熱孜亞·艾力木江，李曉娟，陳良,2，趙翡翠,2

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第四臨床醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830054；2.新疆中藥炮制研究重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830054）

烏貝腸胃膠囊來源于新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院脾胃病科的經(jīng)驗方，為現(xiàn)代中藥復(fù)方制劑[1-3]。該處方由高良姜、肉桂、佛手、木香等9味藥組成。本品的功效為溫中健胃、止酸止痛，可用于治療肝胃不和、脾胃虛寒、胃失通降[4]所致的胃腕疼痛、反酸燒心等；胃及十二指腸潰瘍[5]和慢性胃炎[6]有上述證候的患者可使用。該方在我院自20世紀70年代即以“散劑”[7]形式應(yīng)用于臨床，后經(jīng)我院脾胃科諸多醫(yī)師臨床反復(fù)驗證，處方得到不斷完善，尤其在我院首屆全國名中醫(yī)金洪元教授學(xué)術(shù)思想的指導(dǎo)下對處方進一步完善后，臨床取得了良好的療效。慢性胃炎、反流性食管炎和消化性潰瘍等胃相關(guān)疾病是當今世界的常見病和多發(fā)病，目前西醫(yī)治療這些疾病的目的是緩解癥狀，改善胃黏膜炎癥和潰瘍表面，存在一定的局限性。對于胃脘痛的治療，中醫(yī)在調(diào)節(jié)機體功能、增強胃黏膜防御能力方面有很大的優(yōu)勢，且副作用小。烏貝腸胃膠囊全方共9味藥，將原藥材混合均勻，粉碎成細粉，滅菌制成膠囊劑，減少了其苦味，便于服用攜帶、貯存。

中藥復(fù)方制劑的質(zhì)量主要體現(xiàn)在其制劑的療效、安全及穩(wěn)定性等方面[8]。中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，單一指標很難代表制劑整體質(zhì)量。因此，為了控制烏貝腸胃膠囊的綜合質(zhì)量定性和定量檢測方法，本研究專門制訂指紋圖譜，對代表性成分進行質(zhì)量控制。本研究通過中藥指紋圖譜[9-12]結(jié)合相似度評價[13]，以及運用相關(guān)化學(xué)模式系統(tǒng)聚類分析[14]與主成分分析[15]，的方法進行綜合評價。旨在為烏貝腸胃膠囊的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 2996高效液相色譜儀（美國Waters公司）；SI-234型電子天平（丹佛儀器有限公司）；SK250LHC型超聲波清洗機（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；TDZ4-WS型臺式低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；HHS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海錫儀試驗儀器有限公司）；500A型多功能粉碎機（上海塞耐機械進出口有限公司）；AP-OIP型真空泵（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 試劑 高良姜對照藥材（批號：121263-201605）、去氫木香內(nèi)酯對照品（批號：111525-201711）、木香烴內(nèi)酯對照品（批號：524-200101）、佛手對照藥材（批號：20933-201004）、胡椒堿對照品（批號：0775-200203）均購于中國食品藥品檢定研究院；其他試劑均為分析純。3批烏貝腸胃膠囊樣品（批號分別為20190820，20200702，20200703）及10批陰性對照品由新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院制劑室自制。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 高良姜 取本品10g置于錐形瓶中，加入乙酸乙酯10mL，密封，超聲提取15 min，提取液過濾后在水浴中蒸干，殘留物用少量乙酸乙酯溶解，作為供試品溶液。另取高良姜對照藥材粉末0.25 g，同供試品的制備方法制備，作為高良姜對照藥材溶液。按原處方比例，稱取缺高良姜的其他藥材，同供試品的制備方法取備，作為缺高良姜陰性對照品溶液。取上述3種溶液各5 μL分別點在H薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯-冰乙酸（20∶2∶1）作為展開劑，展開，取出晾干，均勻噴灑10%硫酸乙醇溶液顯色。結(jié)果在與高良姜對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜中顯黃色熒光的斑點，完整清晰，且無陰性干擾。（見圖1）

圖1 高良姜薄層色譜鑒別圖

2.1.2 木香 取本品5 g置于錐形瓶中，加入甲醇10 mL，密封，超聲提取40 min，提取液過濾后揮干至約2 mL，作為供試品溶液。另取去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯對照品，分別用甲醇稀釋，制備成分別為每1 mL含1 mg的去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯對照品溶液。按原處方比例，稱取缺木香的其他藥材，同供試品的制備方法制備，作為缺木香陰性對照品溶液。取缺木香陰性對照品溶液和供試品溶液各10 μL、去氫木香內(nèi)酯對照品溶液和木香烴內(nèi)酯對照品溶液各1 μL分別點在G薄層板上，以石油醚-苯-乙酸乙酯（7∶2∶1）作為展開劑展開，取出，晾干，噴灑5%香草醛硫酸乙醇溶液至顯色清晰。結(jié)果在與去氫木香內(nèi)酯和木香烴內(nèi)酯對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜中顯相同顏色的斑點，且陰性對照品無干擾。（見圖2）

