戴智強(qiáng)，高青青，賈麗娟，國(guó)大亮，商學(xué)良，劉玉璇

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，天津 301617；2.華北理工大學(xué)心理與精神衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063210）

銀杏（Ginkgo biloba L.）為銀杏科、銀杏屬多年生落葉喬木，是植物界中名副其實(shí)的“活化石”，其葉、種子、花粉、樹(shù)根等都有不同藥用價(jià)值[1]。銀杏葉為銀杏樹(shù)的干燥葉片，主要含有黃酮類(lèi)、萜內(nèi)酯類(lèi)、酚酸類(lèi)、聚戊烯醇類(lèi)、甾體類(lèi)、多糖類(lèi)等多種化學(xué)成分[2]。現(xiàn)代研究表明，銀杏葉多糖具有抗炎[3]、抗腫瘤[4]、抗肝纖維化[5]、增強(qiáng)免疫力[6]、降血糖[7]等藥理作用，并具有治療抑郁癥的潛在活性[8]，具有較高應(yīng)用價(jià)值。目前，銀杏葉多糖的提取方法有熱水浸提法[9-10]和超聲輔助法[11-12]。熱水浸提法操作簡(jiǎn)單，但需要高溫，提取時(shí)間較長(zhǎng)；超聲輔助法要求復(fù)雜，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。本研究使用纖維素酶輔助提取銀杏葉中多糖，與熱水浸提法和閃式提取法進(jìn)行比較，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝條件，同時(shí)對(duì)銀杏葉多糖的抗氧化活性、清除亞硝酸鹽活性和免疫活性進(jìn)行研究，旨在為銀杏葉多糖的綜合利用與開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 材料與試劑 銀杏葉由河北大中藥業(yè)有限公司提供，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院劉玉璇教授鑒定為銀杏葉。纖維素酶（酶活力：315 000 U/g）購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；1,1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH）（批號(hào)：C11482940）購(gòu)自上海麥克林生科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸（批號(hào)：421L032）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；維生素C溶液購(gòu)自天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；所有試劑為分析純；無(wú)水葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)：1122A0220，含量：98%）、環(huán)磷酰胺（批號(hào)：6055-19-2）、免疫球蛋白G（IgG）試劑盒（批號(hào)：20220217）、免疫球蛋白A（IgA）試劑盒（批號(hào)：20220219）、免疫球蛋白M（IgM）試劑盒（批號(hào)：20220217）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器 HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州朗越儀器制造有限公司）；800型電動(dòng)離心機(jī)（金壇區(qū)西城新瑞儀器廠(chǎng)）；JHBE-50S型閃式提取器（北京金鼐科技發(fā)展有限公司）；TU-1810型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡SPF級(jí)雄性ICR小鼠20只，體質(zhì)量（30±3）g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號(hào)：No.110322220100150962，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0008。小鼠于溫度為20～26℃、相對(duì)濕度為40%～60%、12 h/12 h晝夜光照循環(huán)、自由取食和飲水的條件下飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)采用頸椎脫臼處死。本實(shí)驗(yàn)遵循天津市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)中心的指導(dǎo)原則，方案經(jīng)易生源基因科技(天津)有限公司的動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，嚴(yán)格按照動(dòng)物倫理要求規(guī)范進(jìn)行。

2 方 法

2.1 不同提取方法的考察

2.1.1 提取工藝路線(xiàn) 銀杏葉→洗凈→無(wú)水乙醇脫脂→烘干→粉碎過(guò)篩（80目）→稱(chēng)量→提取方法考察→減壓過(guò)濾→濾液濃縮→4倍體積無(wú)水乙醇醇沉→4 ℃靜置12 h以上→離心（3500 r/min，10 min）→80%乙醇洗滌→干燥得銀杏葉多糖。

2.1.2 熱水浸提法單因素試驗(yàn) 按照上述路線(xiàn)，進(jìn)行水浴加熱提取，考察單個(gè)因素在提取過(guò)程中的影響，考察因素與區(qū)間有：液料比（10、20、30、40、50 mL/g）；水提溫度（50、60、70、80、90 ℃）；水提時(shí)間（1、2、3、4、5 h）。

2.1.3 酶解輔助法單因素試驗(yàn) 按照“2.1.1”項(xiàng)下路線(xiàn)，在水浴加熱提取基礎(chǔ)上加入纖維素酶輔助提取，考察單個(gè)因素在提取過(guò)程中的影響，考察因素與區(qū)間有：液料比（10、20、30、40、50 mL/g）；酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）；酶解時(shí)間（30、60、90、120、150 min）；酶解pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0）；酶用量（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%）。

