烏吉斯古楞，張文華，張彤

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的致命惡性腫瘤，發(fā)病率逐年增加，在發(fā)展中國家發(fā)病率較高[1-2]。探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，并尋找分子靶向藥物已成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)可在肝臟微環(huán)境和慢性肝臟疾病的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，能夠調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、肝臟再生和氧化還原信號，lncRNA失調(diào)可導(dǎo)致慢性肝炎、肝臟增生和氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致肝癌的發(fā)生和進(jìn)展[3]。長鏈非編碼RNA酪氨酸蛋白激酶跨膜受體1反義RNA 1(tyrosine protein kinase transmembrane receptor 1 antisense RNA 1，ROR1-AS1)在肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，且與患者臨床分期、T分期及N分期有關(guān)，ROR1-AS1高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)[4]。但ROR1-AS1對肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的調(diào)控機(jī)制尚不清晰。微小RNA-504(microRNA-504，miR-504)在肝細(xì)胞癌組織和細(xì)胞系中下調(diào)，miR-504通過介導(dǎo)FZD7/Wnt/β-catenin通路在肝癌中發(fā)揮抑癌作用[5]?；谏鲜鲅芯客茰yROR1-AS1可能通過靶向miR-504參與肝癌疾病進(jìn)展，本研究對此展開探討，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)組織標(biāo)本：選取2019年6月—2021年5月于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽外科收治肝癌患者32例，患者均無放、化療史。術(shù)中收集患者癌組織及癌旁組織(距手術(shù)切緣≥3 cm，病理檢測證實(shí)無癌細(xì)胞)標(biāo)本。本項(xiàng)研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》，且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核、批準(zhǔn)(20190711)，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。(2)細(xì)胞系及試劑：人肝細(xì)胞癌MHCC97H細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所)；si-NC、si-ROR1-AS1、miR-NC、miR-504 mimics、anti-miR-NC及anti-miR-504質(zhì)粒均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供；三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A(p21)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9、上皮型鈣黏附素(E-cadherin)兔單克隆抗體及Luciferase Reporter Assay底物試劑盒均由英國Abcam公司提供；LipofectamineTM2000試劑盒、Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)。(3)儀器設(shè)備：顯微鏡(GMM-900，上海光密儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(SpectraMax iD5，上海美谷分子儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 采用RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)，在97%濕度、5%CO2、37℃環(huán)境下培養(yǎng)MHCC97H細(xì)胞。培養(yǎng)基每2～3 d更換1次，當(dāng)細(xì)胞匯合度至80%～90%時，胰蛋白酶消化后傳代。將對數(shù)期MHCC97H細(xì)胞接種于6孔板，密度調(diào)整至1×105個/孔，細(xì)胞匯合度達(dá)60%時，分別將si-ROR1-AS1、si-NC、miR-504 mimics、miR-NC、si-ROR1-AS1和anti-miR-504、si-ROR1-AS1和anti-miR-NC轉(zhuǎn)染至MHCC97H細(xì)胞，記為si-ROR1-AS1組、si-NC組、miR-504 mimics組、miR-NC組、si-ROR1-AS1+anti-miR-504組及si-ROR1-AS1+anti-miR-NC組，采用LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24 h后更換培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

1.3 觀測指標(biāo)與方法

1.3.1 qRT-PCR檢測ROR1-AS1、miR-504表達(dá)：將患者癌組織、癌旁組織標(biāo)本移植于液氮預(yù)冷的研缽體中，研磨成粉末狀，并收集人肝細(xì)胞癌MHCC97H細(xì)胞，經(jīng)PBS清洗后，分別加入TRIzol試劑1 ml，然后上下翻動細(xì)胞、組織粉末，以保證混合均勻后，靜置10 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分離。分別再加入氯仿、異丙醇，翻動混勻后靜置5 min，離心吸取上清液于EP管中，留取RNA沉淀，最后提取MHCC97H細(xì)胞及患者癌組織、癌旁組織樣本中總RNA，并檢測其純度和濃度，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，并采用熒光定量PCR試劑盒和PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：cDNA 1 μl、SYBR Green Mix 10 μl、上下游引物各0.5 μl、ddH2O 8 μl。反應(yīng)條件：95℃ 10 min、95℃ 15 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，共計(jì)30個循環(huán)。于熒光定量PCR儀上擴(kuò)展，2-△△Ct法計(jì)算ROR1-AS1、miR-504的相對表達(dá)量。引物序列見表1。

表1 ROR1-AS1、miR-504及相應(yīng)內(nèi)參GAPDH、U6的引物序列

1.3.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)：將轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后的各組MHCC97H細(xì)胞接種于6孔板(5 000個/孔)，培養(yǎng)基每2 d更換1次。培養(yǎng)14 d后，甲醛固定30 min，結(jié)晶紫染色1 h并風(fēng)干。于顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞克隆數(shù)。