圖2 木香薄層色譜鑒別圖

2.1.3 佛手 取本品10 g置于錐形瓶中，加入無水乙醇10 mL，密封，超聲提取40 min，提取液過濾后水浴蒸干，將殘留物用1 mL無水乙醇溶解，作為供試品溶液。另取佛手對照藥材1 g同供試品制備方法制備，作為佛手對照藥材溶液。按原處方比例，稱取缺佛手的其他藥材，同供試品的制備方法制備，作為缺佛手陰性對照品溶液。取缺佛手陰性對照品溶液和供試品溶液各15 μL、佛手對照藥材溶液2 μL分別點在G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯（3∶1）作為展開劑展開，取出，晾干，置于紫外燈光（365 nm）下檢視。結(jié)果在與佛手對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜中顯藍色的斑點，分離度好，陰性對照品無干擾。（見圖3）

圖3 佛手薄層色譜鑒別圖

2.1.4 蓽茇 取本品10 g置于錐形瓶中，加入無水乙醇10 mL，密封，超聲提取35 min，提取液過濾后置于棕色容量瓶中，作為供試品溶液。另取胡椒堿對照品置于棕色容量瓶中，加無水乙醇稀釋，制備成每1 mL含4 mg胡椒堿的溶液，作為胡椒堿對照品溶液。按原處方比例，稱取缺蓽茇的其他藥材，同供試品的制備方法制備，作為缺蓽茇陰性對照品溶液。取缺蓽茇陰性對照品溶液和供試品溶液各15 μL、胡椒堿對照品溶液3 μL，分別點在G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲醇（8∶2∶1）作為展開劑，展開，取出，晾干，均勻噴灑10%硫酸乙醇溶液至顯色。結(jié)果在與胡椒堿對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜中顯淡黃色的斑點，陰性對照品無干擾。（見圖4）

圖4 蓽茇薄層色譜鑒別圖

2.1.5 浙貝母 取本品15 g依次加入6 mL濃氨水和30 mL二氯甲烷，過夜，提取液過濾后水浴蒸干，殘留物用1 mL二氯甲烷溶解，作為供試品溶液。另取貝母素甲對照品，加入二氯甲烷適量，制備成每1 mL含2 mg貝母素甲的溶液，作為貝母素甲對照品溶液。按原處方比例，稱取缺浙貝母的其他藥材，同供試品的制備方法制備，作為缺浙貝母陰性對照品溶液。取缺浙貝母陰性對照品溶液和供試品溶液各20 μL、貝母素甲對照品溶液3 μL點在G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-濃氨試液（17∶2∶1）作為展開劑，展開，取出，晾干，噴灑現(xiàn)配的稀碘化鉍鉀進行顯色。結(jié)果在與貝母素甲對照品色譜相應(yīng)的位置上，供試品色譜中顯紅色斑點，陰性對照品無干擾。（見圖5）

圖5 浙貝母薄層色譜鑒別圖

2.2 含量測定

2.2.2 溶液的制備

2.2.2.1 對照品溶液的制備 稱取桂皮醛適量，加甲醇稀釋，配制成每1 mL中含0.100 2 mg桂皮醛的對照品溶液，用微孔濾膜過濾，即得。

稱取去氫木香內(nèi)酯適量，加甲醇稀釋，配制成每1 mL中含0.100 5 mg去氫木香內(nèi)酯的對照品溶液，用微孔濾膜過濾，即得。

稱桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯各適量，加甲醇稀釋，配制成每1 mL中含0.104 2 mg桂皮醛、0.103 7 mg去氫木香內(nèi)酯的混合對照品溶液，用微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品約2.5 g置于容量瓶中，加無水乙醇5 mL，密封，超聲45 min，置于離心管中，12 000 r/min離心2 min，取出，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2.3 陰性對照品溶液的制備 取除肉桂、木香外的藥材，同供試品溶液的制備方法制備，用微孔濾膜濾過，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察 桂皮醛為本方肉桂中的特有成分且肉桂為此方的君藥，去氫木香內(nèi)酯為本方木香中的特有成分，其含量相對較高，峰圖獨立并穩(wěn)定，故選擇該兩種成分進行考察分析。