2.1.4 閃式提取法單因素試驗(yàn) 按照“2.1.1”項(xiàng)下路線(xiàn)，將銀杏葉片在一定溫度下浸泡一段時(shí)間后利用閃式提取器高速粉碎，考察單個(gè)因素在提取過(guò)程中的影響，考察因素與區(qū)間有：液料比（20、30、40、50、60 mL/g）、浸泡溫度（50、60、70、80、90 ℃）；閃式提取時(shí)間（40、60、80、100、120 s）。

2.1.5 多糖含量的測(cè)定 采用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定多糖含量[13]，使用紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)在540 nm處測(cè)定吸光度，以蒸餾水為空白對(duì)照，以葡萄糖質(zhì)量濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)和吸光度A為縱坐標(biāo)，得回歸方程A=1.674C-0.132 4，r=0.998 9，線(xiàn)性范圍為0.101 6～0.609 6 mg/mL。

稱(chēng)取不同方法提取所得的多糖在蒸餾水中溶解，并按1∶1體積加入鹽酸（6 mol/mL），混勻后在沸水浴中加熱1 h，冷卻，用氫氧化鈉中和水解液至中性，過(guò)濾后定容，從中取1 mL測(cè)定吸光度值，計(jì)算多糖提取率，比較方法優(yōu)劣。公式如下：

式中：C為測(cè)定樣品中多糖質(zhì)量濃度（mg/mL）；V為定容體積（mL）；m2為試驗(yàn)提取的總多糖質(zhì)量（mg）；m1為稱(chēng)取的多糖質(zhì)量（mg）；M為銀杏葉粉末質(zhì)量（g）。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 為進(jìn)一步確認(rèn)提取方法的最佳提取工藝條件，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，選取液料比（A）、酶用量（B）、酶解溫度（C）為自變量（其他條件固定為酶解時(shí)間90 min、酶解pH=5.0），以多糖提取率為響應(yīng)值，運(yùn)用軟件Design Expert 10.0.3設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平參數(shù)

2.3 多糖精制 最佳工藝下獲得的銀杏葉多糖，在使用木瓜蛋白酶脫蛋白和HPD100型大孔樹(shù)脂脫色處理后，灌裝至透析袋中，4 ℃透析72 h，冷凍干燥，得淡黃色粉末，即精制后銀杏葉多糖，純度為72.40%。

2.4 DPPH自由基清除率測(cè)定[14-15]取2.0mL DPPH（0.1mmol/mL），加入2.0 mL不同濃度的多糖溶液（0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL），混勻，避光靜置30 min后，在517 nm處測(cè)定吸光度，記為A1；用乙醇代替DPPH溶液測(cè)定吸光度值記為A2；用蒸餾水代替多糖溶液測(cè)定吸光度值記為A0。以VC溶液作對(duì)照，計(jì)算公式如下：

2.5 亞硝酸鹽清除率測(cè)定[16]取2.0 mL亞硝酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 μg/mL），加入1.0 mL不同濃度的多糖溶液（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL），混勻，40 ℃加熱10 min，加入2.0 mL 0.4%對(duì)氨基苯磺酸溶液，混勻，靜置5 min，再加入1.0 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺，混勻后靜置15 min，定容至50 mL，在538 nm處測(cè)定吸光度值，記為A1；用蒸餾水代替標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定吸光度值記為A2；用蒸餾水代替多糖溶液測(cè)定吸光度值記為A0，以VC溶液作對(duì)照，計(jì)算公式如下：

2.6 免疫活性研究 環(huán)磷酰胺是一種烷基化試劑，具有免疫抑制、減少白細(xì)胞等作用[17]，常用于建立免疫低下模型[18]。ICR小鼠在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中維持正常光照與喂食進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。采用隨機(jī)數(shù)字表法將20只小鼠分為正常組、模型組、銀杏葉多糖低劑量組、銀杏葉多糖中劑量組、銀杏葉多糖高劑量組，每組4只。除正常組外，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺[40 mg/（kg·d）]；正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，共5 d。若小鼠出現(xiàn)食欲不振、體質(zhì)量下降，血清中免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）水平明顯下降等情況則說(shuō)明模型制備成功。銀杏葉多糖低、中、高劑量組小鼠分別灌胃給予銀杏葉多糖溶液（由生理鹽水配置），劑量分別為100、200、400 mg/（kg·d）；正常組和模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，共14 d。末次給藥后12 h，取小鼠肝臟、脾臟、胸腺，計(jì)算器官指數(shù)；收集血清，測(cè)定免疫球蛋白（IgG、IgM、IgA）含量。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 提取方法的選擇 各單因素試驗(yàn)平行3次，比較提取率。酶解輔助法提取銀杏葉多糖效果明顯優(yōu)于其余兩種方法（P＜0.05或P＜0.01），故選擇酶解輔助法進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。（見(jiàn)表2）

