郝 博，董 銳，邱權(quán)威，王逸童，左蘆根，劉牧林

結(jié)直腸癌是危害人類健康的第三大惡性腫瘤，其高發(fā)病率(每年全球新發(fā)病例1 096 601例，占所有癌癥的6.1%)和高死亡率(每年全球死亡病例551 269例，占所有癌癥的5.8%)，是全球公共衛(wèi)生面臨的重大挑戰(zhàn)[1]。近年來，對結(jié)直腸癌分子機制研究取得了重大的進展，但是由于結(jié)直腸癌的高轉(zhuǎn)移率及高復(fù)發(fā)率，結(jié)直腸癌仍然是癌癥主要的死因；基于此，亟需找到一種可用于結(jié)直腸癌治療預(yù)后的預(yù)測工具[2]。先前的大多數(shù)相關(guān)研究都是基于臨床病理特征(如腫瘤大小、腫瘤數(shù)量、淋巴結(jié)及血管浸潤等)和單分子生物標(biāo)志物[如癌胚抗原(CEA)、糖類抗原(CA199)、CH24和CA242等]構(gòu)建的預(yù)后模型[3-4]；盡管如此，仍沒有找到一種可靠的指標(biāo)可準(zhǔn)確用于結(jié)直腸癌治療預(yù)后的預(yù)測。

隨著對結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)在結(jié)直腸癌的惡性進展中起著重要的作用。免疫反應(yīng)對癌癥的產(chǎn)生具有雙向作用，正常條件下癌組織作為一種異常的器官可被免疫系統(tǒng)消滅清除；但在某些情況下卻可以促進癌變[5-6]。結(jié)直腸癌中存在著大量的異質(zhì)性，在克隆選擇的作用下，基因組不穩(wěn)定性使結(jié)直腸癌產(chǎn)生不同的細胞群體[7]。新的細胞群體間具有不同的免疫特性，突變的腫瘤細胞通過躲避免疫系統(tǒng)的攻擊獲得無限增殖的能力，使腫瘤細胞異質(zhì)化的分子事件可能促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展[8-9]。

近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、前列腺癌及肝癌等腫瘤中聯(lián)合多個基因所作的預(yù)后模型可顯著提高預(yù)后預(yù)測的準(zhǔn)確性；免疫相關(guān)基因在結(jié)直腸的惡性進展中具有重要作用，然而關(guān)于免疫基因所作的預(yù)后模型在結(jié)直腸癌中尚缺乏相關(guān)的研究[10-12]。本研究利用預(yù)后相關(guān)免疫基因建立預(yù)后模型，首次研究了多種免疫基因聯(lián)合在結(jié)直腸癌預(yù)后預(yù)測中的優(yōu)勢；并分析了結(jié)直腸癌中免疫細胞及轉(zhuǎn)錄因子及免疫基因的相互作用關(guān)系。本研究摒棄了單基因預(yù)后預(yù)測的敏感性低或靈敏度低的缺陷，有望為結(jié)直腸癌的治療及預(yù)后提供一個可靠的指標(biāo)，并為結(jié)直腸癌的免疫反應(yīng)研究提供了一定的參考。

1 材料與方法

1.1 結(jié)直腸癌中差異基因的篩選 從腫瘤基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(The Cancer Genome Atlas，TCGA)下載結(jié)直腸癌基因表達數(shù)據(jù)集(包含41例正常結(jié)直腸組織樣本及473例結(jié)直腸癌組織樣本)和臨床病理特征數(shù)據(jù)，引用R軟件“Limma”包對表達數(shù)據(jù)集進行差異分析，篩選出在結(jié)直腸癌中差異表達的基因[13]。

1.2 結(jié)直腸癌中差異免疫基因的篩選 從免疫基因數(shù)據(jù)庫(Immunology Database Analysis Portal，ImmPort)下載結(jié)直腸癌相關(guān)免疫基因(共包含2 498個免疫相關(guān)基因)，應(yīng)用Perl軟件對差異基因與免疫基因取交集處理，篩選出在結(jié)直腸癌中差異表達的免疫基因[14]。

1.3 結(jié)直腸癌中預(yù)后相關(guān)免疫基因的篩選 對TCGA數(shù)據(jù)庫結(jié)直腸臨床病理數(shù)據(jù)進行整理，刪除數(shù)據(jù)不完整病例；將病人生存時間(共包含395個生存數(shù)據(jù))與差異基因表達數(shù)據(jù)進行合并；然后引用R軟件“survival”包進行生存分析，篩選出結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)免疫基因。

1.4 結(jié)直腸癌中差異轉(zhuǎn)錄因子的篩選 通過轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)網(wǎng)站(http：//www.cistrome.org/)，下載腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(共包含318個腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)。將轉(zhuǎn)錄因子與差異基因取交集后獲得在結(jié)直腸癌中差異表達的轉(zhuǎn)錄因子[15]。

