祁紅學,吳麗華,李利紅*

基于轉錄組分析外源H2S對擬南芥芥子油苷生物合成的影響

祁紅學1,吳麗華2,李利紅1*

(1.晉中學院化學化工系,山西 榆次 030619；2.太原師范學院生物系,山西 榆次 030619)

外源硫化氫(H2S)噴施擬南芥幼苗后,利用高通量測序技術對植株地上組織進行轉錄組測序,分析差異表達基因的生物學功能和代謝通路,探究H2S對芥子油苷生物合成的調(diào)控作用.結果表明,100μmol/L H2S處理3d后,擬南芥植株共有3160個基因差異表達,涉及細胞代謝、結合、催化、轉錄調(diào)控、物質(zhì)轉運、信號轉導等過程.通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),差異表達基因在多個初生代謝和次生代謝通路顯著富集,其中芥子油苷生物合成途徑中9個基因差異表達(8個上調(diào)和1個下調(diào)),均為參與脂肪族芥子油苷合成的關鍵酶基因,而吲哚族芥子油苷合成相關基因表達無明顯改變.同時,硫代謝、半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、谷胱甘肽代謝途徑中多個基因上調(diào)表達,說明外源H2S可增強體內(nèi)硫相關代謝活動,進而促進植物體內(nèi)脂肪族芥子油苷的合成.轉錄因子差異表達分析顯示,正向調(diào)控脂肪族芥子油苷合成的基因表達上調(diào),而抑制其合成的基因表達水平降低,說明H2S可通過調(diào)控MYB轉錄因子的表達來調(diào)節(jié)植物體內(nèi)脂肪族芥子油苷的合成.對芥子油苷生物合成途徑中部分關鍵酶基因及相關MYB轉錄因子表達模式進行實時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析,發(fā)現(xiàn)其與測序結果一致,證實了轉錄組測序結果的可靠性,同時也進一步證明了H2S對植物體內(nèi)芥子油苷生物合成的調(diào)控作用.

H2S；擬南芥；轉錄組；芥子油苷；差異基因

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種氣體信號分子,不僅參與調(diào)控植物生長發(fā)育[1-2],還在植物抵抗逆境脅迫過程中發(fā)揮重要作用[3].Müller等[4]研究表明,H2S熏蒸有效增加擬南芥植株體內(nèi)谷胱甘肽(GSH)和半胱氨酸(Cys)含量,說明外源H2S促進植物體內(nèi)的硫代謝過程,從而影響細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài).Chen等[5]發(fā)現(xiàn)外源H2S參與調(diào)控菠菜體內(nèi)可溶性糖、多胺、脯氨酸和甜菜堿的生物合成,增加葉片滲透勢和相對含水量,提高菠菜幼苗的耐旱性. Shi等[6]研究發(fā)現(xiàn),低濃度H2S誘導擬南芥體內(nèi)氨基酸、有機酸、糖及一些次級代謝產(chǎn)物含量增加,病程相關基因表達水平提高,植株抵抗生物脅迫的能力增強.可見,H2S參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多個生理代謝過程,從而提高植物對環(huán)境的適應性.

芥子油苷是十字花科植物中一類重要的含氮、含硫的植物次生代謝物質(zhì),通常由β-D葡萄糖連接磺酸鹽醛肟基團和來源于氨基酸的側鏈組成[7-8].根據(jù)側鏈氨基酸來源的不同,芥子油苷通常分為脂肪族、芳香族和吲哚族三大類.擬南芥中的芥子油苷以脂肪族和吲哚族為主[9].芥子油苷及其降解產(chǎn)物具有多種不同的生物活性,參與植物的防衛(wèi)反應,還具有抗癌和抗氧化活性等[10-11].已有研究表明,施加硫肥誘導油菜營養(yǎng)器官和花中芥子油苷含量均顯著升高,而持續(xù)缺硫?qū)е聰M南芥幼苗芥子油苷含量明顯下降,說明環(huán)境中硫含量直接影響芥子油苷的合成[12-13].此外,當溫度、光照、水分等環(huán)境因子發(fā)生改變,或者植物受到昆蟲取食、病原菌侵害、機械損傷、鹽脅迫等時,植物會通過調(diào)節(jié)體內(nèi)芥子油苷的合成來增強其抗逆性,但是有關這些生物和非生物因素對芥子油苷代謝的調(diào)控機制并不清楚[14-15]. H2S是植物體內(nèi)重要的信號分子,也是硫代謝途徑中非常重要的中間產(chǎn)物,環(huán)境中的H2S可能會影響植物體內(nèi)的硫代謝過程,并參與調(diào)節(jié)芥子油苷的合成,進而在植物逆境脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用.

