林爽,王杰,高珊珊,周永康,程立偉,吉艷慧
(1.北京康仁堂藥業(yè)有限公司,北京 101301;2.中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,天津 301700;3.北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心,北京 101301)
龍血竭(resina dracaenis,RD)是我國珍稀名貴中藥材,為百合科劍葉龍血樹含脂木材提取得到的樹脂,主產(chǎn)于云南、廣西[1],素有“活血圣藥”之稱[2]。龍血竭主要化學(xué)成分有黃酮類、酚類、萜類、甾體及苷類、酯類和二苯乙烯類等[3];其中黃酮類為其主要的活性成分[4-6],其代表成分有龍血素A、龍血素B及7,4’-二羥基黃酮[7]等;具有二苯乙烯的母核結(jié)構(gòu)的化合物代表有白藜蘆醇及紫檀茋[8],常作為控制龍血竭藥材質(zhì)量的指標(biāo)性成分。龍血竭在臨床上外用具有止血生肌、止痛等作用,內(nèi)服具有活血祛瘀、定痛等功效[9]?,F(xiàn)代藥理表明,龍血竭具有抗腫瘤[10-11]、抗炎[12-13]、保護(hù)心血管[14-15]、活血止血[16-18]、鎮(zhèn)痛[19]等作用。
2020年版《中華人民共和國藥典》[20]未收錄龍血竭,僅收錄復(fù)方龍血竭膠囊,并只對龍血竭的石油醚提取物進(jìn)行薄層鑒別;含量測定項(xiàng)下對龍血素A和龍血素B的總含量進(jìn)行了規(guī)定,未收錄指紋圖譜。龍血竭藥材各地方標(biāo)準(zhǔn)基本一致,以《貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(2003年版)[21]為例,薄層鑒別與含量測定項(xiàng)的供試品制備均操作復(fù)雜,給龍血竭的定性與定量分析造成較大困難。本研究建立薄層色譜(TLC)法,并以超高效液相色譜(UPLC)法建立特征圖譜,同時通過化學(xué)計量學(xué)深入分析研究影響龍血竭質(zhì)量的主要成分群以評價龍血竭質(zhì)量,旨在為龍血竭的質(zhì)量控制提供參考。
Waters UPLC H-Class Plus超高效液相色譜儀(配備PDA檢測器)、Empower 3工作站、BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)(美國沃特世公司);MSA6.6S.0CE-DM型電子天平(d=0.001 mg)(德國賽多利斯公司);ML204T型電子天平(d=0.000 1 g)(瑞士梅特勒托利多公司);KQ-100DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司);GOODLook-1000型薄層成像系統(tǒng)(上海科哲生化科技有限公司);硅膠G薄層板(煙臺市化學(xué)工業(yè)研究所)。
白藜蘆醇(批號:111535-201703,純度:99.4%)、7,4’-二羥基黃酮(批號:111787-201002,純度:98.6%)、龍血素B(批號:111558-201407,純度:99.9%)、龍血素A(批號:DST202101-119,純度:99.97%)均購于成都德斯特科技有限公司;紫檀茋(批號:P815984,純度≥98.0%)購于北京邁瑞達(dá)科技有限公司;龍血竭對照藥材(批號:121252-201303)購于中國食品藥品檢定研究院;乙腈、磷酸均為色譜純,購于美國賽默飛世爾公司;甲醇為分析純,購于上海國藥集團(tuán);水為蒸餾水,購于廣州屈臣氏公司。
收集的18批龍血竭藥材為北京康仁堂定點(diǎn)采購的百合科植物劍葉龍血樹Dracaena cochinchinensis (Lour.) S.C.Chen.的樹脂加工品,經(jīng)北京康仁堂“中藥傳承工作室”工程師于立偉鑒定為正品龍血竭,編號分別為RD1~RD18,產(chǎn)地均為云南省,樣品具體信息見表1。
表1 龍血竭樣品信息
