郭穎慧，陳瑞，曹天佑，董利洋，吳同，張越，孔慧，趙琰，屈會化

（1.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京 100029；2.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 100029；3.北京中醫(yī)藥大學生命科學學院，北京 100029；4.北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，北京 100029）

高膽紅素血癥是由于血紅素過度降解或膽紅素排泄減少而引起的疾病[1]。機體游離膽紅素濃度升高，可形成穩(wěn)定的膽紅素自由基，導致脂質過氧化損傷，誘導炎癥因子的表達，從而引發(fā)炎癥反應[2-3]。本病常見于病毒性肝炎引起的急性肝炎、慢性肝炎和重型肝炎。血清高膽紅素水平的持續(xù)存在，可引起肝細胞進一步壞死而加重肝損傷[4]，是重癥肝病的主要癥狀之一[5-6]。目前現(xiàn)代醫(yī)學針對高膽紅素血癥主要采用光療和血液凈化療法[7]，但光療及血液凈化療法在降低膽紅素的同時，也存在諸多不良反應[8-9]。因此，探索一種全新、有效的治療藥物非常必要。

碳點通常被認為是一種尺寸小于10 nm的準碳基納米材料，可因碳源或制備方式的不同而呈現(xiàn)出多樣性[10]。碳點主要由sp2/sp3碳骨架及豐富的官能團/聚合物鏈組成，大量的表面基團/聚合物鏈賦予其良好的穩(wěn)定性及易于合成和表面修飾等特性[11-12]，故其廣泛用于生產光學材料[13]、生物傳感器[14]、細胞內成像探針[15]等。本團隊前期從中藥炭藥中提取分離出碳納米類成分并證明了其生物活性，如：大薊炭[16]納米類成分能通過干預共同的凝血途徑發(fā)揮止血效應，葛根炭納米類成分[17]具有抗高血尿酸和抗炎活性。因此，中藥炭藥在納米醫(yī)學領域具有很大開發(fā)潛力和研究價值。

丹參（Salvia Miltiorrhiza，SM）為唇形科植物丹參Salvia moltiorrhiza Bunge.的干燥根及根莖，始載于《神農本草經》。其炮制方法在《備急千金藥方》和《圣濟總錄》中有“熬令紫色、炒令黑黃”的記載，現(xiàn)代地方炮制規(guī)范亦記載有炒丹參、丹參炭等[18]。研究[19]發(fā)現(xiàn)丹參炭具有較好的抗氧化性。然而丹參炭起效的物質基礎研究尚未有報道，因此本課題組從納米科學技術角度探究丹參炭炮制后的物質基礎。

本研究通過高溫炭化制備工藝，從丹參炭中制備出一種新的納米物質，根據團隊前期對中藥炭藥研究的命名原則[20-22]將其命名為丹參炭納米類成分（salvia miltiorrhiza carbon isatum nanocomponents，SMC-NCs），并利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscopy，TEM）、X-射線衍射儀（X-ray diffractometer，XRD）、X-射線光電子能譜分析儀（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）、傅里葉變換紅外光譜（fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）、紫外-可見分光光度計（ultraviolet-visible spectrophotometer，UV-Vis）、熒光分光光度計（fluorescence spectroscopy，F(xiàn)L）對其微觀結構及光學特征進行分析。同時本研究建立了高膽紅素血癥小鼠肝損傷模型，通過生化病理等指標檢測來評價SMC-NCs對肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級雄性昆明小鼠（6～8周齡）30只，體質量為（31.0±2.0）g，動物生產許可證號：SCXK（京）2019-0010，質量合格證編號：No.110324211107181812，購于斯貝福（北京）生物技術有限公司。所有實驗動物均飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學良鄉(xiāng)校區(qū)動物房，保持室溫（25±1）℃左右，通風良好，空氣濕度55%～65%，明暗12 h/12 h交替，環(huán)境安靜，飼養(yǎng)期間動物隨意進食，實驗前12 h禁食不禁水。所有動物實驗均符合北京中醫(yī)藥大學倫理委員會的規(guī)定，動物實驗倫理批準號：BUCM-4-2021-092202-3084。