1.3.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒后的各組MHCC97H細(xì)胞接種于96孔板(2.5×104個/孔)，培養(yǎng)24 h，加入MTT(5 g/L)20 μl，孵育4 h，加入二甲基亞砜150 μl，低速震蕩，于酶標(biāo)儀490 nm處測定吸光度值(A)，計(jì)算細(xì)胞存活率=A實(shí)驗(yàn)組/A對照組×100%。

1.3.4 Transwell檢測細(xì)胞遷移、侵襲：向各組細(xì)胞中加入RPMI 1640培養(yǎng)基(不含胎牛血清)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104個/ml。遷移實(shí)驗(yàn)：取上述細(xì)胞懸液100 μl加入Transwell小室上室中，RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)500 μl加入下室。培養(yǎng)48 h，經(jīng)多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色后，倒置顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：采用RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋預(yù)冷的Matrigel基質(zhì)膠(8∶1)，并鋪于Transwell上室，晾干后加入上述細(xì)胞懸液100 μl。后續(xù)步驟與遷移實(shí)驗(yàn)相同。

1.3.5 Western-blot法檢測MMP-2、MMP-9、p21及E-cadherin蛋白表達(dá):RIPA試劑提取細(xì)胞總蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法測定蛋白濃度。將蛋白煮沸使其變性，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，各泳道上樣量為30 μg。蛋白分離后，移至聚偏(二)氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜，分別置于MMP-2、MMP-9、p21、E-cadherin抗體孵育液中，4℃過夜。再加入二抗孵育液，37℃孵育2 h。ECL顯影，Quantity One凝膠軟件分析結(jié)果。

1.3.6 雙熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證ROR1-AS1與miR-504的靶向關(guān)系:Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測ROR1-AS1、miR-504是否存在結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)ROR1-AS1、miR-504結(jié)合區(qū)域序列，構(gòu)建ROR1-AS1野生型(WT)及突變型(MUT)質(zhì)粒，并分別轉(zhuǎn)染miR-504 mimics、miR-NC，培養(yǎng)48 h后，檢測熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1 肝癌組織與癌旁組織ROR1-AS1、miR-504的表達(dá)比較 肝癌患者癌組織中ROR1-AS1水平高于癌旁組織(P<0.01)，miR-504水平低于癌旁組織(P<0.01)，見表2。

表2 肝癌組織及癌旁組織中ROR1-AS1、miR-504表達(dá)比較

2.2 抑制ROR1-AS1對MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及蛋白的影響 與si-NC組比較，si-ROR1-AS1組ROR1-AS1水平、克隆形成數(shù)、細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9蛋白水平下降(P<0.01)，miR-504、p21蛋白、E-cadherin蛋白水平升高(P<0.01)，見圖1、2，表3、4。

表3 抑制ROR1-AS1對MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響

圖1 各組MHCC97H細(xì)胞克隆形成、遷移、侵襲情況比較(結(jié)晶紫染色，×200)

注:A.si-NC組;B.si-ROR1-AS1組;C.miR-NC組;D.miR-504 mimics組;E.si-ROR1-AS1+anti-miR-NC組;F.si-ROR1-AS1+anti-miR-504組

2.3 過表達(dá)miR-504對MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-504 mimics組MHCC97H細(xì)胞的克隆形成數(shù)、細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)、MMP-2、MMP-9蛋白水平降低(P<0.01)，miR-504、p21蛋白、E-cadherin蛋白水平增高(P<0.01)，見圖1、2，表5。

表4 抑制ROR1-AS1對MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移、侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表5 過表達(dá)miR-504對MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白的影響

2.4 ROR1-AS1靶向調(diào)控miR-504表達(dá) Starbase數(shù)據(jù)庫預(yù)測，ROR1-AS1與miR-504存在互補(bǔ)序列，見圖3。雙熒光素酶報告結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ROR1-AS1和miR-NC比較，共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-ROR1-AS1和miR-504 mimics的熒光素酶活性降低(P<0.01)，見表6。

圖3 ROR1-AS1與miR-504的靶向序列預(yù)測

表6 2組細(xì)胞熒光素酶活性比較

2.5 干擾miR-504表達(dá)逆轉(zhuǎn)ROR1-AS1對MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的作用 與si-ROR1-AS1+anti-miR-NC組比較，si-ROR1-AS1+anti-miR-504組細(xì)胞克隆形成數(shù)、細(xì)胞存活率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及MMP-2、MMP-9水平升高(P<0.01)，miR-504、p21蛋白、E-cadherin蛋白水平下降(P<0.01)，見圖1、2,表7。