圖6 HPLC圖

2.2.3.2 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.2.1”項下的桂皮醛對照品溶液0.40、1.10、1.80、2.50、3.20、3.90 mL和去氫木香內(nèi)酯對照品溶液0.25、0.75、1.25、1.75、2.25、2.75 mL至5 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，每兩種混合均勻，分別進樣測定。繪制標準曲線圖，桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯的線性回歸方程分別為：y=12 061.1x+118 970.8（x=0.999）、y=26 643.9x+469 295.5（r=0.999），表明桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯分別在0.008 0～0.078 0 mg/mL、0.005 0～0.055 0mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3.3 精密度試驗 取烏貝腸胃膠囊（批號：20190820）按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液，按“2.2.1”色譜條件連續(xù)進樣測定6次，記錄峰面積，結(jié)果桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯峰面積RSD值分別為1.56%、0.50%，表明該儀器的精密度良好。

2.2.3.4 穩(wěn)定性試驗 取烏貝腸胃膠囊（批號：20190820）按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，放置0、3、6、12、24、48 h后進樣測定，記錄峰面積，結(jié)果桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯峰面積RSD值分別為1.69%、2.30%，表明烏貝腸胃膠囊在48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.3.5 重復(fù)性試驗 取烏貝腸胃膠囊（批號：20190820）按“2.2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，進樣檢測，并記錄峰面積，結(jié)果桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯峰面積RSD值分別為1.85%、2.00%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3.6 加樣回收率試驗 吸取“2.2.2.2”項下制備的供試品溶液1 mL，共6份，依次加入適量桂皮醛對照品溶液、去氫木香內(nèi)酯對照品溶液，每份混勻后進樣測定，記錄色譜峰面積。結(jié)果桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯平均加樣回收率分別為102.43%、98.42%，RSD值分別為2.60%、0.83%。（見表1）

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.2.4 含量限度的確定 根據(jù)處方制作7批實驗室小樣，利用方法學(xué)已考察好的色譜條件，進行含量測定。結(jié)果得到每克膠囊以桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯計，分別應(yīng)不得少于（0.166 6±0.001 1）mg/g、（0.198 0±0.004 5）mg/g。

2.3 HPLC指紋圖譜

2.3.1 色譜條件 Symmetry C18色譜柱（4.6mm×150mm，5 μm），流動相：乙腈和0.1%磷酸水，梯度洗脫：0～33 min，36%乙腈；36～50 min，50%乙 腈；60～66 min，70%乙 腈；70～80 min，90%乙腈；88～90 min，36%乙腈，流速：0.8 mL/min，柱溫：30 ℃，檢測波長：225 nm，進樣量：20 μL。

應(yīng)該爭取更多的“常規(guī)報告”（regular或invited lecture）．“常規(guī)報告”的入選在很大程度上靠報告者在學(xué)術(shù)圈的知名度和研究工作的水平．現(xiàn)在常規(guī)報告的人選已經(jīng)確定，需要常規(guī)報告的入選者今后圍繞報告主題精心準備．

2.3.2 溶液的制備

2.3.2.1 混合對照品溶液的制備 稱取桂皮醛、去氫木香內(nèi)酯各適量，加甲醇稀釋，配制成每1 mL中含0.102 6 mg桂皮醛、含0.101 9 mg去氫木香內(nèi)酯的混合對照品溶液，用微孔濾膜過濾，即得。

稱取胡椒堿、木香烴內(nèi)酯各適量，加甲醇稀釋，配制成每1 mL中含0.103 0 mg胡椒堿、含0.102 2 mg木香烴內(nèi)酯的混合對照品溶液，用微孔濾膜過濾，即得。

2.3.2.2 供試品溶液的制備 按處方稱取10批藥材，每份混合均勻，打成細粉，過篩制備，各取約2.5 g放入容量瓶中，加無水乙醇5 mL密封，超聲45 min，置于離心管中，12 000 r/min離心2 min，取出，上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.3 指紋圖譜的建立 取“2.3.2.2”項下的供試品溶液，按“2.3.1”項下的色譜條件分別進行測定，記錄峰面積并計算各共有峰的保留時間和峰面積。將測出的10個圖譜數(shù)據(jù)全部導(dǎo)入到相似度評價系統(tǒng)軟件里，以S1色譜圖作為參照圖譜，時間寬度為0.22，進行全譜峰匹配，建立指紋圖譜，生成對照色譜圖R，計算相似度。最終在特征圖譜中選取了14個峰形較好的峰為共有特征峰。（見圖7～8）采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件，對劑色譜圖進行指紋圖譜分析。結(jié)果顯示，10批制劑及對照指紋圖譜相似度為0.943～0.990。（見表2）

