陳振東，施洋，張曉霞，馬強(qiáng)，樊登峰，時(shí)歡歡

（克拉瑪依市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院/克拉瑪依市人民醫(yī)院，新疆 克拉瑪依 834000）

黃芩湯出自張仲景的《傷寒論》，被譽(yù)為“萬(wàn)世治痢之祖”，由黃芩、白芍、大棗、灸甘草四味藥材組成，具有清熱解毒、止痢、和中止痛的功效，臨床上常用于下利腹痛、身熱口苦、熱痢腹痛、舌紅、脈弦數(shù)等癥。方中君藥黃芩可解少陽(yáng)之里熱，苦以堅(jiān)之。臨床上常用于治療濕溫、瀉痢、血熱吐衄、癰腫瘡毒、胎動(dòng)不安等[1-3]。研究中多將黃芩中的黃酮類(lèi)化合物黃芩苷[4-7]作為質(zhì)量控制的一個(gè)重要指標(biāo)。臣藥白芍可解太陽(yáng)之表熱而行營(yíng)氣，酸以收之?，F(xiàn)代藥理學(xué)表明，白芍中的苷類(lèi)化合物芍藥苷[8-11]具有緩急止痛、解痙的功效。灸甘草、大棗為佐使藥，用以益氣和中，調(diào)和諸藥，配合君、臣以加強(qiáng)治療作用。研究中多將甘草中的黃酮類(lèi)化合物甘草苷[12-14]作為質(zhì)量控制的一個(gè)重要指標(biāo)。因此，本研究將上述3種成分的含量作為檢測(cè)指標(biāo)，采用層次分析法（AHP）構(gòu)造成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣，并獲得各項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)評(píng)分，確定待測(cè)指標(biāo)的權(quán)重系數(shù)。通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法結(jié)合層次分析法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)選提取黃芩湯藥材的最佳工藝參數(shù)，為后續(xù)黃芩湯的研究開(kāi)發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UltiMate3000系列高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；UV-2501C紫外分光光度計(jì)（日本島津公司）；CPA-225D型電子天平（德國(guó)Sartorius）。

1.2 試藥 黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201619，含量：98.5%）、甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：110916-201904，含量：97.5%）、芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110617-201814，含量：98.5%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。黃芩、白芍、甘草均購(gòu)于安徽省亳州市華云中藥飲片有限公司，經(jīng)新疆藥物研究所何江副研究員鑒定為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根、毛茛科植物芍藥Paeonia lactiflora Pall.的干燥根、豆科植物脹果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.的根莖，并均符合2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》（一部）有關(guān)規(guī)定。甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil BDS C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇（A）-0.2%磷酸溶液（B）-乙腈（C），梯度洗脫（0～8 min，15%A∶55%B∶30%C；8～12 min 30%A→35%A，45%B→50%B，25%C→15%C；12～28 min，20%A∶50%B∶30%C），流速為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)為黃芩苷277 nm，芍藥苷230 nm，甘草苷254 nm。（見(jiàn)圖1）

圖1 HPLC 色譜圖

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取黃芩苷、甘草苷、芍藥苷對(duì)照品適量，用甲醇分別配制成5.51、1.98、3.42 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL、甘草苷對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5 mL、芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.2 mL，置于同一10 mL容量瓶中，混合搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取黃芩湯（黃芩15 g，白芍15 g，甘草10 g，大棗10 g）藥材50 g，10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過(guò)濾，70%乙醇定容至250 mL，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液的制備 分別稱(chēng)取缺黃芩、缺甘草、缺白芍的陰性對(duì)照藥材，分別加入10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過(guò)濾，70%乙醇定容至250 mL，搖勻，濾過(guò)，即得。

2.2.4 空白對(duì)照溶液的制備 精密量取甲醇溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液及空白對(duì)照溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。黃芩苷、芍藥苷、甘草苷與其相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)以各色譜峰計(jì)算均在8 220以上，說(shuō)明在選定的色譜條件下，測(cè)定效果良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、1.2、1.4 mL，分別置于10 mL容量瓶中，依次用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。分別取各系列混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，溶液的質(zhì)量濃度（X，mg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各成分線性關(guān)系