H2S參與調(diào)控植物生理活動是涉及許多基因的復雜過程,利用高通量轉錄組測序能夠全面、快速地分析H2S對植物的影響及其分子機理,還能進一步挖掘H2S在植物體中的生理功能.本研究以擬南芥為試材,外源噴施H2S后,采用高通量測序技術對其地上組織進行轉錄組測序分析,研究植物響應H2S的相關代謝途徑,闡明H2S對植物芥子油苷合成的調(diào)控機理,從而為植物抗逆生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 植株培養(yǎng)

擬南芥(L.)Columbia生態(tài)型(Col-0).4℃春化2d后播種于營養(yǎng)土中,培養(yǎng)溫度(22±1)℃,光/暗周期為16h/8h,光照強度140μmol/ m2/s,相對濕度約70%.

1.2 H2S處理

試驗以NaHS作為外源H2S供體.取4周齡擬南芥植株,根據(jù)文獻資料及前期預實驗的結果[5],我們選用50, 100, 200μmol/L H2S噴施擬南芥葉片.每隔3h噴1次,每天8:00～20:00共噴施4次.設置噴施等量蒸餾水的擬南芥植株為對照.每處理3次重復,每重復20株擬南芥.在H2S噴施3d后,分別取各處理組擬南芥植株地上部分用于生理指標、轉錄組測序和qRT-PCR分析.

1.3 生理指標檢測

過氧化氫(H2O2)含量測定采用分光光度法,丙二醛(MDA)含量測定用硫代巴比妥酸(TBA)反應法,過氧化氫酶(CAT)活性測定用紫外吸收法,谷胱甘肽硫轉移酶(GST)活性采用1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)比色法,谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)活性測定采用5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB)直接法.

1.4 轉錄組測序

100μmol/L H2S處理3d后,取對照組和H2S處理組擬南芥植株地上組織,用Trizol法提取總RNA,利用磁珠富集mRNA,經(jīng)RT-PCR擴增構建cNDA文庫.庫檢合格后,用Illumina平臺進行測序. RNA提取、建庫和轉錄組測序均委托北京百邁克生物科技有限公司完成.

計算H2S處理組與對照組信號比值(Fold Change, FC),并用log2FC>1為標準篩選差異表達基因.運用ClusterProfiler軟件對差異表達基因進行GO功能注釋分析,根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫對差異表達基因進行KEGG通路富集分析.

1.5 qRT-PCR檢測

表1 qRT-PCR引物序列

利用轉錄組測序提取的總RNA,PrimeScriptTMRT Master Mix (Takara) 試劑盒合成 cDNA作為模板,使用ABI 7500Real-Time PCR System對目的基因進行擴增,反應體系參照SYBR Premix Ex TaqTMII(Takara)試劑盒的方法,反應程序:94℃,30s;94℃, 5s,60℃,30s,40個循環(huán).以作為內(nèi)參基因,用2-??CT方法計算相對表達量.引物序列使用見表1.

2 結果與分析

2.1 外源H2S處理后擬南芥植株抗氧化能力分析

由圖1可見,50μmol/L H2S處理后,擬南芥植株H2O2和MDA含量無明顯改變,抗氧化酶CAT活性和抗氧化物GSH含量增加,而GST和GPX活性與對照組相比無顯著變化.100μmol/L H2S處理誘導擬南芥植株H2O2含量增加,同時CAT活性顯著升高,GSH含量及GST和GPX活性提高,MDA含量與對照組相比顯著降低. 200 μmol/L H2S處理后,擬南芥植株體內(nèi)H2O2含量、CAT和GST活性無明顯變化,GSH含量和GPX活性、MDA含量顯著增加.