1.2 藥物與試劑 丹參（批號：201123001）購于北京仟草中藥飲片有限公司，生產日期為2020年11月23日，經北京中醫(yī)藥大學趙琰教授鑒定為唇形科植物丹參Salvia moltiorrhiza Bunge.的干燥根；膽紅素（bilirubin，BIL）（批號：s30376-1g）購于上海源葉生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（批號：20210407）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號：20210408）、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號：20210506）均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測試劑盒（批號：20220132）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）檢測試劑盒（批號：20220163）均購自江蘇科特生物科技有限公司；生理鹽水（批號：2201082001）購自石家莊四藥有限公司；水均為去離子水。

1.3 主要儀器 馬弗爐（北京中科澳博科技股份有限公司，型號：PXR-9）；高分辨率透射電子顯微鏡(日本電子光學實驗室，型號：Jen-1230)；透射電子顯微鏡（美國FEI公司，型號：TecnaiG220）；熒光分光光度計（日本Hitachi公司，型號：F-4500）；紫外分光光度計（英國Cambridge公司，型號：CECIL）；傅立葉轉換紅外光譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：JEN-1230）；全自動生化分析儀（美國貝克曼庫爾特有限公司，型號：AU-480）；X射線光電子能譜分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司，型號：ESCALAB 250Xi）；X射線衍射儀（德國Bruker AXS公司，型號：D8-Advanced）。

1.4 SMC-NCs的制備 稱取丹參生藥400 g于坩堝中，用錫紙加蓋密封，置于馬弗爐中高溫煅燒，馬弗爐程序升溫：第一階段5 min升溫至75 ℃，保持30 min；第二階段25 min升溫至300 ℃，保持1 h。將丹參炭粉碎，稱取60 g炭粉末，加入1 800 mL去離子水攪拌均勻，水浴鍋中煎煮1 h，用0.22 μm微孔濾膜濾過，重復3次，濾液合并，濃縮后裝入透析袋內連續(xù)透析72 h，最后將得到的SMC-NCs透析液保存在4 ℃，待用。

1.5 SMC-NCs的表征 利用透射電子顯微鏡對SMC-NCs的微觀形態(tài)及分布情況進行分析：將留置待用的SMC-NCs透析液稀釋2倍，超聲震蕩2 h后，用0.22 μm的微孔濾膜過濾，得到待測液。用1 mL注射器吸取適量待測液滴于銅網中央，通風干燥后將銅網置于透射鏡下觀察；利用X射線衍射儀分析SMC-NCs的內部空間分布狀態(tài)：取SMC-NCs透析液的凍干粉末，在研缽中研磨充分均勻后壓片，放入儀器中檢測；利用X射線光電子能譜分析儀測定SMC-NCs元素組成：取SMC-NCs透析液在凍干機中凍成粉末，將其均勻鋪在鋁箔上，再蓋上一層鋁箔，用液壓機將其壓平后放入X射線光電子能譜分析儀中進行測試；利用紫外分光光度計分析SMC-NCs溶液的紫外吸收光譜：開機預熱15 min，用去離子水測定出基線后，將稀釋后的SMC-NCs透析液放入比色皿，測試波長范圍為200～600 nm，速度為5 nm/s；紅外光譜儀分析SMC-NCs的表面官能團信息：取20 μL的SMC-NCs溶液滴入瑪瑙研缽中，與160 mg溴化鉀粉末混合，置于紅外箱中不斷研磨，使其充分干燥后，用壓力機在壓力為20 kPa條件下壓制成片，快速放入紅外光譜儀中檢測；利用熒光分光光度計測定SMC-NCs的熒光性質：儀器開機預熱30 min后，將SMC-NCs透析液倍比稀釋，放入石英比色皿，設定光譜掃描范圍為200～600 nm，狹縫寬度10 nm，測定SMC-NCs的最大激發(fā)波長及最大發(fā)射波長。

