許思妍，晏揚(yáng)天，邱璽瑞，王憲正，紀(jì)建建

（南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院/江蘇省兒童呼吸疾?。ㄖ嗅t(yī)藥）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210023）

糖皮質(zhì)激素是臨床上多種疾病的常用藥，具有免疫抑制、抗炎等藥理作用[1]。然而，藥理劑量的糖皮質(zhì)激素即可抑制巨噬細(xì)胞吞噬功能，降低自身免疫性抗體水平，易繼發(fā)肺部感染[2]。因此，緩解激素誘導(dǎo)的肺部免疫抑制，對(duì)于提高患兒免疫力具有重要意義。西醫(yī)主要通過匹多莫德等免疫調(diào)節(jié)劑提高機(jī)體免疫力[3]。有研究[4-5]表明，匹多莫德的治療機(jī)制單一、依從性差，使用具有較大局限性。中醫(yī)藥在提高機(jī)體免疫力、防止繼發(fā)感染發(fā)生方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在小兒呼吸道疾病防治中的作用愈來愈被重視[6]。玉屏風(fēng)散是“扶正固本”的千古名方，具有益氣固表止汗的功效[7]，常用于調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力[8]。目前的研究[9]證明，玉屏風(fēng)散可通過升高脾臟中NK細(xì)胞殺傷活性、巨噬細(xì)胞吞噬指數(shù)及CD4＋/CD8＋比值來有效緩解免疫抑制。但有關(guān)玉屏風(fēng)散對(duì)呼吸道局部免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的研究卻相對(duì)較少。呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus,RSV）是嬰幼兒嚴(yán)重急性下呼吸道感染的主要原因[10-11]，故本研究探究了玉屏風(fēng)顆粒對(duì)免疫抑制小鼠呼吸道免疫調(diào)節(jié)的影響及預(yù)防RSV感染的效果，旨在為臨床應(yīng)用玉屏風(fēng)提高免疫力并防治呼吸系統(tǒng)疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4周齡雌性Balb/c小鼠80只，SPF級(jí)，體質(zhì)量為（16.54±2.25）g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖場(chǎng)，動(dòng)物合格證編號(hào)：NO.202259263，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2018-0049。實(shí)驗(yàn)開展前，將小鼠置于室溫為24～26 ℃，相對(duì)濕度為40%～60%，12 h光暗晝夜循環(huán)的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。本研究已通過南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批（編號(hào)：202204A002）。

1.2 藥物與試劑 玉屏風(fēng)顆粒（國(guó)藥準(zhǔn)字Z10930036，批號(hào)：210518）購(gòu)自廣東環(huán)球制藥有限公司；RSV-A型A2標(biāo)準(zhǔn)株病毒購(gòu)自武漢大學(xué)病毒研究所；地塞米松（批號(hào)：923H059）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；匹多莫德（國(guó)藥準(zhǔn)字H20030325，批號(hào)：210303）購(gòu)自浙江仙琚制藥股份有限公司；流式抗體CD8-PE（批號(hào)：2016851）、NK1.1-PE（批號(hào)：4340125）、CD11c-FITC（批號(hào)：2238572）、CD4-FITC（批號(hào)：2172506）均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；實(shí)驗(yàn)所需引物購(gòu)自生興生物，引物序列IL-1β，F(xiàn)orward Primer(5'→3')：GAAATGCCACCTTTTGACAGTG，Reverse Primer (5'→3')：TGGATGCTCTCATCAGGACAG；IFN-β，F(xiàn)orward Primer (5'→3')：AGCTCCAAGAAAGGACGAACA，Reverse Primer (5'→3')：GCCCTGTAGGTGAGGTTGAT；ISG-15，F(xiàn)orward Primer (5'→3')：GGTGTCCGTGACTAACTCCAT，Reverse Primer (5'→3')：CTGTACCACTAGCATCACTGTG；RNA提取試劑：Trizol（批號(hào)：335909）購(gòu)自Invitragen公司；反轉(zhuǎn)錄體系（批號(hào)：IL8546）購(gòu)自愛必信（上海）生物科技有限公司；QPCR 試劑：2×SYBR Green supermix（批號(hào)：64403754）購(gòu)自BIO-RAD公司。