H2S參與調(diào)節(jié)植物的生長、發(fā)育、成熟和衰老過程,還可從不同水平增強植物應答各種非生物脅迫和生物脅迫的能力[16-17].本研究中,H2S處理后擬南芥植株抗氧化酶CAT活性升高,GSH含量、GST和GPX活性提高,有效清除活性氧H2O2,說明適宜濃度H2S可提高植株抗氧化能力,尤其是提高含硫抗氧化物及其相關防御酶水平,增強植物對環(huán)境脅迫的耐受性.

結果表明,100μmol/L H2S處理引發(fā)細胞的生理防御.因此,我們選用該處理進行轉錄組測序分析,研究H2S對植物的影響及其分子機理.

圖1 H2S處理對擬南芥植株中抗氧化能力的影響

2.2 外源H2S處理后擬南芥差異表達基因及GO功能注釋分析

100μmol/L H2S處理3d后,在擬南芥地上組織中共發(fā)現(xiàn)差異表達基因(DEG)3160個,其中上調(diào)表達基因1500個,下調(diào)表達基因1660個.對差異表達基因進行GO功能注釋,將這些基因分為36類,歸納為細胞組分(Cellular Component)、生物過程(Biological Process)與分子功能(Molecular Function)三大部分(圖2).在細胞組分中,細胞、細胞成分、細胞器、膜組分富集差異基因較多;在生物過程中,細胞進程、代謝過程、應激反應、生物調(diào)節(jié)過程富集差異基因較多;在分子功能中,結合、催化、轉錄、轉運功能組富集差異基因較多.由此可見,H2S處理誘導擬南芥多個基因差異表達,涉及細胞代謝、結合、催化、轉錄調(diào)控、物質(zhì)轉運、信號轉導等過程.

圖2 H2S處理后擬南芥差異表達基因GO功能注釋

2.3 外源H2S處理后擬南芥差異表達基因的KEGG通路富集分析

對H2S誘導的差異表達基因進行KEGG通路注釋,發(fā)現(xiàn)共有1134個差異基因注釋到123個通路,分布在細胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝和有機系統(tǒng)5大生物過程中.

通過KEGG富集分析發(fā)現(xiàn),在差異表達基因顯著富集的前20個通路中(圖3),有18個為代謝通路,包括谷胱甘肽代謝、2-氧代羧酸代謝、氨基酸代謝(半胱氨酸和甲硫氨酸代謝、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、氨基酸的生物合成、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸生物合成)、脂質(zhì)代謝(甘油磷脂代謝、脂肪酸代謝、α-亞麻酸代謝、類固醇生物合成、不飽和脂肪酸的生物合成、亞油酸代謝)、糖類代謝(淀粉和蔗糖代謝、糖酵解/糖異生、半乳糖代謝)、次級代謝產(chǎn)物合成(芥子油苷生物合成和異喹啉生物堿生物合成),說明H2S參與調(diào)控植物的多個初生代謝和次生代謝過程.

圖3 H2S處理后擬南芥差異表達基因KEGG富集通路

外源H2S處理后,擬南芥轉錄組差異表達基因顯著富集于氨基酸、糖類和脂質(zhì)代謝途徑的多個通路中.氨基酸可用于蛋白質(zhì)合成,還能作為一些次生代謝產(chǎn)物合成的前體,促進細胞內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物的積累[18].糖類不僅可為植物的生長發(fā)育提供能量,還可作為信號分子參與調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達、細胞周期、初生和次生代謝及生長和發(fā)育進程等[19-20].脂質(zhì)作為主要的生物分子,在植物中發(fā)揮著結構成分、能量存儲、信號分子和表面覆蓋物等重要作用[21].因此,H2S信號分子參與植物體內(nèi)氨基酸、糖類和脂質(zhì)的代謝調(diào)控,進而影響植物的生長發(fā)育及逆境脅迫應答過程.