取0.5 g龍血竭藥材粉末,加10 mL乙酸乙酯超聲30 min,過濾,即得供試品溶液。另取龍血竭對照藥材0.5 g,同法制得對照藥材溶液。再分別取龍血素A、龍血素B對照品適量,加乙酸乙酯配制成每1 mL含1 mg的對照品溶液。參照2020年版《中華人民共和國藥典》薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn),吸取以上各溶液3~8μL,點(diǎn)于同一塊硅膠G薄層板上,以石油醚(60~90℃)-三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇(15∶8∶2∶1)為展開劑,展開,取出,晾干,噴以10%磷鉬酸乙醇溶液的顯色劑,于105 ℃加熱至斑點(diǎn)清晰,可見光下進(jìn)行顯色檢視。結(jié)果顯示,通過對18批龍血竭藥材樣品進(jìn)行薄層鑒別,龍血素A、龍血素B斑點(diǎn)清晰,與其他條帶分離良好,供試品色譜在與對照藥材色譜和對照品色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。(見圖1)
圖1 18 批龍血竭TLC 色譜圖
3.1 混合對照品溶液的制備 取白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋對照品適量,精密稱定,加甲醇配制成每1 mL分別含80、20、60、100、100 μg的混合對照品溶液,搖勻,即得。
3.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩)約0.2 g,精密稱定,置50 mL錐形瓶中,精密加入甲醇20 mL,密塞,稱定質(zhì)量,超聲處理10 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量,搖勻,濾過,取續(xù)濾液,即得。
3.3 色譜條件 采用Waters Acquity UPLCBEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)色譜柱,以乙腈-0.1%磷酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫:0~5 min,15%~25%乙腈;15~35 min,25%~30%乙腈;35~50 min,30%~40%乙腈;檢測波長為280 nm;體積流量為0.3 mL/min;柱溫為35 ℃;進(jìn)樣量為3 μL。
3.4 指紋圖譜的建立
3.4.1 共有峰確認(rèn)及色譜峰指認(rèn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備RD1~RD18供試品溶液,按“3.3”項(xiàng)下方法記錄色譜圖,進(jìn)行對照品的比對,共標(biāo)定16個共有峰。(見圖2)指認(rèn)出5個色譜峰[22],分別為白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋。(見圖3)其中峰14(龍血素B)色譜峰分離較好,基線平穩(wěn),因此將龍血素B作為參考峰(S)峰。
圖2 18 批龍血竭UPLC 指紋圖譜色譜圖
圖3 龍血竭(RD1)與混合對照品UPLC 色譜圖
3.4.2 指紋圖譜相似度的評價 將獲得的18批龍血竭色譜圖導(dǎo)入到《中藥指紋圖譜相似度評價》(2012年版)中,以RD1為參照圖譜,時間窗寬度為0.1,中位數(shù)為對照圖譜的生成方法,以16個共有峰為Mark峰匹配的方式,得到對照圖譜,計算RD1~RD18與對照圖譜的相似度在0.980~0.996之間,說明建立的指紋圖譜具有良好的一致性。
3.5 方法學(xué)驗(yàn)證
3.5.1 線性關(guān)系考察 取白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋對照品適量,精密稱定,加甲醇配制成每1 mL分別含324.68、65.62、252.48、426.92、25.392 μg的混合對照品溶液,作為線性1對照品溶液。精密量取線性1對照品溶液10.0、5.0、2.0、1.0 mL,分別置20 mL容量瓶中,加甲醇定容至刻度,得線性2~5對照品溶液后,按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定,以峰面積為縱坐標(biāo)(Y),對照品濃度為橫坐標(biāo)(X),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察結(jié)果見表2。
表2 龍血竭中5 種化學(xué)成分線性關(guān)系考察結(jié)果
