL/min，氣相色譜流出物以1∶1的比例分別流向質譜儀和嗅聞口。嗅聞試驗由10名訓練有素的專業(yè)成員(6名女性和4名男性)進行。每次嗅聞時間為50 min，并記錄嗅聞到的香氣物質的香氣特征、香氣強度和香氣頻率。強度計算為所有小組成員記錄的平均得分。氣味強度按0～10分線性強度等級評定，0表示化合物無氣味，5表示中等強度，10表示極強氣味。

1.3.4感官評價。根據ISO 8589—2007的指導原則和條件，在感官實驗室進行感官評價。感官分析的方法采用一般描述性分析。第一步，在50 mL感官杯中制備5 g柚子花樣品，由10名成員(4名男性和6名女性)組成的訓練有素的感官評價小組對柚子花的香氣進行嗅聞和討論。第二步，通過嗅聞和討論達成的初步共識(每次2 h)，小組成員就柚子花的香氣描述詞達成一致(甜香、果香、花香、脂肪香、青香、木香)。每個感官描述詞通過對以下參考化合物的嗅聞被準確定義：石竹烯表示“甜香”的香氣，右旋萜二烯表示“果香”的香氣，芳樟醇表示“花香”的香氣，己醛表示“脂肪香”的香氣，正己醇代表“青香”的香氣，β-蒎烯代表“木香”的香氣。從0(感知不到)到3.0、4.0、5.0(香氣適中)，再到10.0(可非常強烈感知)的0～10線性標度對應香氣嗅聞強度。每個樣品的感官評定試驗重復3次，求平均值。

1.3.5柚子花揮發(fā)性風味物質定性。 通過在NIST數據庫中匹配真實標準物的保留時間、保留指數(RI)和質譜來鑒定化合物。未知化合物的RI由C7～C30正構烷烴測定，計算公式如下[14]：

式中，tx代表揮發(fā)性風味物質的保留時間；tz代表與風味物質具有相同碳原子數的烷烴的保留時間；Z表示該風味化合物的碳原子數。

1.3.6柚子花揮發(fā)性風味物質定量。以10 μL的100 mg/L的鄰二氯苯為內標計算揮發(fā)性物質的含量。計算公式如下[14]：

C=C0×V0×Ax/M×A0

式中，C0為內標物濃度(mol/L)；V0為內標物體積(μL)；Ax為揮發(fā)性物質峰面積；M為樣品質量(g)。

1.3.7柚子花香氣活力值(OAV)的計算。利用嗅覺活性值的公式計算柚子花香氣活力值(OAV)，即OAV=C/T，其中C代表化合物的濃度；T代表該化合物在空氣中的嗅覺閾值，嗅覺閾值來自文獻參考[14]。OAV>1表明該化合物對香氣有直接影響。一般認為，OAV值越高的揮發(fā)性化合物對柚子花香氣的貢獻越大。

1.4 數據處理揮發(fā)性成分種類圖和風味雷達圖采用Excel 2020制作。采用SPSS 22軟件對檢測的數據計算平均值與相對標準差。

2 結果與分析

2.1 柚子花揮發(fā)性成分組分分析大樹與小樹柚子花的揮發(fā)性成分的總離子流圖見圖1，兩者出峰總體趨勢較為一致，且分離效果較好。

圖1 大樹(a)和小樹(b)柚子花的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of pomelo flowers of big tree(a)and small tree(b)

采用雙柱定性法和相對內標法對揮發(fā)性風味物質進行定性定量分析，結果如表1所示。從表1可以看出，共鑒定出44種風味物質，其中大樹37種，小樹29種，大樹和小樹共同鑒定出的風味物質22種。在2種柚子花鑒定到的風味物質共可分為8個化合物種類(醛類、酯類、烯烴類、醇類、酮類、酚類、酸類、其他)。

表1 2種不同樹齡的柚子花的揮發(fā)性風味物質Table 1 Volatile flavor compounds in two pomelo flowers of different ages

醛類中，己醛、香茅醛、苯甲醛等提供青香和果香的風味物質含量較高，乙醛僅在小樹柚子花中被檢測到，更富有果香的檸檬醛在大樹柚子中被檢測到，且相對含量較高。對于酯類物質，大樹柚子中的酯類物質含量和種類數都相對較高，主要體現(xiàn)在乙酸香葉酯、丁酸乙酯、苯甲酸甲酯和乙酸橙花酯，這幾種揮發(fā)性風味物質的主要香氣特征是略帶花香的果香，即花果香。對于烯烴類的化合物，大樹和小樹的風味物質種類是相同的，其中，蒎烯和月桂烯閾值相對較低，且在大樹柚子花中相對含量較高，會對大樹柚子柑橘類的果香屬性貢獻較大。綜上3個種類的風味物質看來，大樹柚子的風味特征相對小樹柚子來說，其果香和花香的特征香氣更突出一些。對于總體占比含量較高的醇類物質來說，大樹柚子的相對含量也高于小樹柚子，如葉醇、芳樟醇、香茅醇、橙花醇、苯乙醇等。對于酮類物質，小樹柚子的酮類物質的種類數和相對含量略高于大樹柚子，而酮類物質在香氣特征上主要是提供甜香。對于酸類物質，大樹柚子和小樹柚子的種類和相對含量較為相近，故在該香氣分路上差異不大。大樹柚子在其他類的揮發(fā)性風味物質種類數上有一定的優(yōu)勢。綜上所述，大樹柚子風味中，提供花香、果香、青香的揮發(fā)性風味物質在種類和相對含量上有一定的優(yōu)勢，小樹柚子中提供甜香的酮類物質種類和相對含量的優(yōu)勢較高；大樹柚子的風味更為豐富多元些。