2.4 外源H2S處理后擬南芥芥子油苷生物合成及相關代謝通路分析

2.4.1 芥子油苷生物合成途徑基因表達分析 芥子油苷是一種廣泛存在于十字花科植物中的次生代謝產(chǎn)物. H2S處理后,擬南芥植株芥子油苷生物合成途徑中共9個基因顯著差異表達,上調(diào)表達基因8個,下調(diào)表達基因1個.與氨基酸側鏈延長有關的氨基酸氨基轉移酶(branched-chain-amino-acid aminotransferase,和)、異丙基蘋果酸脫氫酶(isopropylmalate dehydrogenase,)、異丙基蘋果酸脫氫酶異構酶(isopropylmalate isomerase,和)基因上調(diào)表達,下調(diào)表達.參與芥子油苷核心結構形成的細胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450,和)、磺基轉移酶(sulfotransferase 17,)基因表達上調(diào).

進一步研究發(fā)現(xiàn),、、、、/和均為參與脂肪族芥子油苷合成途徑的關鍵基因,而吲哚族芥子油苷合成途徑基因無明顯改變,說明響應外源H2S的主要是脂肪族芥子油苷.Kim等[22]報道增加硫水平能明顯增加油菜中脂肪族芥子油苷含量. Chen等[23]發(fā)現(xiàn)白菜中脂肪族芥子油苷的含量受供硫水平的影響很大,而吲哚族芥子油苷的含量主要受到供氮水平的影響.這可能是因為吲哚族芥子油苷是由色氨酸衍生而來,而脂肪族芥子油苷側鏈來源于甲硫氨酸,受環(huán)境中供硫水平的影響更明顯[24-25].

2.4.2 硫代謝和谷胱甘肽代謝途徑基因表達分析 H2S處理后,擬南芥植株硫代謝途徑中共有9個基因顯著差異表達,上調(diào)表達基因8個,下調(diào)表達基因1個.上調(diào)表達基因分別為腺苷酰硫酸還原酶1/2/3 ()、腺苷酰硫酸激酶1/2/3()、絲氨酸乙酰轉移酶4()和半胱氨酸合酶(),下調(diào)表達基因為O-乙酰絲氨酸(硫醇)裂解酶().

在谷胱甘肽代謝途徑中,共有顯著差異表達基因22個,上調(diào)表達基因16個,下調(diào)表達基因6個.其中,多個谷胱甘肽硫轉移酶(glutathione S-transferase,和)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,和)和脫氫抗壞血酸還原酶(dehydroascorbate reductase,和)基因表達水平顯著提高.

外源H2S處理后,擬南芥硫代謝途徑、谷胱甘肽代謝途徑中多個基因上調(diào)表達,說明環(huán)境中的H2S可促進體內(nèi)硫還原產(chǎn)物半胱氨酸的合成,進而生成抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽,同時其相關防御酶GST和GPX基因表達水平和活性提高,在植物逆境脅迫應答過程中發(fā)揮重要作用[26-27].同時,外源H2S增強植物體內(nèi)硫相關代謝過程,為脂肪族芥子油苷合成提供硫供體,從而促進脂肪族芥子油苷的合成代謝,介導植物對外界環(huán)境刺激的防御性反應.

2.5 外源H2S處理后擬南芥轉錄因子表達分析

轉錄因子通過激活或抑制基因的表達,在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成及對外界環(huán)境的反應中起著重要的調(diào)控作用[28-29]. H2S處理后,擬南芥植株共有307個轉錄因子差異表達,其中上調(diào)表達131個,下調(diào)表達176個.其中,AP2/ERF差異表達共41個,占到13.36%;WRKY共22個,占到7.17%;MYB共20個,占到6.51%,bZIP共17個,占到5.54%;DREB和C2H2均為7個,分別占到2.28%;bHLH為5個,占到1.63%;TCP和HSF均為4個,分別占到1.30%;NAC為3個,所占比例為0.98%(表2).

表2 H2S處理后擬南芥差異表達的部分轉錄因子

研究表明,植物MYB轉錄因子如MYB28、MYB29、MYB76、MYB34和MYB51參與芥子油苷代謝網(wǎng)絡的調(diào)控[30-31].本研究中,H2S處理后,正向調(diào)控脂肪族芥子油苷合成的表達顯著上調(diào),而抑制脂肪族芥子油苷合成的表達水平降低,說明H2S可通過調(diào)控MYB轉錄因子表達促進植物體內(nèi)脂肪族芥子油苷的合成.

