木朝宇，張曉梅，范德勝，劉培明，姚慧琳

宮頸癌(cervical cancer,CC)是女性中最常見的癌癥之一[1]，全球診斷出527 600例新的CC病例，僅2012年就有265 700例CC相關(guān)死亡[2]。 CC在15～44歲的女性中普遍存在，是第8位最常見的女性癌癥[3]。在全球范圍內(nèi)，中國占新CC病例的11.9%，每年死亡率為11.1%[4]。流行病學(xué)評估在無干預(yù)的情況下，中國新發(fā)CC的發(fā)生率可能會從2010年到2050年增加40%～50%[5]。

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)屬于高度異質(zhì)性的DNA病毒，可引起皮膚和黏膜上皮內(nèi)細(xì)胞內(nèi)瘤變。大約40種HPV基因型感染生殖道黏膜，這已被證明是宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(CIN)和CC的主要原因[6]。HPV可根據(jù)其與癌前病變的關(guān)聯(lián)性分為高危型(high-risk,HR)和低危型(low-risk,LR)，有報道指出HPV高危亞型的持續(xù)性或反復(fù)性感染是CC及其癌前病變進(jìn)展的重要危險因素[7]。目前共18種HPV亞型(包括-16,-18,-26,-31,-33,-35,-39,-45,-51,-52,-53,-56,-58,-59,-66,-68,-73和-82等)被歸類為能促進(jìn)宮頸病進(jìn)展為CC的高危亞型[7]。生殖道高危型HPV感染情況由于地域、氣候條件和種族的差別等因素的影響，HPV亞型的分布在全球范圍內(nèi)具有差異性。一項(xiàng)覆蓋五大洲數(shù)百萬病例的研究[8]表明，HPV-16是世界上最流行和致癌的基因型，其次是HPV-18。然而，在巴西排名第二的是HPV-31和HPV-33，在非洲排名第二的是HPV-52[8-9]，以上表明在某些地區(qū)非HPV-16/18亞型的重要性。有研究[11-13]表明CIN病人中最常見的三種HR HPV亞型是HPV-52、HPV-16和HPV-58[10]。

在我國，HPV的基因型分布也存在地理上的差異[14-19]。因此，為了有效使用HPV疫苗以及優(yōu)化CC預(yù)防策略，HR HPV亞型在特定區(qū)域分布以及相關(guān)宮頸癌前病變(CPLs)與CC病人中流行特征有必要進(jìn)行深入的了解。本研究中對安徽北部地區(qū)HPV感染女性病人中高危亞型的流行及其CPLs與CC分布特征進(jìn)行分析，旨在為該地區(qū)有效接種HPV疫苗預(yù)防CC提供參考依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 2017年3月至2019年5月淮北礦工總醫(yī)院就診、篩查和體檢并接受HPV分型檢測的女性6 382例(淮北礦工總醫(yī)院集團(tuán)包括淮北市精神病院等在內(nèi)的14家分院，27個礦區(qū)衛(wèi)生站，分布在安徽北部的淮北市、宿州市和亳州市)，該研究人群年齡19～90歲。根據(jù)HPV檢測結(jié)果，僅有一種亞型感染者定義為單一感染，而兩種或者兩種以上亞型混合感染者定義為多重混合感染。840例HR HPV感染樣本病理結(jié)果分為四組：其中正常組(包括慢性宮頸炎病人等)693例,低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)(CIN Ⅰ)組73例,高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)(CIN Ⅱ與CIN Ⅲ)組40例，CC組34例。

1.2 試劑與儀器 HPV核酸擴(kuò)增分型檢測試劑盒、核酸分子快速雜交儀，均為中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司配套儀器和試劑；核酸擴(kuò)增儀為美國ABI7500 PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 宮頸樣本由婦科醫(yī)生通過細(xì)胞刷獲得，并將采集宮頸上皮脫落細(xì)胞標(biāo)本置于樣本保存液中，4 ℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 核酸抽提 將樣品混合并放入帶有1 mL細(xì)胞保存溶液的1.5 mL離心管中，以12 000 r/min離心3 min，除去上清液，在向沉淀物加入1 mL 0.9%氯化鈉溶液后渦旋混勻，以12 000 r/min離心3 min，再次除去上清液，并將100 μL變性試劑(中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司)加入到沉淀中并渦旋混勻。然后，將樣品在100 ℃溫育10 min，并以12 000 r/min離心3 min，收集上清液，并所得核酸用于實(shí)驗(yàn)或于-20 ℃中保存待用。