有研究表明，在植物種植期，前3年個體開花量較少，隨著樹齡的增長，花的產量呈冪函數關系，且在11年左右達到穩(wěn)定[15]；其營養(yǎng)物質與香氣活性物質的積累也隨樹齡的增長而不斷累積，使其香氣豐富度有所增強。在這生長過程中，吲哚乙酸、脫落酸、玉米素赤霉素等內源激素含量的變化起著重要的作用[16]。在開花后，不僅果實的產量會隨著樹齡而增長[17]，果實的質量也會受到樹齡的影響，在果酒釀造過程中，由于單株樹木單寧含量的自然變化程度是不同的，所以其對最終風味有較大的影響[18]。綜上，大樹柚子風味較為豐富多元，被認為是10年樹齡的柚子樹在可溶性固形物含量、固酸比和VC含量累積的結果[19]。小樹柚子花由于樹齡較小，故風味相對單一。可能是由于小樹柚子生長期間，除了產生脂肪族、 支鏈或芳香族的醇類、醛類、羰基化合物、酸類和酯類的氨基酸代謝途徑，其脂氧合酶在脂肪酸代謝途徑中也較為旺盛[20]。

續(xù)表1

2.2 柚子花揮發(fā)性成分種類分析大樹及小樹柚子花揮發(fā)性成分種類的占比見圖2，共分為8類，這8類共同構成了柚子花的香氣特征，其中烯烴類和醇類含量較高，約占總體風味成分的95%以上，其余的酯類、酮類、醛類、酸類、酚類等所占比例相對較少。

圖2 2種柚子花揮發(fā)性化合物種類及占總體化合物的百分比Fig.2 Types of volatile compounds from two pemelo flowers and their in the total compounds

2.3 2種柚子花GC-O嗅聞試驗用頂空固相微萃取(HS-SPME)對2種柚子花的香氣物質進行了萃取吸附，并用氣相色譜-嗅聞(GC-O)進行了嗅聞描述，結果見表2，從大樹和小樹柚子花中分別嗅聞鑒定出37和28種氣味活性物質。通過計算的保留指數(RIs)、香氣描述和質譜鑒定3種方式對2個樣品中的香氣物質進行鑒定。揮發(fā)性風味物質的香氣強度(AIs)大樹柚子花為1.2～9.6，小樹柚子花為1.1～9.4。

表2 GC-O嗅聞結果Table 2 GC-O smell results

續(xù)表2

2.4 2種柚子花感官評價由不同樹齡柚子花感官評分得分(表3)得到2種柚子花的風味感官輪廓圖(圖3)。感官評價結果表明，大樹柚子花的花香和果香更為突出，青香也比小樹柚子花得分高，而小樹柚子花則在甜香的香韻結果評分較高。

表3 不同樹齡柚子花感官評價得分Table 3 Sensory evaluation scores of pomelo flowers at different ages

圖3 不同樹齡柚子花感官評價雷達圖Fig.3 Radar chart for sensory evaluation of pomelo flowers at different tree ages

2.5 柚子花揮發(fā)性物質的OAV分析揮發(fā)性風味物質對柚子花風味的貢獻主要受到不同風味物質閾值的影響。閾值作為香氣化合物能夠被嗅聞到的最低濃度，化合物濃度與其比值得到的OAV值成為表明香氣貢獻程度的主要指標。該研究選取OAV值大于1的物質(被認為香氣貢獻值較大)，共10種，其中醇類3種、烯烴類6種、醛類1種，主要為芳樟醇、月桂烯、右旋萜二烯、蒎烯、β-羅勒烯、香葉醇、石竹烯、己醛、β-蒎烯、正己醇，見表4。除石竹烯和右旋萜二烯外，其他8種OAV值大于1的物質均在大樹柚子花中OAV值更高，香氣活力值更大。右旋萜二烯主要在柚子花中貢獻出柑橘屬性的果香以及花香，而石竹烯在濃度較低的情況下其主要風味特征為帶有香蕉樣的甜香。這與人工感官評價結果一致。

表4 柚子花中OAV值大于1的揮發(fā)性風味物質Table 4 Volatile flavor compounds with OAV value greater than 1 in pomelo flowers

3 結論

采用HS-SPME-GC-MS的方法從上海青浦4月的大樹和小樹柚子花中共鑒定到44種風味物質，其中大樹37種，小樹29種，大樹和小樹共同鑒定出的風味物質22種，香氣貢獻值較大的風味物質10種，均為大樹和小樹共有的。綜合分析香氣貢獻值較大物質的OAV值以及各揮發(fā)性風味物質的相對含量發(fā)現(xiàn)，大樹和小樹的香氣特征總體差異不大，相對而言，大樹柚子花的風味特征更偏向花香和果香多一些，且香氣特征更為多元豐富，小樹柚子花的香氣特征總體比大樹柚子花甜香多一些。該研究初步明確了一種上海青浦4月大樹柚子花和小樹柚子花的揮發(fā)性香氣成分與關鍵呈香物質，后續(xù)將進一步使用分子感官科學和代謝組學相結合解析柚子花的特征風味物質及其香氣前體物質，也將為柚子花風味的開發(fā)提供一定的理論指導。