1.5 構(gòu)建結(jié)直腸癌免疫基因預(yù)后模型 對結(jié)直腸癌中差異免疫基因進行多因素COX分析，篩選出可作為結(jié)直腸癌獨立預(yù)后風(fēng)險因子的差異免疫基因；并計算出各風(fēng)險基因?qū)Σ∪祟A(yù)后的風(fēng)險系數(shù)，根據(jù)風(fēng)險系數(shù)構(gòu)建免疫基因預(yù)后模型。構(gòu)建免疫基因模型風(fēng)險評分=(CoefficientmRNA1×mRNA1的表達)+(CoefficientmRNA2×mRNA2的表達)+......+(CoefficientmRNAn×表達mRNAn)[16]。

1.6 免疫基因預(yù)后模型風(fēng)險評分對結(jié)直腸癌病人預(yù)后的驗證 根據(jù)預(yù)后模型風(fēng)險評分將病人分為高風(fēng)險組(風(fēng)險評分>中位風(fēng)險評分)和低風(fēng)險組(風(fēng)險評分<中位風(fēng)險評分)；引用R軟件“survival”包對風(fēng)險評分進行生存分析。然后，引用R軟件“survivalROC”包對風(fēng)險評分的預(yù)后價值繪制ROC曲線，根據(jù)曲線下面積(AUC)評價預(yù)后模型對病人的預(yù)后價值。AUC=1，預(yù)測效果較好；AUC=[0.85,0.95],預(yù)測效果很好；AUC=[0.7,0.85],預(yù)測效果一般；AUC=[0.5,0.7],效果較低。

1.7 免疫基因預(yù)后模型及病人臨床病理特征獨立預(yù)后分析 將預(yù)后模型風(fēng)險評分及臨床病理特征與病人生存時間進行合并；然后對合并數(shù)據(jù)進行單因素及多因素COX分析，評價預(yù)后模型風(fēng)險評分及各臨床病理特征對病人預(yù)后的獨立風(fēng)險。單因素COX分析表示風(fēng)險因子與病人預(yù)后具有相關(guān)性；多因素獨立分析表示風(fēng)險因子可作為病人預(yù)后的獨立風(fēng)險因子。

1.8 免疫基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性分析 引用R軟件對差異轉(zhuǎn)錄因子與差異免疫基因進行相關(guān)性檢驗分析，并根據(jù)相關(guān)性系數(shù)R對結(jié)果進行篩選。|R|<0.3無相關(guān)性；0.3<|R|<0.5具有低度相關(guān)性；0.5<|R|<0.8具有中等程度相關(guān)；|R|>0.8具有高度相關(guān)性。

1.9 預(yù)后模型與結(jié)直腸癌免疫細胞的相關(guān)性分析 通過腫瘤免疫資源網(wǎng)站(https：//cistrome.shinyapps.io/timer/，TIMER)下載TCGA數(shù)據(jù)庫中的各結(jié)直腸癌病例中免疫細胞的含量；對免疫細胞數(shù)據(jù)和預(yù)后模型數(shù)據(jù)進行曲交集，篩選出同時具有2組數(shù)據(jù)的病例；然后引用R軟件對免疫細胞含量及預(yù)后模型風(fēng)險評分進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌中差異基因的篩選 以|LogFC|>1,P<0.05的條件篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6 478個基因在結(jié)直腸癌中差異表達(其中1 716個基因表達下調(diào)，4 762個基因表達上調(diào))。引用R軟件“pheatmap”包對差異基因繪制熱圖(見圖1A)及火山圖(見圖1B)。

2.2 結(jié)直腸癌中差異免疫基因的篩選 從ImmPort下載結(jié)直腸癌相關(guān)免疫基因(共包含2 498個免疫相關(guān)基因)，安裝Perl軟件對免疫基因與結(jié)直腸癌中的差異表達基因進行取交集，篩選出在結(jié)直腸癌中差異表達的免疫基因(共包含467個差異表達的免疫基因)，引用R軟件“pheatmap”包對差異表達的免疫基因繪制熱圖(見圖2A)、火山圖(見圖2B)。

2.3 結(jié)直腸癌中預(yù)后相關(guān)免疫基因的篩選 從TCGA數(shù)據(jù)庫下載結(jié)直腸癌的臨床病理數(shù)據(jù)，然后將病人生存時間與結(jié)直腸癌中差異表達免疫基因進行合并。引用R軟件“survival”包，通過單因素COX分析篩選出預(yù)后相關(guān)的免疫基因(包含50個預(yù)后相關(guān)免疫基因，其中11個低風(fēng)險比基因，39個高風(fēng)險比基因)，對結(jié)果繪制森林圖(見圖3)。風(fēng)險比(hazard ratio，HR)[HR=暴露組的風(fēng)險函數(shù)h1(t)/非暴露組的風(fēng)險函數(shù)h2(t),t指在相同的時間點上]。