1.6 藥物的配制

1.6.1 SMC-NCs溶液的制備 將“1.4”項下得到的透析液在凍干機中凍成粉末，精密稱取一定量的SMC-NCs凍干粉，加入去離子水配置成1 mg/mL的SMC-NCs溶液。

1.6.2 造模藥的配制 避光稱取60 mg膽紅素粉末，溶于1 mL濃度為0.5 mol/L氫氧化鈉溶液中，加入9 mL去離子水，使用0.5 mol/L稀鹽酸將其滴定至pH值為8.5，于實驗前1 h內配制使用。

1.7 動物分組與給藥 將30只SPF級雄性昆明小鼠，隨機分為空白組、模型組、SMC-NCs高劑量組、SMC-NCs中劑量組、SMC-NCs低劑量組，每組6只。適應性飼養(yǎng)5 d后，SMC-NCs低、中、高劑量組分別灌胃相應質量濃度的SMC-NCs。SMC-NCs的給藥劑量依據成人用藥劑量[23]換算成小鼠的用藥劑量（按照SMC的質量計算）后，結合團隊前期預實驗給藥劑量篩選所得，即SMC-NCs高、中、低劑量分別為10.0、5.0、2.5 mg/（kg·d）。各組小鼠給藥體積均為0.01 mL/g，空白組和模型組小鼠均灌胃等體積的去離子水，1次/d，連續(xù)給藥7 d。末次給藥結束1 h后，除空白組小鼠給予同體積生理鹽水外，其余各組均腹腔注射膽紅素（150 mg/kg）制備高膽紅素血癥模型，造模后24 h，小鼠摘眼球取血處死，隨即摘取肝臟組織，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 觀察指標

1.8.1 肝組織病理切片觀察 小鼠摘眼球取血處死后取出肝組織，剪取肝左葉大小相當的同一部位，置于4%的多聚甲醛固定液中保存48 h以上。對固定好的肝組織進行乙醇脫水、石蠟包埋、切片及HE染色等處理后，在光學顯微鏡下觀察其病理學改變情況。

1.8.2 血清生化指標檢測 造模24 h后，小鼠摘眼球取血，血液室溫靜置4 h，于離心機中4 000 r/min離心10 min，收集上層血清。用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中丙氨酸氨基轉移酶（alanine transaminase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、總膽汁酸（total bile acid，TBA）的含量。

1.8.3 血清炎癥因子水平的檢測 取上述小鼠血清，采用ELISA法，按照試劑盒說明書，檢測各組小鼠血清中IL-6、TNF-α的含量。

1.8.4 抗氧化水平評估 取各組小鼠肝組織，將肝組織與生理鹽水（每1 g肝組織加入9 mL生理鹽水）勻漿后，3 000 r/min離心15 min，取勻漿上清液留置待測。按照SOD、MDA、GSH試劑盒說明書進行操作，在酶標儀波長450 nm下讀取結果，計算各組小鼠肝組織勻漿中MDA含量及SOD、GSH活性。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，服從正態(tài)分布，同時方差齊則用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 SMC-NCs的表征結果 TEM圖像顯示，SMC-NCs為空間分布均勻的類球形顆粒，在水溶液中分散均勻，無聚集成團現(xiàn)象。通過Image J軟件對其粒徑大小進行統(tǒng)計分析，其粒徑范圍在1.2～3.2 nm，主要集中在2.1 nm左右，基本符合正態(tài)分布規(guī)律。HR-TEM顯示，SMC-NCs晶格分布清晰可見，晶格間距為0.214 nm；XRD圖譜顯示其大約在2θ=26.6°處有一個衍射峰。（見圖1）