表2 不同方法提取銀杏葉多糖的提取率（mg/g）

3.2 響應(yīng)面法優(yōu)化銀杏葉多糖提取工藝條件

3.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 使用軟件Design-Expert 10.0.3中Response Surface的中心復(fù)合設(shè)計(jì)模塊設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，以獲得酶解輔助法提取銀杏葉多糖最佳提取工藝條件，試驗(yàn)參數(shù)與結(jié)果見(jiàn)表3。

3.2.2 方差分析與回歸模型顯著性檢驗(yàn) 通過(guò)軟件Design-Expert 10.0.3對(duì)表3中結(jié)果進(jìn)行方差分析，以多糖提取率為響應(yīng)值Y得到回歸方程：Y=25.11+1.02A-0.64B+0.40C+0.11AB-0.24AC-0.25BC-2.01A2-2.27B2-1.89C2。3個(gè)因素與響應(yīng)值之間存在非線(xiàn)性關(guān)系?；貧w方程顯著性檢驗(yàn)與方差分析結(jié)果見(jiàn)表4，可知該模型回歸顯著（P＜0.000 1），且模型失擬項(xiàng)不顯著（P=0.095 4＞0.05），其中R2=0.974 7，校正R2=0.951 9，說(shuō)明模型擬合較好，具有較高可信度，可以解釋95.19%響應(yīng)值的變化；結(jié)合方差分析結(jié)果可以看出FA（31.06）＞FB（12.30）＞FC（4.85），即對(duì)銀杏葉多糖提取率的影響大小依次為A、B、C。

表3 中心復(fù)合設(shè)計(jì)試驗(yàn)參數(shù)及結(jié)果

表4 方差分析與顯著性檢驗(yàn)

3.2.3 響應(yīng)面分析 根據(jù)模型的回歸方程，對(duì)兩兩因素間交互作用進(jìn)行分析，制作液料比（A）、酶用量（B）、酶解溫度（C）響應(yīng)曲面分析圖，見(jiàn)圖1～3。因素間交互作用越顯著，曲面坡度越陡峭，等高線(xiàn)越密集越偏橢圓形。結(jié)合各圖中3D響應(yīng)曲面平滑程度與等高線(xiàn)輪廓情況可知，液料比（A）與酶用量（B）、料液比（A）與酶解溫度（C）、酶用量（B）與酶解溫度（C）之間因素交互作用不明顯，與方差分析結(jié)果相同。

圖1 液料比與酶用量的交互作用響應(yīng)面圖

圖2 料液比與酶解溫度的交互作用響應(yīng)面圖

圖3 酶用量與酶解溫度的交互作用響應(yīng)面圖

3.2.4 最佳提取工藝驗(yàn)證 通過(guò)軟件Design Expert 10.0.3對(duì)回歸模型進(jìn)行二次回歸，預(yù)測(cè)液料比32.44 mL/g、酶用量1.93%、酶解溫度51.03 ℃為酶解輔助法提取銀杏葉多糖最佳工藝條件，預(yù)測(cè)提取率為25.30 mg/g。根據(jù)實(shí)際試驗(yàn)條件與操作進(jìn)行修正為液料比32 mL/g、酶用量1.9%、酶解溫度51 ℃，并進(jìn)行3次試驗(yàn)驗(yàn)證，提取率結(jié)果為（25.08±0.33）mg/g。實(shí)際值與理論值相近，表明優(yōu)化過(guò)程所獲得工藝條件參數(shù)良好、可靠，該提取工藝模型能夠較好預(yù)測(cè)銀杏葉多糖提取工藝。

3.3 DPPH自由基清除率測(cè)定結(jié)果 隨銀杏葉多糖溶液濃度增加，其清除DPPH自由基的能力迅速上升；當(dāng)銀杏葉多糖溶液濃度為1.0 mg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為92.76%，說(shuō)明銀杏葉多糖有較強(qiáng)的DPPH自由基清除效果。（見(jiàn)圖4）