1.3 主要儀器 BD Accuri C6個(gè)人型流式細(xì)胞分析儀（美國(guó)BD生物科學(xué)公司）；超低溫冰箱（SANYO公司）；普通PCR儀（TaKaRa公司）；核酸蛋白檢測(cè)儀（Bio-Rad公司）；Step-One－Plus熒光定量PCR儀（ABI公司）；高壓滅菌鍋（日本TOMY公司）；Synergy型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millpore公司）；MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司）。

1.4 造模與分組 取健康Balb/c小鼠80只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組（n=20）、模型組（n=20）、陽(yáng)性藥組（n=10）、玉屏風(fēng)高劑量組（n=10）、玉屏風(fēng)中劑量組（n=10）、玉屏風(fēng)低劑量組（n=10）。除正常組外，其他組小鼠參照相關(guān)文獻(xiàn)[9,12]方法，構(gòu)建地塞米松誘導(dǎo)的免疫抑制模型：腹腔注射0.2 mL劑量為10 mg/kg的地塞米松混懸液，1次/d，連續(xù)注射4 d。若小鼠出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、皮毛乏光、活動(dòng)少、扎堆明顯、食量下降等免疫力低下現(xiàn)象，則說明造模成功。正常組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)注射4 d。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 免疫抑制模型構(gòu)建完成當(dāng)天（即第5天）進(jìn)行灌胃治療，每只小鼠灌胃體積為0.2 mL。參照《人和動(dòng)物間按體表面積折算的等效劑量比值表》[13]將兒童臨床用藥劑量換算為小鼠給藥劑量，其中玉屏風(fēng)高、中、低劑量組按臨床兒童等效劑量的2、1、1/2倍分別設(shè)置。玉屏風(fēng)高、中、低劑量組小鼠每天分別灌胃給予玉屏風(fēng)顆粒11.500、5.750、2.875 g/kg；陽(yáng)性藥組小鼠每天灌胃給予匹多莫德0.307 g/kg；正常組、模型組小鼠灌胃給予等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.6 病毒感染 給藥完成后，除正常組外，其余組小鼠鼻腔滴注60 μL RSV病毒感染（含50 μL空斑形成單位為1.0×106的呼吸道合胞病毒），正常組小鼠滴鼻等體積生理鹽水。RSV感染24 h后，處死各組小鼠并快速取肺部組織，一部分置于4%多聚甲醛固定，一部分快速置于液氮速凍后于-80 ℃超低溫冰箱保存。

1.7 觀察指標(biāo)

1.7.1 小鼠體質(zhì)量、脾臟質(zhì)量及脾臟形態(tài) 室溫條件下，分別于第1、7天給藥前（禁食不禁水）測(cè)量小鼠體質(zhì)量；第1、8天每組各取10只小鼠脫脊椎處死用以取材，以75%酒精消毒小鼠左側(cè)背腹交界處皮膚，無菌條件下取脾臟，剪去脂肪及筋膜組織，以生理鹽水洗去血跡并用濾紙吸干器官表面多余水分，使用電子天平稱取脾臟質(zhì)量，并拍照觀察脾臟大體形態(tài)。

1.7.2 小鼠肺泡灌洗液免疫細(xì)胞亞群 剪開小鼠喉嚨部皮膚，用鑷子分離氣管周圍組織以暴露氣管，以穿刺針插入氣管上端，0.3 mL PBS反復(fù)沖洗，獲取小鼠肺泡灌洗液（BALF）。而后裂解紅細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。隨后將細(xì)胞以1 500 r/min離心5 min，收集下層細(xì)胞，采用1×PBS洗滌，然后加入相應(yīng)流式抗體，4 ℃孵育30 min，1×PBS洗滌，使用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)CD4+T，CD8+T，樹突狀細(xì)胞（DC）、自然殺傷細(xì)胞（NK）等比例變化，采用FlowJo分析數(shù)據(jù)。