3.5.2 精密度試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備RD1供試品溶液,按“3.3”項(xiàng)下方法連續(xù)6次,記錄色譜圖,結(jié)果峰1~峰16與S峰的相對保留時間RSD值為0.01%~0.56%,相對峰面積RSD值為0.18%~1.68%,白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋的含量RSD值為0.25%~0.78%。表明儀器的精密度良好。
3.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備RD1供試品溶液,分別于0、2、4、8、12、24 h,按“3.3”項(xiàng)下方法記錄色譜圖,結(jié)果峰1~峰16與S峰的相對保留時間RSD值為0.01%~0.25%,相對峰面積RSD值為0.10%~1.21%,白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋的含量RSD值為0.22%~0.98%。表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。
3.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“3.2”項(xiàng)下方法制備RD1供試品溶液6份,按“3.3”項(xiàng)下方法記錄色譜圖,結(jié)果峰1~峰16與S峰的相對保留時間RSD值為0.01%~0.78%,相對峰面積RSD值為0.15%~1.95%,白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋的含量RSD值為0.33%~1.02%。表明該方法具有良好的重復(fù)性。
3.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 取龍血竭樣品(RD1)粉末6份,每份0.1 g,加入每1 mL分別含40.45、8.20、30.10、52.60、56.25 μg的白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋混合對照品溶液20 mL,按“3.2”項(xiàng)下方法制備回收率樣品溶液,按“3.3”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定,計算各成分的加樣回收率和RSD值,結(jié)果平均回收率為98.64%~100.89%,RSD值均小于3%,表明該方法測得的結(jié)果準(zhǔn)確。
表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)
續(xù)表3:
3.6 樣品含量測定 按“3.2”項(xiàng)下方法制備18批龍血竭樣品溶液,按“3.3”項(xiàng)下方法測定,計算其含量,見表4。
表4 18 批龍血竭中5 種化學(xué)成分含量測定結(jié)果(n=2)
4.1 聚類分析(cluster analysis,CA)以18批龍血竭的16個共有峰的峰面積為變量,應(yīng)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)Z標(biāo)準(zhǔn)化處理,并進(jìn)行CA分析,采用組間聯(lián)接、平方歐式距離的方法,得聚類分析結(jié)果。(見圖4)當(dāng)類間距離為15時,樣品被分為三大類:RD1~RD10為Ⅰ類,樣品來源于云南省普洱市和臨滄市;RD11~RD12和RD17~RD18為Ⅱ類,樣品來源于云南省西雙版納傣族自治州;RD13~RD16為Ⅲ類,樣品來源于云南省西雙版納傣族自治州。提示龍血竭的質(zhì)量與產(chǎn)地存在一定的關(guān)聯(lián),同時又存在其他影響龍血竭質(zhì)量的因素,原因可能為劍葉龍血樹生長年限差異或樹脂加工方法不同。
圖4 聚類分析結(jié)果樹狀圖