圖7 樣品的HPLC 對照圖譜

表2 相似度評價結(jié)果

圖8 10 批樣品的HPLC 疊加指紋圖譜

2.3.4 指認共有峰 分別取“2.3.2.1”項下2種混合對照品溶液進樣分析，結(jié)果與供試品的HPLC對照圖譜進行對比指認。共有峰1、4、8、9號色譜峰分別指認為桂皮醛（保留時間為11.473 min）、胡椒堿（保留時間為33.348 min）、木香烴內(nèi)酯（保留時間為46.268 min）、去氫木香內(nèi)酯（保留時間為48.971 min）。（見圖9）

圖9 HPLC 色譜圖

2.3.5 共有峰相關(guān)分析 10批樣品中有14個共有峰。其中9號峰（去氫木香內(nèi)酯）峰位置適中，面積大，穩(wěn)定，故以其保留時間和峰面積為參照，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積。圖譜中的共有峰相對保留時間和相對峰面積計算結(jié)果見表3～4。

表3 共有峰相對保留時間

表4 共有峰相對峰面積

2.4 聚類分析 采用SPSS 21.0軟件對峰面積數(shù)據(jù)進行標準化處理，選擇組間聯(lián)接進行聚類分析。結(jié)果顯示，10批樣品可以聚為5類，其中S1、S7、S8聚為一類，S2為一類，S3、S4、S5聚為一類，S6為一類，S9、S10聚為一類。（見圖10）

圖10 聚類分析樹狀圖

2.5 主成分分析 采用SPSS 21.0軟件對樣品中14個共有峰的峰面積進行主成分分析，結(jié)果得到3個主成分因子[17]，累積方差貢獻率為86.675%＞80%。（見表5）采用最大方差法進行了正交旋轉(zhuǎn)，得出旋轉(zhuǎn)后的主因子載荷矩陣。（見表6）以3個主成分因子作為變量分別繪制出主成分分析的碎石圖和得分圖。（見圖11～12）在主成分1中6、7、14號峰有負載荷，在主成分2中6、7、12號峰有負載荷，在主成分3中1、12、13號峰有負載荷，其余共有峰都有明顯的正載荷。10批樣品可分為5類，與“2.6”項下聚類分析結(jié)果一致。表6結(jié)果顯示，4號峰（胡椒堿）對主成分1的載荷值高達0.900，8號峰（木香烴內(nèi)酯）、9號峰（去氫木香內(nèi)酯）對主成分2的載荷值分別為0.864、0.852，表明胡椒堿、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯3種成分的重要性在此評估中有主要的優(yōu)勢。

圖11 主成分分析碎石圖

表5 主成分分析特征值和方差貢獻率

表6 旋轉(zhuǎn)后的主因子載荷矩陣表

經(jīng)相關(guān)分析得出，14個共有峰中2、3、4、5、8、9、10、11號峰的8種成分可視為烏貝腸胃膠囊的重要成分，對不同批次之間存在的差異成分具有一定的貢獻。

圖12 主成分分析得分圖

3 討 論

烏貝腸胃膠囊是由9味中藥加工制成的復(fù)方制劑，具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗胃潰瘍等多種作用。該方中肉桂為君藥，其有效成分桂皮醛在胃腸道具有抗炎、抗菌、抗胃癌等作用[18-19]。木香為臣藥，其活性成分木香烴內(nèi)酯具有抗腫瘤、抗炎等作用[20]；去氫木香內(nèi)酯，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗?jié)兊茸饔肹21-23]。蓽茇為佐藥，其有效成分胡椒堿對沙鼠幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃炎具有抗炎作用[24]。因此，本研究以上述4種有效成分作為考察指標，開展了相關(guān)研究。

本研究通過對不同提取溶劑（無水乙醇、甲醇、水等）和超聲提取時間（25、45、65、85、105 min）進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用無水乙醇超聲提取45 min效果最佳。通過比較甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸液3種不同流動相，進行等度洗脫，采集圖譜時間為90 min，結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-0.1%磷酸洗脫效果為最佳，各色譜峰分離好，保留時間與分離度均符合要求，便于分析。本研究在TLC鑒別的基礎(chǔ)上對烏貝腸胃膠囊的質(zhì)量進行測定，且建立了10批烏貝腸胃膠囊的指紋圖譜，確認14個共有峰，并指認出了4個已知成分，分別為桂皮醛（1號峰）、胡椒堿（4號峰）、木香烴內(nèi)酯（8號峰）、去氫木香內(nèi)酯（9號峰）。由圖譜可知，位置適中的去氫木香內(nèi)酯峰面積大、分離度好、未有干擾峰且穩(wěn)定，故選其為參照峰。

烏貝腸胃膠囊含多味中藥材，其含量的檢測存在一定的局限性，無法全面反映該制劑的總體質(zhì)量。本研究所建立的高效液相色譜指紋圖譜方法快速簡便，重現(xiàn)性較好，為烏貝腸胃膠囊的整體質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。