1.3.3 PCR-DNA反向點(diǎn)雜交技術(shù) PCR反應(yīng)條件為：95 ℃、15 min;95 ℃、40 s，55 ℃、40 s，72 ℃、40 s，40個循環(huán);72 ℃、7 min，4 ℃維持，即可得到擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物。然后，將擴(kuò)增的產(chǎn)物純化，變性并雜交。核酸分子雜交及HPV基因分型的顯色結(jié)果判定分析等過程均參考試劑盒說明書。試劑盒檢測的高危亞型包括15種高危亞型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73和82)。

1.4 宮頸組織病理活檢 對于宮頸液基細(xì)胞學(xué)和高危型HPV檢查結(jié)果出現(xiàn)異常的病人會建議其進(jìn)行宮頸組織病理活檢，采取陰道下行宮頸組織活檢的檢查方法，并將采集的標(biāo)本送檢。本研究中宮頸組織病理檢查數(shù)據(jù)由我院病理科提供。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 HR HPV感染的流行性 本研究中6 382例樣本基因分型檢測顯示HR HPV感染率為13.16%(840/6 382)。HR HPV亞型感染包括高危單一型(530,8.30%)，高危混合型(122,1.91%)以及高低?；旌闲?188,2.95%)。

2.2 HR HPV感染亞型分布 HR HPV 15種亞型均被檢出，所有高危亞型總頻數(shù)為1 114，亞型的前5名依次為HPV-52(17.70%,197/1114)、HPV-16(14.54%,162/1 114)、HPV-58(10.30%,115/1 114)、HPV-51(7.00%,78/1 114)、HPV-56(6.55%,73/1 114)。HPV單一感染中高危亞型總頻數(shù)為530，主要亞型依次為HPV-16(9.00%,100/1114)、HPV-52(8.20%,91/1 114)、HPV-58(5.50%,61/1 114)、HPV-39和HPV-51(3.14%,35/1 114)以及HPV-68(3.10%,34/1 114)等；HPV高危多重感染中高危亞型總頻數(shù)為584，主要亞型依次為HPV-52(9.51%,100/1114)、HPV-16(5.57%,62/1114)、HPV-58 和HPV-53(4.84%,54/1114)、HPV-51(3.86%,43/1114)以及HPV-56(3.77%,42/1 114)等。

2.3 HR HPV亞型及宮頸病變在不同年齡組中的分布 不同年齡段女性病人人群HR HPV感染陽性占比以41～50歲年齡段為最高(38.30%)，其次是51～60歲(24.40%)，31～40歲(20.10%)，≥61歲(9.10%)，≤30歲(8.10%)。HR HPV感染病人的陽性占比隨著年齡的增長而增大，在41～50歲年齡段達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢，各年齡組感染差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.53，P>0.05)；同時，41～50歲也是HR HPV亞型頻數(shù)分布最多的年齡段(36.00%)，其次是51～60歲(24.10%)，31～40歲(19.74%)，≥61歲(11.58%)，≤30歲(8.61%)。其中主要的亞型依次是HPV-52(18.20%，106/584)、HPV-16(10.60%,62/584)和HPV-58(9.20%,54/584)。此外，HR HPV感染病人中宮頸病變的分布也主要集中在41～50歲(42.09%,63/147)，其次是51～60歲(27.20%,40/147)，31～40歲(17.00%,25/147)，≥61歲(11.60%,17/147)，≤30歲(1.40%,2/147)。LSIL與HSIL分布隨年齡段增大而增加，在41～50歲達(dá)到最高，隨后降低；而CC分布則在41～50歲和51～60歲年齡段達(dá)到最高，隨后呈下降趨勢。

2.4 HR HPV感染中CPLs及CC的分布 840例HR HPV感染中病理診斷包括正常組693例，LISL組73例，HSIL組40例及CC組34例。HR HPV單一感染中正常組421例，LISL組52例，HSIL組28例及CC組29例，而多重感染中正常組272例，LISL組21例，HSIL組12例及CC組5例，HR HPV單一感染與多重感染在CPLs及CC分布上差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.73，P<0.01)。隨著宮頸病變等級的增加，HPV感染陽性占比均逐漸降低。同樣，隨著宮頸病變程度的加重，HR HPV感染的陽性占比也基本呈現(xiàn)降低的趨勢。此外，147例宮頸病變病人HR HPV亞型頻數(shù)分布為：LSIL組分布有16種高危亞型，出現(xiàn)頻率較高的亞型依次為HPV-16、HPV-52、HPV-58和HPV-56等；其中HSIL組分布有11種高危亞型，主要亞型依次為HPV-16、HPV-33、HPV-58以及HPV-52等；CC組分布有11種高危亞型，主要亞型依次為HPV-16、HPV-58、HPV-18和HPV-68、HPV-39等(見表1)。