1.7.3 小鼠肺組織炎癥因子mRNA表達(dá)水平測(cè)定 取部分肺組織，提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用RT-qPCR檢測(cè)干擾素（IFN-β）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、干擾素刺激基因15蛋白（ISG15）等炎癥因子mRNA的相對(duì)表達(dá)量，方法如下：每份組織稱取約20 mg，采用Trizol一步法提取總RNA，Nanodrop儀器測(cè)量RNA濃度和純度（1.8＜OD260/280＜2.0）。1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄，使用Tarkata反轉(zhuǎn)錄試劑盒，反應(yīng)程序?yàn)?2 ℃，20 min；95 ℃，5 min；4 ℃，5 min。隨后進(jìn)行RT-qPCR。反應(yīng)在96孔或384微孔板內(nèi)進(jìn)行。IL-1β mRNA表達(dá)采用2-ΔΔct法分析，IFN-β mRNA、ISG15 mRNA表達(dá)采用2-Δct法進(jìn)行分析。

1.7.4 小鼠肺組織形態(tài)學(xué)觀察 取部分肺組織，4%多聚甲醛固定24 h，脫水，石蠟包埋，切片進(jìn)行蘇木精-伊紅染色。中性樹脂封片后，光學(xué)顯微鏡下閱片，檢查組織病變情況，并進(jìn)行炎癥評(píng)分，根據(jù)病變由輕到重的程度標(biāo)記為0分（基本正常），1分（輕度），2分（中度），3分（重度），累加所有分?jǐn)?shù)，并計(jì)算出每組動(dòng)物的平均分?jǐn)?shù)。具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 肺組織病理評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 地塞米松對(duì)小鼠免疫力的影響 免疫抑制小鼠模型構(gòu)建完成后，與正常組比較，模型組小鼠脾臟體積縮小，且體質(zhì)量、脾臟質(zhì)量均明顯降低（P＜0.05）。與正常組比較，模型組小鼠BALF中CD4+T、CD8+T、NK、DC細(xì)胞比例均明顯降低（P＜0.05）。（見圖1～2）

圖1 兩組小鼠脾臟大小、形態(tài)圖

2.2 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)模型小鼠免疫力的影響 與模型組比較，玉屏風(fēng)低、中、高劑量組小鼠的脾臟尺寸肉眼觀察均有所恢復(fù)。（見圖3）與模型組比較，玉屏風(fēng)高劑量組小鼠的脾臟質(zhì)量明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，玉屏風(fēng)高、低劑量組小鼠的體質(zhì)量均明顯增加（P＜0.05），且玉屏風(fēng)高、低劑量組間體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性藥組、玉屏風(fēng)中劑量組小鼠體質(zhì)量、脾臟質(zhì)量與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖4）

圖2 兩組小鼠免疫力評(píng)估（±s，n=10）

圖3 各組小鼠脾臟大小、形態(tài)

與模型組比較，玉屏風(fēng)高、中劑量組小鼠BALF中DC細(xì)胞的比例均明顯升高（P＜0.05）；陽(yáng)性藥組、玉屏風(fēng)低劑量組小鼠BALF中DC細(xì)胞的比例與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，玉屏風(fēng)高劑量組小鼠BALF中CD8+T和CD4+T細(xì)胞的比例均明顯升高（P＜0.05）；玉屏風(fēng)低、中、高劑量組間小鼠BALF中DC、CD8+T和CD4+T細(xì)胞的比例比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性藥組和玉屏風(fēng)低、中劑量組小鼠BALF中CD8+T和CD4+T細(xì)胞的比例與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖4）

