王衛(wèi)國，王偉偉，馮玉虎

急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)是發(fā)生于淋巴系前體細胞的惡性腫瘤，從免疫表型上可分為急性T淋巴細胞白血病(T-ALL)和急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)。白血病相關免疫表型是相關基因表達異常的表觀特征之一，對ALL的診斷、治療后的監(jiān)測和預后判斷上都有極其重要的價值[1-2]。CD304是一種非酪氨酸激酶的跨膜C型凝集素，是血管內皮生長因子共受體，參與神經元引導和血管生成，可在漿細胞樣樹突細胞、內皮細胞和多種實體瘤上表達，CD304異常表達對診斷母細胞性漿細胞樣樹突細胞腫瘤具有重要價值[3-4]。目前，CD304在ALL中表達和應用價值國內尚未發(fā)現相關文獻報道，本研究通過對ALL細胞CD304表達進行分析，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2017年7月至2020年8月我院診斷的ALL病人37例，其中B-ALL病人32例，T-ALL病人5例。ALL的診療依據《成人急性淋巴細胞白血病診斷與治療指南(2016年版)》[5]。選取10例良性血液病作為對照：5例缺鐵性貧血、5例巨幼細胞性貧血病人，檢測骨髓中前體B細胞CD304的表達。

1.2 試劑和儀器 CD117、CD33、CD7、CD19、CD10、CD34、CD9、CD200、CD15、CD13、CD56、CD123、CD38、CD66c、CD5、CD22、Cu和CD79a熒光標記單克隆抗體、溶血劑、鞘液、FACSCalibur流式細胞儀(FCM)均購自BD Biosciences公司，藻紅蛋白標記CD304購自DAKO公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫表型的檢測 抽取骨髓2 mL，計數后調整細胞濃度為(10～20)×109/L，采用四色抗體組合。胞質抗原需要對細胞固定、破膜，胞膜抗原的檢測：每管加入標本25 μL，分別加入相應量的抗體，避光染色15 min，每管加入2 mL溶血劑溶血10 min，離心后棄上清，加入300 μL磷酸鹽緩沖液上機檢測，Cellquest軟件分析。對照組采用CD10/CD304/CD45/CD19組合檢測B祖細胞上CD304的表達?？乖磉_≥20%為陽性，抗原表達<20%為陰性，陽性率≥50%為強陽性，<50%為弱陽性[6]。

1.3.2 CD304和BCR-ABL共陽性ALL病人微小殘留病(minimal residual disease，MRD)檢測 為評估CD304在MRD檢測中的價值，選擇本研究中陽性頻次較多的BCR-ABL和CD304共陽性的樣本，利用FCM和PCR(通過15189認證第3方分子實驗室)檢測。選取21份樣本，BCR-ABL融合基因采用實時定量PCR方法(最低檢出限為1/105)，FCM法采用包括CD304的四色組合，至少收集20萬個細胞(最低檢出限為1/104)。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用t(或t′)檢驗、χ2檢驗和Fisher′s確切概率法。

2 結果

2.1 B-ALL病人一般臨床資料比較 BCR-ABL1陽性病人CD304表達陽性率高于E2A-PBX1和融合基因陰性病人(P<0.05)；CD304陰性和陽性B-ALL病人的性別、年齡、白細胞計數(WBC)、紅細胞計數(RBC)、血紅蛋白(Hb)和血小板計數(PLT)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。

2.2 B-ALL細胞CD304表達 5例T-ALL細胞和10例對照者B細胞上均不表達CD304，B-ALL病人43.75%(14/32)表達CD304：10例BCR-ABL陽性(12例)、1例TEL-AML1陽性和3例融合基因陰性(14例)病人CD304陽性表達，而3例E2A-PBX1陽性和2例MLL/AF4陽性病人CD304陰性表達。CD304表達模式見圖1。