4.2 主成分分析(principal component analysis,PCA)以18批龍血竭的16個共有峰的峰面積為變量,應(yīng)用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Z標(biāo)準(zhǔn)化,并進(jìn)行PCA分析,使用相關(guān)性矩陣的分析方法,得到總方差解釋結(jié)果(見表5)。提取特征值大于1的結(jié)果,共有2個,累計旋轉(zhuǎn)載荷平方和為91.596%,認(rèn)為前2個主成分能夠代表龍血竭絕大部分的質(zhì)量信息。旋轉(zhuǎn)后的成分矩陣(見表6),其中載荷的絕對值越大,對主成分的貢獻(xiàn)越大,峰2(7,4’-二羥基黃酮)、峰4、峰7、峰6、峰1(白藜蘆醇)、峰13(龍血素A)、峰14(龍血素B)在主成分1中有較高的載荷值,載荷值的絕對值均大于0.8;峰10、峰12、峰8、峰16(紫檀菧)在主成分2中有較高的的載荷值,載荷值的絕對值均大于0.8,說明影響龍血竭質(zhì)量的不止一個因素,可將影響質(zhì)量的主要成分7,4’-二羥基黃酮、白藜蘆醇、龍血素A、龍血素B及紫檀菧作為含量測定的指標(biāo)性成分。
表5 總方差解釋結(jié)果
續(xù)表5:
表6 主成分矩陣
4.3 綜合評分計算 以18批龍血竭的16個共有峰的峰面積為變量,應(yīng)用SPSS 25.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行Z標(biāo)準(zhǔn)化,得到Xi。由主成分分析得到成分得分系數(shù)a(見表6),由公式Fi=a1X1+a2X2+……+aiXi計算F1和F2,綜合得分函數(shù)為F=F1×W1+F2×W2(W為成分載荷百分比)[23]。計算18批龍血竭樣品的綜合評分(見表7),其中F值越高,代表以提取到的主成分為指標(biāo)的樣品質(zhì)量越好[24]。根據(jù)F值判斷,聚類結(jié)果為Ⅱ類的樣品質(zhì)量最好,同時第Ⅱ類樣品5種成分的含量總和亦是最高的,進(jìn)一步驗(yàn)證了含量測定指標(biāo)的選擇對樣品質(zhì)量評價具有參考價值。
表7 龍血竭藥材綜合評分
續(xù)表7:
在TLC考察中,考察以硫酸乙醇溶液和磷鉬酸乙醇溶液作為顯色劑,在使用10%硫酸乙醇溶液時,色譜圖中龍血素A呈粉紅色斑點(diǎn),龍血素B呈不清晰的淡黃色斑點(diǎn);在使用10%磷鉬酸溶液時,色譜圖中龍血素A、龍血素B分別呈現(xiàn)紫色和深藍(lán)色斑點(diǎn),兩個對照品在色譜圖中較好區(qū)分,同時供試品色譜圖中其他的斑點(diǎn)顯色清晰,與龍血竭對照藥材色譜圖中的斑點(diǎn)一致,因此選用以10%磷鉬酸乙醇溶液作為顯色劑。建立的該薄層鑒別方法,相較于貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[21],操作簡單,色譜圖顯示的信息豐富,能快速達(dá)到對龍血竭藥材的鑒別。
在UPLC法的研究中,建立了同時測定指紋圖譜及含量測定的方法。指紋圖譜能夠表征龍血竭藥材整體的質(zhì)量,共確定了16個共有峰,指認(rèn)出5個色譜峰;鑒于龍血竭中的成分較為復(fù)雜,測定一兩個成分往往具有局限性,故本研究同時對5種成分進(jìn)行定量分析,較為全面地評價龍血竭的質(zhì)量。與現(xiàn)行的貴州省中藥材民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[21]比較,本研究增加了指紋圖譜項(xiàng),同時對除龍血素A和龍血素B為指標(biāo)進(jìn)行定量分析外,還將白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、紫檀茋納入定量指標(biāo),為龍血竭藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定與提升提供較為全面的參考。
從化學(xué)計量學(xué)結(jié)果看,收集的18批龍血竭樣品質(zhì)量存在差異。根據(jù)聚類結(jié)果可分為三大類,與產(chǎn)地具有一定的相關(guān)性。主成分分析提取出的2個主成分,能夠代表龍血竭的大部分質(zhì)量信息,同時根據(jù)各共有峰的載荷值,判斷將白藜蘆醇、7,4’-二羥基黃酮、龍血素A、龍血素B、紫檀茋定位含量測定指標(biāo)的合理性。聚類結(jié)果與綜合得分F值結(jié)果基本一致。因此,可根據(jù)指紋圖譜與化學(xué)計量學(xué)結(jié)合的方式比較龍血竭的質(zhì)量,根據(jù)F值判斷,聚類結(jié)果為Ⅱ類的樣品質(zhì)量最好;計算5種成分含量的總和,以第Ⅱ類的總含量最高,提示含量測定或能判斷樣品質(zhì)量的優(yōu)劣。因未收集到足夠多的樣品,未從18批云南產(chǎn)地的龍血竭中得出產(chǎn)地、加工方式的規(guī)律,今后的研究可加以補(bǔ)充其他品質(zhì)的樣品加以研究。