表1 HR HPV感染亞型中LSIL、HSIL及CC的分布

3 討論

CC是中國女性最常見的癌癥之一。據(jù)估計(jì)，每年有85 000例新病例發(fā)展為HPV相關(guān)癌癥，其中75 000例被診斷為CC[20]。由于HPV感染是CC的主要原因[21]，因此有必要評估HPV感染率以及HR HPV亞型在女性中的分布特征，以篩查CC的風(fēng)險。然而，在我國不同人口和地區(qū)之間不僅HPV基因型流行分布具有地域性，同時其感染率也存在差異性。HPV感染率如北京(6.70%)、曲靖(8.30%)、新疆(8.27%)、浙江(10.20%)、云南(12.90%)、山西(14.80%)和遼寧(10.30%)[22-28]。本研究顯示，女性病人的總體HPV患病率(包括高風(fēng)險和低風(fēng)險HPV)為16.40%，略高于報告的自然感染率。相比于以上地區(qū)，本研究中HPV感染率較高。相比以下地區(qū)，安徽省北部HPV感染率較低，如青島(32.20%)，哈爾濱(36.45%)和中國東南部(22.30%)[17-18,29]。

本研究中，HR HPV的感染主要基因型為HPV-52、HPV-16和HPV-58，與東亞地區(qū)HPV感染中HPV-52和HPV-58占比較高的報道相似[10,13,30]。與我國其他地區(qū)相比，這三種最常見的HR-HPV亞型(HPV-16、HPV-52和HPV-58)的流行與青島市、山西省和遼寧省的報道相似，但與新疆省(HPV-16、HPV-58和HPV-39)，中國東南部(HPV-16、HPV-18和HPV-58)，北京(HPV-16、HPV-58和HPV-33)和哈爾濱市(HPV-16、HPV-33和HPV-81)的HR HPV流行不同。相比之下，HPV-18盡管被證明是全球第二常見的基因型[8,31]，但在本研究中的感染頻率較低(47/1 114,4.22%)。特別是HPV18在CC的亞型分布中依然是排名第三的高危亞型，這也說明除了HPV-16、HPV-18的致病力是不容忽視的。

女性HPV感染流行的年齡特異性信息對于設(shè)計(jì)疫苗和預(yù)防CC的保護(hù)策略十分重要[18]。本研究中，41～50歲年齡組HR HPV感染陽性占比(38.30%)以及CPL和CC占比(42.90%)最高。其中41～50歲年齡組CPLs分布最高，而41～60歲年齡組CC的分布最高，這提示安徽北部地區(qū)41～50歲的女性感染HR HPV和CPLs發(fā)生的風(fēng)險較高，而41～60歲年齡組發(fā)生CC的風(fēng)險較大。安徽省北部地區(qū)感染HR HPV的41～50歲、41～60歲年齡組女性分別是CPLs、CC發(fā)生的高危人群，這與四川省的報道有所不同[32]，臨床應(yīng)加強(qiáng)HR HPV感染的41～60歲女性人群CC的篩查力度。

本研究中HPV-16、HPV-52和HPV-58是導(dǎo)致CPLs和CC的主要基因型。CPLs和CC的HPV感染以單一亞型感染為主，這與CC傾向于HPV單一高危型的感染的報道一致[33]。尤其是HPV-16單一感染中，CPLs和CC占比均最高，與HPV基因型的致病力與宮頸病變、宮頸病變后病情進(jìn)展以及癌病程度相關(guān)的文獻(xiàn)報道一致[34-36]。值得注意的是，HPV52在HPV感染流行中排名第一，卻在發(fā)生CPLs和CC的亞型分布中排名第二且主要引起LSIL，這也和國內(nèi)的大多數(shù)文獻(xiàn)報道相似。

綜上所述，安徽北部地區(qū)HR HPV的感染流行亞型主要是HPV-52、HPV-16和HPV-58,41～50歲以及41～60歲年齡組女性分別是CPLs、CC發(fā)生的高危人群。HR HPV單一亞型(尤其HPV16單一亞型)感染是導(dǎo)致CPLs和CC的主要基因型。

(致謝：感謝本院病理科胡亞翎主任在本研究中給予的指導(dǎo)和科室同事們的幫助)