SMC-NCs的紅外光譜顯示，該納米類成分在3 441、2 922、2 852、1 632、1 402、1 099 cm-1處有吸收峰。其中3441 cm-1峰可能是-OH鍵，在2 922 cm-1和2 852 cm-1處有2個吸收峰，可能是由于甲基或亞甲基的-CH鍵伸縮振動引起的。結合1 632 cm-1和1 402 cm-1兩處吸收峰，SMC-NCs可能含有C=O、C-N、N-H、C-O-C及COO-等官能團[24]。1 099 cm-1處的吸收峰提示C-O-C的拉伸彎曲[25]。上述結果表明，在SMC-NCs的表面含有豐富的基團。SMC-NCs的紫外光譜提示可能是芳香族化合物SP2雜交的π-π躍遷所致，此外沒有觀察到雜原子（如S和N）參雜的表面態(tài)區(qū)域的N-π*躍遷。熒光光譜顯示，SMC-NCs的最大激發(fā)波長在364 nm左右，最大發(fā)射波長在457 nm左右。（見圖1）

圖1 SMC-NCs 的表征結果

利用XPS技術對SMC-NCs的元素組成和表面化學鍵進行詳細測定，結果顯示在285.29、400.28、532.03 eV處分別有3個吸收峰，提示SMC-NCs主要由C（70.07%）、O（28.08%）、N（1.84%）3種元素組成。其中C1s譜帶顯示有3個峰，其中284.79、286.44、288.25 eV分別對應C-N鍵、C-O鍵及O-C=O鍵[26-28]。N1s譜帶顯示，在399.42、400.03 eV處有吸收峰，分別對應C-N-C鍵、N-H鍵[29-30]。O1s譜帶顯示，在531.27和532.61 eV處有吸收峰，分別對應C=O鍵、C-OH/C-O-C鍵[25]。（見圖2）

圖2 SMC-NCs 表面基團和元素組成的XPS 圖譜

2.2 各組小鼠肝組織病理改變情況 空白組小鼠肝組織結構清晰，肝細胞排列整齊，邊界清楚，肝小葉結構完整，肝索放射狀排列，未見炎癥細胞浸潤；與空白組比較，模型組小鼠肝組織結構嚴重紊亂，大量炎癥細胞浸潤，肝細胞大面積壞死；SMC-NCs低劑量組小鼠肝損傷程度低于模型組，SMC-NCs高、中劑量組小鼠肝組織結構較為清晰，肝細胞壞死程度和炎癥細胞浸潤情況均明顯低于模型組。（見圖3）

圖3 各組小鼠肝組織切片（HE，×200）

2.3 各組小鼠血清AST、ALT、TBIL、TBA含量比較 模型組小鼠血清AST、ALT、TBA、TBIL含量顯著高于空白組（P＜0.01），表明高膽紅素血癥模型建立成功。SMC-NCs高、中、低劑量組小鼠血清AST、ALT、TBA、TBIL含量顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。（見圖4）

圖4 各組小鼠血清AST、ALT、TBIL、TBA含量比較（±s，n=6）

2.4 各組小鼠血清IL-6、TNF-α含量比較 模型組小鼠血清IL-6、TNF-α含量顯著高于空白組（P＜0.01）；SMC-NCs高劑量組小鼠血清IL-6、TNF-α的含量顯著低于模型組（P＜0.01），SMC-NCs低劑量組小鼠血清TNF-α低于模型組（P＜0.05）。（見圖5）

圖5 各組小鼠血清TNF-α、IL-6 水平（±s，n=6）

2.5 各組小鼠肝組織SOD、GSH活性及MDA含量比較 模型組小鼠肝組織SOD、GSH活性顯著低于空白組（P＜0.01），MDA含量顯著高于空白組（P＜0.01）；SMC-NCs高劑量組小鼠肝組織SOD、GSH活性顯著高于模型組，MDA含量顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（見圖6）