圖4 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)模型小鼠免疫力的影響（±s，n=10）

2.3 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)模型小鼠病毒感染引起的肺部炎癥的影響 正常組小鼠肺部組織結(jié)構(gòu)清晰，腔內(nèi)無充血水腫，黏膜上皮細(xì)胞無變性壞死脫落，周圍組織無炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組小鼠肺部結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)支氣管壁的淋巴細(xì)胞少量浸潤(rùn)，鏡下可見肺泡壁充血性增厚，亦可見肺泡壁變薄，呈氣腫狀，炎癥程度較重；陽(yáng)性藥組小鼠肺泡腔病變較模型組好轉(zhuǎn)，但腔隙內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)仍較多；玉屏風(fēng)高、中、低劑量組小鼠肺組織病變及炎癥情況均較模型組顯著緩解，其中，玉屏風(fēng)低劑量組小鼠肺泡腔病變好轉(zhuǎn)，腔隙內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；玉屏風(fēng)高劑量組小鼠肺泡腔進(jìn)一步好轉(zhuǎn)，腔內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少；玉屏風(fēng)中劑量組小鼠肺組織改善最為明顯，近似恢復(fù)至正常組水平。（見圖5）

圖5 各組小鼠肺部病理切片圖（HE，×20）

與正常組比較，模型組小鼠炎病評(píng)分及肺組織中IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，玉屏風(fēng)低、中、高劑量組小鼠炎癥評(píng)分及肺組織中IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量均明顯降低（P＜0.05），且各劑量組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽(yáng)性藥組小鼠炎癥評(píng)分及肺組織中IL-1β mRNA相對(duì)表達(dá)量與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖6）

圖6 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)模型小鼠肺部炎癥的影響（±s，n=10）

2.4 玉屏風(fēng)顆粒處理對(duì)模型小鼠Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答的影響 與模型組比較，玉屏風(fēng)低劑量組小鼠肺組織中IFN-β mRNA、ISG15 mRNA表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。陽(yáng)性藥組和玉屏風(fēng)高、中劑量組小鼠肺組織中IFN-β mRNA、ISG15 mRNA表達(dá)與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見圖7）

圖7 玉屏風(fēng)顆粒對(duì)模型小鼠抗病毒免疫的影響（±s，n=10）

3 討 論

玉屏風(fēng)散具有益氣固表，扶正祛邪的功效[6]，主要成分為多糖、皂苷、黃酮類化合物等，具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，可以增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，抑制變態(tài)反應(yīng)，減少病毒感染及呼吸道疾病、過敏性疾病的反復(fù)發(fā)作[7,14]。目前有關(guān)玉屏風(fēng)散的基礎(chǔ)研究多通過脾指數(shù)、外周血及免疫器官中CD4+T和CD8+T細(xì)胞的比例評(píng)估機(jī)體的整體免疫情況[6,15-16]，較少關(guān)注對(duì)呼吸道局部免疫的影響。既往研究表明[17]，玉屏風(fēng)散可通過促進(jìn)免疫抑制小鼠口咽部甲型鏈球菌的生長(zhǎng)進(jìn)而增強(qiáng)小鼠的上呼吸道免疫力。本研究主要關(guān)注玉屏風(fēng)散對(duì)免疫抑制小鼠下呼吸道免疫的調(diào)節(jié)作用及預(yù)防RSV感染的效果，以期為其臨床應(yīng)用提供更全面的參考。