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的峰面積RSD分別為1.14%、1.19%和1.35%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于0、2、6、8、12、24 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果黃芩苷、芍藥苷、甘草苷峰面積的RSD分別為1.20%、1.18%和1.37%，其峰形和含量變化不大，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取黃芩湯藥材6份，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，記錄色譜峰面積并計(jì)算含量，結(jié)果黃芩苷、芍藥苷、甘草苷含量的RSD分別為1.24%、1.15%和1.34%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取黃芩湯藥材約25 g，共6份，分別按處方藥材濃度的100%比例加入各對(duì)照品溶液，測(cè)得黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的平均回收率分別為99.82%、98.80%、99.02%，RSD（n=6）分別為1.30%、1.20%、1.37%。加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果（n=6）

2.4 出膏率測(cè)定 精密吸取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液50 mL，置于已恒重過(guò)的蒸發(fā)皿中（W1），水浴蒸干,105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速稱(chēng)重（W），按下式計(jì)算浸膏得率。出膏率=[（W-W1）×V/（M×50）]×100%（W1為蒸發(fā)皿的質(zhì)量，W為浸膏與蒸發(fā)皿總質(zhì)量，V為溶液體積，M為藥材稱(chēng)樣量）。

2.5 提取工藝綜合評(píng)分指標(biāo)的確定 根據(jù)復(fù)方中藥味君、臣、佐、使配伍規(guī)律，采用層次分析法對(duì)出膏率和指標(biāo)性成分含量作為權(quán)重指標(biāo)予以量化。當(dāng)一致性比例因子CR＜0.1時(shí)，判斷矩陣具有一致性[15-17]。

本研究根據(jù)黃芩湯藥材中活性成分黃芩苷、芍藥苷、甘草苷含量及出膏率4項(xiàng)指標(biāo)為考查內(nèi)容采用層次分析法構(gòu)造成對(duì)比較的判斷優(yōu)先矩陣，并獲得各項(xiàng)指標(biāo)的相對(duì)評(píng)分（評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)可參見(jiàn)文獻(xiàn)[15-17]的判斷矩陣1-9標(biāo)度法）。（見(jiàn)表3）

表3 目標(biāo)成對(duì)比較判斷優(yōu)先矩陣

2.5.3 一致性檢驗(yàn) 根據(jù)矩陣最大特征根公式（1）～（3）計(jì)算隨機(jī)一致性比率。

式中m為受檢驗(yàn)層次的次目標(biāo)數(shù)，CI為一致性檢驗(yàn)因子，RI為平均隨機(jī)一致性指標(biāo)，CR為矩陣最大特征根，表示一致性比例因子。

2.6 單因素試驗(yàn) 本試驗(yàn)以黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量及出膏率的綜合評(píng)分進(jìn)行評(píng)估，優(yōu)選最佳因素。

2.6.1 乙醇濃度的考察 稱(chēng)取黃芩湯藥材約50 g，粉碎過(guò)10目篩，加入10倍溶劑，提取2次，提取時(shí)間2 h，進(jìn)行提取溶劑的考察。結(jié)果表明，以乙醇濃度為70%時(shí)各項(xiàng)含測(cè)指標(biāo)的綜合評(píng)分最高，故選擇70%乙醇為提取溶劑。（見(jiàn)表4）

表4 單因素考察乙醇濃度結(jié)果

2.6.2 提取次數(shù)的考察 稱(chēng)取黃芩湯藥材約50 g，粉碎過(guò)10目篩，加入10倍量70%乙醇，提取時(shí)間2 h，進(jìn)行提取次數(shù)的考察。結(jié)果表明，提取次數(shù)為3時(shí)各項(xiàng)含測(cè)指標(biāo)的綜合評(píng)分最高。（見(jiàn)表5）2.6.3 提取時(shí)間的考察 稱(chēng)取黃芩湯藥材約50 g，粉碎過(guò)10目篩，加入10倍量70%乙醇，提取2次，進(jìn)行提取時(shí)間的考察。結(jié)果表明，提取時(shí)間為1 h時(shí)，各項(xiàng)含測(cè)指標(biāo)的綜合評(píng)分最高，故選擇提取時(shí)間1 h。（見(jiàn)表6）

表5 提取次數(shù)考察結(jié)果

表6 提取時(shí)間考察結(jié)果

2.7 響應(yīng)面試驗(yàn)

2.7.1 試驗(yàn)結(jié)果 在單因素優(yōu)選的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)乙醇濃度（A）、提取次數(shù)（B）、提取時(shí)間（C）3個(gè)主要因素進(jìn)行考察，以黃芩苷、甘草苷、芍藥苷的含量及出膏率為考察指標(biāo)，各因素選取3個(gè)水平（-1、0、1），進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，優(yōu)選合理的條件組合，各因素水平見(jiàn)表7，試驗(yàn)安排與試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表8，對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果見(jiàn)表9。