圖6 各組小鼠肝組織SOD、GSH 活性及MDA 含量比較（±s，n=6）

3 討 論

丹參作為一種傳統(tǒng)中藥材，其臨床應用歷史悠久?，F(xiàn)代研究主要從丹參酚酸及丹參酮類小分子成分來解釋其抗炎、保肝、抗氧化等生物活性[31]。隨著納米材料在醫(yī)學領域的廣泛應用，研究人員發(fā)現(xiàn)中藥炭藥納米類成分具有抗炎、抗菌、抗病毒、保肝等藥理作用[32-33]，同時炭類中藥的生物活性因其納米類成分粒徑大小及官能團不同而表現(xiàn)出差異性[20]。本研究從納米材料學角度出發(fā)，以天然產物丹參為前驅體，利用與碳點制備相似的高溫熱解法，提取分離出SMC-NCs，并通過建立高膽紅素致小鼠肝損傷模型評價其對肝損傷的保護作用。TEM、XRD結果顯示其分散度良好，粒徑大小分布在1.2～3.2nm，晶格間距為0.214 nm；UV-Vis、FL顯示其具有熒光性；結合XPS、FT-IR圖譜顯示其元素組成主要為C、O、N，以C含量居多（70.07%），且表面含有C-O-C、COO-及C-N等官能團。SMC-NCs所攜帶的官能團可能是其發(fā)揮生物活性的物質基礎。

高膽紅素血癥可以對機體多個器官、系統(tǒng)造成不同程度的損傷[34]，如高水平的膽紅素具有肝毒性，可引起肝細胞凋亡，進而出現(xiàn)繼發(fā)性的壞死[35]。TBIL、ALT、AST為臨床診斷及指導高膽紅素血癥治療的主要指標[36]，可反映肝實質損傷程度；此外，由于TBA的產生、代謝與肝臟的合成、攝取及排泄功能密切相關，且TBA水平不受黃疸等因素干擾，因此TBA也常用于反映肝功能的狀態(tài)。本實驗結果顯示，SMC-NCs高、中、低劑量組小鼠血清AST、ALT、TBA、TBIL含量顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05），表明SMC-NCs可以改善高膽紅素血癥所致的小鼠肝功能損傷。

膽紅素可以自由穿過細胞膜，對細胞和組織產生毒性作用[5-6]。在各種細胞系統(tǒng)中，過量的未結合膽紅素會導致活性氧的產生、脂質過氧化及谷胱甘肽（GSH）代謝的失衡[37]。GSH是重要的抗氧化劑，可以清除人體有害毒素及代謝物[38]。高膽紅素血癥患者體內會形成脂質過氧化物的堆積，發(fā)生氧化應激反應，且體內SOD活性與MDA的含量成負相關[3，39-40]。本研究結果顯示，SMC-NCs高劑量組小鼠肝組織SOD、GSH活性顯著高于模型組，MDA含量顯著低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），提示SMC-NCs能干預高膽紅素血癥引發(fā)的氧化應激反應，改善其氧化應激水平。

此外，研究表明高膽紅素血癥可以誘導炎癥和NF-κB激活相關的基因表達，促使IL-6、TNF-α釋放，且NF-κB通路參與了炎癥反應[41-42]。而TNF-α是NF-κB的關鍵靶點，也是NF-κB通路和炎癥介質的成熟激活因子。TNF-α通過與特定的細胞膜受體結合，誘導細胞自溶，然后進入細胞，促進溶酶體酶的釋放，從而發(fā)揮肝細胞毒性[43]。本實驗結果顯示，SMC-NCs高劑量組小鼠血清IL-6、TNF-α的含量顯著低于模型組（P＜0.01），SMC-NCs低劑量組小鼠血清TNF-α含量低于模型組（P＜0.05），提示SMC-NCs可以通過抑制炎癥反應來減輕肝功能損傷。

本研究利用納米技術成功從丹參炭中制備出SMC-NCs，并通過動物實驗證明了其對高膽紅素血癥所致肝損傷的保護作用，其發(fā)揮肝保護作用的機制可能與抑制炎癥反應及改善氧化應激有關。本研究為SMC-NCs干預高膽紅素血癥所致肝損傷的藥物研發(fā)奠定了實驗基礎，也為丹參炭發(fā)揮藥理效應的物質基礎研究提供了新的思維模式。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突