表1 B-ALL病人一般臨床資料比較

2.3 CD304陰、陽表達的B-ALL細胞其他相關CD分子陽性頻率比較 與CD304陰性比較，CD304陽性病人B-ALL細胞CD66c表達頻率升高(P<0.01)(見表2)。

2.4 FCM與PCR檢測MRD符合率 共檢測了21份樣本MRD，PCR陽性11份，FCM陽性10份，共陽性10份，陽性符合率為91%，陰性符合率91%，總符合率為95%。

表2 CD304陰、陽性表達的B-ALL白血病相關CD陽性頻率比較(n)

3 討論

免疫表型對白血病類型的診斷極其重要，發(fā)現ALL細胞異常表達的抗原，對診斷和鑒別診斷價值極高。CD304對于ALL細胞是一種跨系抗原，本次實驗發(fā)現B-ALL中CD304陽性率為43.75%(14/32)，這與國外相關文獻報道的陽性率相當[7-8]，而T-ALL和其他非ALL的對照者的B細胞中均未發(fā)現陽性表達，提示CD304的陽性表達對B-ALL白血病母細胞具有較高的特異性。B-ALL不同融合基因陽性的細胞抗原表達譜存在差異，如BCR-ABL陽性常表達CD13、CD25、CD66c，TEL-AML1陽性不或弱表達CD9、CD20，MLL基因重排陽性常表達NG2、CD15[9-10]。本研究發(fā)現12例BCR-ABL融合基因陽性病人中有10例CD304陽性，1例TEL-AML1陽性病人表達CD304，而3例E2A-PBX1和2例MLL陽性病人不表達CD304，BCR-ABL融合基因陽性病人存在較高的陽性率。MEYERSON等也報道10例Ph+陽性B-ALL有9例表達CD304[11]，GUDAPATI等的研究也支持這種結果。SOLLY等[12]報道27例TEL-AML1均表達CD304[12]，CD304表達與TEL-AML1(ETV6-RUNX1)融合基因呈正相關,而與TCF3-PBX1(E2A-PBX1)融合基因呈負相關[7]，本次檢測結果雖然數量較少，但佐證了上述報道結果，提示CD304在B-ALL中表達與否與其他抗原一起對融合基因的預判具有一定價值，也發(fā)現14例融合基因陰性病人中有3例表達CD304，提示CD304的異常表達在B-ALL有一定的廣泛性和異質性。分析B-ALL中其他抗原表達，發(fā)現CD304陽性白血病細胞CD66c表達陽性頻率增加，這與本次樣本中BCR-ABL陽性比例較高有關[13]。單一免疫表型與白血病預后的關系一直存在爭議，雖然有報道認為CD304表達是B-ALL預后不良因素[14]，但在預后較差的E2A-PBX1、MLL融合基因陽性病人出現頻率較低[7-8,11-12]，說明CD304的表達與B-ALL預后的關系尚需進一步研究，尤其是新藥時代下BCR-ABL陽性的ALL的療效已發(fā)生明顯變化[15]。

由于FCM評估MRD優(yōu)勢比較明顯，經濟、便捷、樣品易得，新的免疫標記可以提高流式細胞儀監(jiān)測MRD的適用性和準確性。區(qū)分性好的跨系對MRD的準確測定價值很高，雖然抗原表達的熒光強度是判斷標準之一，但由于抗體比例不當或該特定通道的電壓較低，易導致表達水平降低的誤判。我們對本次研究中融合基因陽性并表達CD304的病人進行MRD檢測結果比較，結果顯示利用CD304標記的FCM法與PCR法具有較好的符合率，其中有1例PCR結果陽性而FCM陰性，可能是因為本實驗FCM不是二代流式，其檢測結果的靈敏度沒有PCR高。

總之，雖然本次是小樣本量的研究，但結果顯示CD304是一種在B-ALL病人中表達頻率較高，具有較好的臨床價值，利用CD304檢測適用病人的MRD是一種較好的選擇。