表7 干擾miR-504表達(dá)逆轉(zhuǎn)ROR1-AS1對MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

肝癌中異常表達(dá)的lncRNA對miRNA、mRNA和蛋白質(zhì)發(fā)揮多效作用，通過改變miRNA、mRNA的表達(dá)和穩(wěn)定性，以及影響蛋白質(zhì)表達(dá)、結(jié)構(gòu)、降解或與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的相互作用來影響多種癌癥表型[6]。因此，探究lncRNA在肝癌中的分子機(jī)制，可為肝癌的靶向治療提供新的方向。ROR1-AS1是近年來發(fā)現(xiàn)的lncRNA，主要位于細(xì)胞核中，可能參與基因轉(zhuǎn)錄的表觀遺傳調(diào)控過程，首次在套細(xì)胞淋巴瘤中被發(fā)現(xiàn)，可通過與EZH2和SUZ12相互作用發(fā)揮致癌作用[7]。Wang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，ROR1-AS1在結(jié)腸癌組織或細(xì)胞系中均高表達(dá)，具有增強(qiáng)細(xì)胞增殖、加速細(xì)胞周期、抑制細(xì)胞凋亡的作用，可能通過與EZH2結(jié)合下調(diào)DUSP5影響結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果顯示，ROR1-AS1在肝癌組織中表達(dá)增高，提示ROR1-AS1在肝癌進(jìn)展中可能起促進(jìn)作用。此外，干擾ROR1-AS1表達(dá)后，MHCC97H細(xì)胞的克隆形成數(shù)、細(xì)胞存活率、遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)降低，提示干擾ROR1-AS1表達(dá)可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。MMP-2、MMP-9可參與細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜降解過程，對細(xì)胞遷移、侵襲具有促進(jìn)作用[9]。p21能夠參與調(diào)控細(xì)胞周期，發(fā)揮腫瘤抑制作用，其高表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖[10]。E-cadherin表達(dá)下降可降低細(xì)胞間的黏附作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞脫落、遷移[11]。本研究結(jié)果顯示，與si-NC組比較，si-ROR1-AS1組MMP-2、MMP-9蛋白水平下降，p21、E-cadherin蛋白水平升高，提示干擾ROR1-AS1表達(dá)可能通過調(diào)控MMP-2、MMP-9、p21、E-cadherin蛋白水平從而抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲。

lncRNA可充當(dāng)miRNA“海綿”，抑制miRNA表達(dá)，并通過轉(zhuǎn)錄因子或修飾酶復(fù)合物調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[12-15]。通過搜索Starbase數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，miR-504可能是ROR1-AS1的靶基因。此外，ROR1-AS1過表達(dá)可誘導(dǎo)骨肉瘤MG-63細(xì)胞遷移，促進(jìn)N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)，抑制E-鈣黏蛋白的表達(dá)。雙熒光素酶測定證明，ROR1-AS1與miR-504存在靶向關(guān)系，ROR1-AS1過表達(dá)可抑制MG-63細(xì)胞中miR-504的表達(dá)，miR-504過表達(dá)可消除ROR1-AS1對骨肉瘤細(xì)胞遷移和增殖的部分影響[16]。本研究亦通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，miR-504是ROR1-AS1的靶基因。miR-504在胃癌組織中高表達(dá)，可通過靶向RBM4促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡[17]；miR-504過表達(dá)可抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的遷移、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化等惡性行為，miR-504低表達(dá)與患者間充質(zhì)亞型轉(zhuǎn)變及較差的生存期有關(guān)[18]。以上研究顯示，miR-504可在多種惡性腫瘤中發(fā)揮不同作用。本研究結(jié)果顯示，肝癌組織中miR-504表達(dá)下調(diào)，提示miR-504在肝癌中發(fā)揮抑癌作用。同時，過表達(dá)miR-504可抑制肝癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力，并下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)，上調(diào)p21、E-cadherin蛋白表達(dá)，再次證明miR-504的抗肝癌作用，且這種抗癌作用可能與調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)有關(guān)。此外，沉默ROR1-AS1可導(dǎo)致miR-504表達(dá)升高，而抑制miR-504表達(dá)可減弱沉默ROR1-AS1對MHCC97H細(xì)胞增殖、遷移、侵襲的影響，進(jìn)一步證實(shí)miR-504是ROR1-AS1的靶基因。

綜上所述，ROR1-AS1在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，抑制ROR1-AS1表達(dá)可能通過靶向miR-504抑制肝癌MHCC97H細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

烏吉斯古楞：課題實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過程，論文審核；張文華：分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文撰寫；張彤：論文終審，論文撰寫