圖4 DPPH 自由基清除率

3.4 亞硝酸鹽清除率測(cè)定結(jié)果 銀杏葉多糖的清除亞硝酸鹽能力隨濃度增加而逐漸增強(qiáng)，均優(yōu)于同濃度下的VC溶液；當(dāng)銀杏葉多糖溶液濃度為1.0 mg/mL時(shí)，亞硝酸鹽清除率達(dá)90.03%，說(shuō)明銀杏葉多糖具有較強(qiáng)的亞硝酸鹽清除能力。（見(jiàn)圖5）

圖5 亞硝酸鹽清除率

3.5 免疫活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)及血清中IgG、IgM、IgM含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。銀杏葉多糖中劑量組小鼠脾臟指數(shù)明顯高于模型組（P＜0.05）；銀杏葉多糖高劑量組小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)均明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），說(shuō)明高濃度銀杏葉多糖溶液能夠有效修復(fù)環(huán)磷酰胺對(duì)免疫器官的損傷。銀杏葉多糖中劑量組小鼠血清中IgG含量明顯高于模型組（P＜0.05）；銀杏葉多糖高劑量組小鼠血清中IgG、IgM、IgM含量均明顯高于模型組（P＜0.01），說(shuō)明高濃度銀杏葉多糖對(duì)免疫球蛋白的分泌抑制具有良好恢復(fù)效果。（見(jiàn)表5）

表5 各組小鼠器官指數(shù)及血清免疫球蛋白含量比較（±s）

表5 各組小鼠器官指數(shù)及血清免疫球蛋白含量比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01

4 討 論

銀杏葉多糖提取率除受方法和工藝的影響外[19]，同時(shí)受產(chǎn)地、采摘季節(jié)的客觀(guān)因素影響[20]。本試驗(yàn)中銀杏葉提取率最高可達(dá)2.6%。酶解輔助法利用酶破壞植物細(xì)胞壁，使有效成分溶出，操作簡(jiǎn)單而高效[21]。本研究比較了3種不同提取方法單因素試驗(yàn)的提取率，結(jié)果顯示纖維素酶解輔助法能夠有效提高銀杏葉多糖的提取率，相比于其他提取方法存在一定優(yōu)勢(shì)。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)方差分析結(jié)果顯示，影響提取率因素大小關(guān)系與單因素試驗(yàn)中的因素影響程度相符，且響應(yīng)面試驗(yàn)預(yù)測(cè)工藝下的預(yù)測(cè)結(jié)果與實(shí)際驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果接近，進(jìn)一步說(shuō)明該優(yōu)化工藝參數(shù)良好、可靠。

銀杏葉多糖的抗氧化和清除亞硝酸鹽活性與銀杏葉多糖溶液濃度之間均呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系，且銀杏葉多糖清除亞硝酸鹽的效果優(yōu)于VC溶液。脾臟、胸腺、肝臟是體內(nèi)的免疫器官，均參與機(jī)體免疫應(yīng)答環(huán)節(jié)中[22]。本研究中3個(gè)濃度銀杏葉多糖溶液均能增加免疫低下小鼠的免疫器官指數(shù)，呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性，其中銀杏葉多糖高劑量組效果明顯優(yōu)于其余兩組，說(shuō)明銀杏葉多糖能夠?qū)Νh(huán)磷酰胺所致免疫器官的萎縮產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)功效，有提升機(jī)體免疫的作用。當(dāng)機(jī)體受抗原刺激時(shí)，免疫應(yīng)答可由淋巴B細(xì)胞轉(zhuǎn)化的漿細(xì)胞分泌免疫球蛋白的方式進(jìn)行，阻斷其對(duì)機(jī)體危害的同時(shí)，也使抗原失去作用[23]。銀杏葉多糖低、中、高劑量組小鼠血清免疫球蛋白IgG、IgM、IgA含量均高于模型組，且銀杏葉多糖高劑量組效果顯著，呈濃度依賴(lài)性，說(shuō)明銀杏葉多糖能夠增強(qiáng)免疫細(xì)胞分泌免疫球蛋白，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體免疫。銀杏葉多糖能夠通過(guò)以上方式增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)能力。

綜上所述，本研究采用的纖維素酶解輔助法提取銀杏葉多糖的方法具有操作簡(jiǎn)易、條件溫和、能耗低等特點(diǎn)，對(duì)于實(shí)際生產(chǎn)具有借鑒意義。銀杏葉多糖可作為一種天然植物來(lái)源成分，用做抗氧化劑、亞硝酸鹽清除劑或免疫增強(qiáng)劑。