2.6 差異表達基因的qRT-PCR分析

為了證實測序結果的可靠性,對芥子油苷生物合成途徑中的關鍵差異表達基因及相關轉錄因子進行qRT-PCR分析.結果表明(圖4),H2S處理后,、、和基因表達量分別為對照的3.26倍、2.21倍、3.71倍和1.97倍,基因表達量為對照的68.28%,與測序的結果一致,說明由測序篩選出的差異表達基因的信息是可靠的,同時也進一步證明了H2S可通過調(diào)控擬南芥芥子油苷生物合成途徑關鍵酶基因和相關的轉錄因子,參與調(diào)節(jié)體內(nèi)芥子油苷的合成代謝.本研究將為深入挖掘H2S對植物次生代謝的調(diào)控機制提供理論參考,同時也提示可以利用外源H2S提高植物體內(nèi)次級代謝產(chǎn)物的含量,從而增強植物抵御生物和非生物脅迫的能力.

圖4 H2S處理后擬南芥差異表達基因的qRT-PCR分析

3 結論

3.1 本文利用轉錄組測序技術,研究發(fā)現(xiàn)外源H2S誘導擬南芥3160個基因差異表達,參與調(diào)節(jié)植物體內(nèi)多個初生代謝和次生代謝過程,為深入探索H2S在植物中的生理功能提供大量分子水平的數(shù)據(jù)參考.

3.2 H2S通過提高擬南芥芥子油苷生物合成途徑關鍵酶和相關轉錄因子的基因表達水平,同時增強硫相關代謝活動,促進體內(nèi)脂肪族芥子油苷的合成,從而抵御不良環(huán)境對植物的侵害.

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Effect of H2S on glucosinolate biosynthesis inbased on transcriptomics.

QI Hong-xue1, WU Li-hua2, LI Li-hong1*

(1.Department of Chemistry and Chemical Engineering, Jinzhong University, Yuci 030619, China；2.Department of Biology, Taiyuan Normal University, Yuci 030619, China)., 2023,43(2)：957～963

Glucosinolates are a group of nitrogen- and sulfur-containing secondary metabolites in cruciferous plants, which are closely related to environmental factors. In this study, transcriptome sequencing oftreated with hydrogen sulfide (H2S) was performed, and the biological functions and metabolic pathways of differentially expressed genes were analyzed to explore the regulatory effect of H2S on glucosinolate biosynthesis in plants. The results showed that a total of 3160 genes were differentially expressed inseedlingssprayed with 100μmol/L H2S for 3 days, including genes involved in metabolism, binding, catalysis, transcription regulation, transport and signal transduction. KEGG enrichment analysis showed that differentially expressed genes were significantly enriched in multiple primary and secondary metabolism. After exogenous H2S treatment, nine genes (8up-regulated and 1down-regulated) involved in aliphatic glucosinolates biosynthesis were identified to be differentially expressed, but genes associated with indole glucosinolates biosynthesis showed no obvious change. Meantime, several genes that participated in sulfur metabolism, cysteine and methionine metabolism, and glutathione metabolism were up-regulated, suggesting that exogenous H2S can enhance sulfur-related metabolic pathways, which would promote the aliphatic glucosinolates biosynthesis in plants. Transcription factor analysis showed thatwas up-regulated, which could positively regulate the aliphatic glucosinolates biosynthesis. And, which would inhibit the aliphatic glucosinolates biosynthesis, was down-regulated. These results suggested that H2S could regulate the aliphatic glucosinolates biosynthesis in plants through MYB transcription factors. The qRT-PCR analysis of several genes involved in the glucosinolate biosynthesis verified the accuracy of transcriptomic sequencing, which further proved that H2S participated in the regulation of glucosinolate biosynthesis in plants.

hydrogen sulfide；；transcriptome；glucosinolate；differentially expressed gene

X171.5

A

1000-6923(2023)02-0957-07

祁紅學(1981-),男,甘肅通渭人,副教授,博士,主要研究方向為生態(tài)毒理學.發(fā)表論文10余篇.

2022-07-12

國家自然科學基金資助項目(21307087);山西省應用基礎研究計劃項目(201901D111299,201901D111301)

* 責任作者,副教授,lihongli19821129@163.com