地塞米松是臨床上常用的免疫抑制劑，對(duì)免疫反應(yīng)的多個(gè)環(huán)節(jié)有抑制作用[2]。在免疫調(diào)節(jié)藥物的研究中，常被用于構(gòu)建免疫抑制模型[18]。地塞米松為一種抗炎、抗過敏藥物，可以通過降低淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的抗體數(shù)量，進(jìn)而下調(diào)免疫功能而產(chǎn)生免疫缺陷。它還能引起免疫器官，包括脾臟和胸腺的質(zhì)量下降[12]。本研究結(jié)果證明，玉屏風(fēng)顆粒能有效預(yù)防地塞米松引起的免疫器官質(zhì)量和體質(zhì)量的下降，提示玉屏風(fēng)顆?？赊卓沟厝姿蓪?dǎo)致的小鼠免疫抑制，具有免疫調(diào)節(jié)作用。T細(xì)胞亞群中的輔助性T細(xì)胞（Th）與細(xì)胞毒T細(xì)胞（Tc）在機(jī)體的細(xì)胞免疫中起重要作用[19]。根據(jù)T細(xì)胞表面標(biāo)志的不同，Th及Tc又分別稱作CD4+T和CD8+T，且CD4+T、CD8+T可相互調(diào)節(jié)，是免疫系統(tǒng)的核心部分[20]。DC細(xì)胞作為體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞，能夠有效激活初始T細(xì)胞，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的激活或耐受，對(duì)維持免疫穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[21]。NK細(xì)胞的比例反映了機(jī)體免疫清除功能的強(qiáng)弱[22]，而在RSV感染的患兒體內(nèi)，NK細(xì)胞比例越高，患兒的肺功能亦越強(qiáng)[23]。故BALF中CD4+T、CD8+T、DC、NK的比例變化可作為評(píng)估呼吸道免疫的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)顆粒可顯著恢復(fù)地塞米松誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠模型中CD4+、CD8+及DC細(xì)胞的比例，表明玉屏風(fēng)顆粒可增強(qiáng)小鼠呼吸道細(xì)胞免疫應(yīng)答。然而以上結(jié)果并未觀察到劑量依賴性，且NK細(xì)胞的比例無顯著性改變。

炎癥反應(yīng)是機(jī)體對(duì)病原微生物感染、創(chuàng)傷、變態(tài)反應(yīng)等發(fā)生的組織細(xì)胞反應(yīng)[24]。適度的炎癥反應(yīng)可促進(jìn)組織的修復(fù)，而過度的炎癥反應(yīng)易引發(fā)氣道損傷，阻止氣道的正常恢復(fù)，是肺炎、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病所共有的病理機(jī)制，為免疫過亢的表現(xiàn)[25-26]。炎癥細(xì)胞因子IL-1β是炎癥反應(yīng)的重要組成部分[27]，故可作為肺部炎癥評(píng)估的指標(biāo)之一。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠肺部炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，病理?yè)p傷嚴(yán)重，IL-1β水平較高。與模型組比較，低、中、高劑量的玉屏風(fēng)顆粒處理后，均可減輕肺部炎癥反應(yīng)，并顯著降低IL-1β水平（P＜0.05）。此外，抗病毒免疫應(yīng)答的水平可反映呼吸道免疫的平衡情況，IFN-β在其中發(fā)揮重要作用[28]，其可以通過誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白的表達(dá)進(jìn)而限制病毒的感染進(jìn)程，如類泛素蛋白ISG15?，F(xiàn)有證據(jù)表明，ISG15可類泛素（ISG）修飾某些病毒蛋白，對(duì)其進(jìn)行ISG化修飾可抑制病毒復(fù)制[29]。本研究結(jié)果表明，低劑量玉屏風(fēng)顆粒可誘導(dǎo)較高水平IFN-β mRNA及ISG15 mRNA的表達(dá)（P＜0.05），提示玉屏風(fēng)顆?？赏ㄟ^增強(qiáng)機(jī)體Ⅰ型干擾素介導(dǎo)的固有抗病毒免疫應(yīng)答來預(yù)防RSV感染。

本研究運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)、RT-qPCR等手段探討了玉屏風(fēng)顆粒對(duì)免疫抑制小鼠呼吸道免疫的調(diào)節(jié)作用及預(yù)防RSV感染的可能機(jī)制，即通過介導(dǎo)DC、CD4+T、CD8+T細(xì)胞等增強(qiáng)呼吸道局部免疫，并于RSV感染發(fā)生后提高IFN-β介導(dǎo)的抗病毒免疫應(yīng)答、減輕炎癥反應(yīng)。但其深層機(jī)制未進(jìn)一步闡明，有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。