表7 因素與水平表

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)與結(jié)果

續(xù)表8：

采用Design Expert 12.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，以綜合評(píng)分為響應(yīng)值，通過(guò)二階多項(xiàng)式進(jìn)行回歸。得回歸方程Y=97.83-0.69A +2.71B +0.73C +0.47AB-0.22AC-1.18BC-14.07A2-1.43B2-3.98C2。由表9可知，建立的數(shù)學(xué)模型極顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。模型中的A、B、C、A2、B2、C2顯著，其他不明顯。結(jié)合模型（P＜0.000 1）及失擬項(xiàng)（P=0.228 1>0.05），說(shuō)明試驗(yàn)誤差較小。根據(jù)二次多項(xiàng)式模型，應(yīng)用Design Expert 12.0軟件繪制三維響應(yīng)曲面。由回歸模型進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，綜合評(píng)分的預(yù)測(cè)值98.83。最優(yōu)提取條件為70%乙醇，回流提取2次，提取時(shí)間1 h。（見(jiàn)圖2）

表9 回歸模型的方差分析結(jié)果

圖2 綜合評(píng)分響應(yīng)面圖

2.7.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化的最佳條件，平行稱(chēng)取3份黃芩湯藥材約50 g，加入10倍量70%乙醇，回流提取2次，每次1.0 h。結(jié)果表明，黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量及出膏率的綜合評(píng)分的相對(duì)誤差均小于5%，說(shuō)明最佳提取工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性好。（見(jiàn)表10）

表10 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

采用HPLC法測(cè)定黃芩湯中黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量過(guò)程中，嘗試了多種色譜系統(tǒng)，篩選流動(dòng)相初期曾以甲醇-0.2%磷酸（40∶60）為流動(dòng)相。色譜圖顯示僅黃芩苷、芍藥苷出峰，且峰形對(duì)稱(chēng)性及分離度均較差，因此該洗脫系統(tǒng)不適用于本研究。考慮到甘草中的甘草苷未出峰，因此改換甲醇-0.2%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。色譜圖顯示黃芩苷、芍藥苷、甘草苷出峰時(shí)間較合適且峰形對(duì)稱(chēng)、分離度佳。因此，選用甲醇-0.2%磷酸溶液-乙腈為流動(dòng)相用于測(cè)定黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量。該方法操作簡(jiǎn)便、重現(xiàn)性好，一個(gè)色譜條件可同時(shí)測(cè)定黃芩苷、芍藥苷、甘草苷的含量，在保證樣品穩(wěn)定性的前提下節(jié)省了大量時(shí)間。

3.1 含測(cè)指標(biāo)加權(quán)系數(shù)的確定 由于黃芩湯藥材的成分復(fù)雜、指標(biāo)成分較多，對(duì)于其提取工藝而言，選擇合適的指標(biāo)成分尤為重要。本研究根據(jù)黃芩湯中藥材活性成分的重要程度，采用層次分析法對(duì)各成分進(jìn)行系數(shù)加權(quán)，以加權(quán)后綜合評(píng)分為因變量，不僅能全面地反映各味藥材在黃芩湯中的作用，也能直觀地反映整體提取工藝。

3.2 Box-Behnken響應(yīng)面法 通過(guò)多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，能夠準(zhǔn)確表示試驗(yàn)設(shè)計(jì)與優(yōu)化結(jié)果，準(zhǔn)確度高、可預(yù)測(cè)性強(qiáng)。通過(guò)建立綜合評(píng)分與關(guān)鍵工藝參數(shù)的數(shù)學(xué)模型，并運(yùn)用該模型預(yù)測(cè)最佳工藝為：70%乙醇，回流提取2次，每次1 h。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測(cè)值相比，其誤差均小于5%，說(shuō)明利用Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計(jì)提取工藝穩(wěn)定、可靠，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的參考價(jià)值。

3.3 波長(zhǎng)的選擇 由于黃芩苷、芍藥苷、甘草苷三者的最大吸收波長(zhǎng)不同，為保證檢測(cè)的靈敏度和響應(yīng)值最高，根據(jù)試驗(yàn)篩選，發(fā)現(xiàn)黃芩苷277 nm、芍藥苷230 nm、甘草苷254 nm波長(zhǎng)處均有較強(qiáng)吸收，為保證色譜峰峰度及分離度較佳，故選擇其作為檢測(cè)波長(zhǎng)。