2.4 結(jié)直腸癌中差異轉(zhuǎn)錄因子的篩選 通過TF網(wǎng)站，下載腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(共包含318個腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子)。將腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)直腸癌差異表達基因取交集，獲得在結(jié)直腸癌中差異表達的腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(共有68個差異轉(zhuǎn)錄因子，其中23個轉(zhuǎn)錄因子表達下調(diào)，45個轉(zhuǎn)錄因子表達上調(diào))。并引用R軟件“pheatmap”包繪制熱圖(見圖4A)、火山圖(見圖4B)。

2.5 結(jié)直腸癌免疫基因預(yù)后模型構(gòu)建 引用R軟件“survival”包對結(jié)直腸癌中差異免疫基因作多因素COX分析，篩選出可作為結(jié)直腸癌獨立預(yù)后風(fēng)險因子的差異免疫基因(共包含18個差異免疫基因，其中4個基因與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，14個基因與預(yù)后呈正相關(guān))及個模型基因的風(fēng)險系數(shù)(risk coefficient)(見表1)。構(gòu)建免疫基因模型風(fēng)險評分=(CoefficientmRNA1×mRNA1的表達)+(CoefficientmRNA2×mRNA2的表達)+......+(CoefficientmRNAn×表達mRNAn)。

表1 結(jié)直腸癌中預(yù)后模型免疫基因的篩選

2.6 免疫基因預(yù)后模型風(fēng)險評分對結(jié)直腸癌病人預(yù)后的驗證 風(fēng)險評分生存分析見圖5A，ROC曲線見圖5B。引用“pheatmap”包分析每例病人的風(fēng)險評分與其生存狀態(tài)的關(guān)系，評價預(yù)后模型對評估病人預(yù)后的價值；并繪制生存狀態(tài)圖(見圖5C)、風(fēng)險曲線(見圖5D)和風(fēng)險熱圖(見圖5E)。結(jié)果顯示，高風(fēng)險組相較于低風(fēng)險組預(yù)后較差(P<0.05)；預(yù)后模型對評估病人預(yù)后性能較好(AUC=0.861)；風(fēng)險評分高的病人總體預(yù)后較差，該模型對病人預(yù)后顯示出較為可靠的價值。

2.7 免疫基因預(yù)后模型及病人臨床病理特征獨立預(yù)后分析 將預(yù)后模型風(fēng)險評分及結(jié)直腸癌病人臨床病理特征進行合并，引用R軟件“survival”包對預(yù)后模型及病人臨床病理特征作單因素(見圖6A)及多因素(見圖6B)COX分析，分析預(yù)后模型及臨床病理特征對結(jié)直腸癌病人的獨立預(yù)后作用，并繪制森林圖對結(jié)果進行可視化。結(jié)果顯示，免疫基因預(yù)后模型、TNM分期及病人及年齡可做為評估病人預(yù)后的獨立風(fēng)險因子。

2.8 結(jié)直腸癌中轉(zhuǎn)錄因子和免疫基因相關(guān)性分析 為進一步研究結(jié)直腸癌中轉(zhuǎn)錄因子和免疫基因的相關(guān)性，引用R軟件對結(jié)直腸癌中的差異轉(zhuǎn)錄因子及差異免疫基因作相關(guān)性檢驗。按相關(guān)系數(shù)|R|>0.4,P<0.001的條件對結(jié)果進行篩選，并應(yīng)用cytoscape軟件作轉(zhuǎn)錄因子和免疫基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖(見圖7)進行可視化(線條多少表示相關(guān)性強弱，線條越多相關(guān)性越強，線條越少相關(guān)性越差)。結(jié)果顯示，SLIT2、INHBA、SEMA3G、PLCG2等免疫基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性較強；CCL28、CD1B等免疫基因與轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)性較差。LMC2、IKZF1、IRF4等轉(zhuǎn)錄因子與免疫基因相關(guān)性較強；KLF4、CDK2、EZH2等轉(zhuǎn)錄因子與免疫基因相關(guān)性較差。由此，我們推測轉(zhuǎn)錄因子通過與免疫基因相互作用在結(jié)直腸癌中發(fā)揮作用。

2.9 預(yù)后模型與結(jié)直腸癌免疫細胞的相關(guān)性分析 通過TIMER下載TCGA數(shù)據(jù)庫中的各結(jié)直腸癌病例中免疫細胞的含量；并利用R軟件對免疫細胞的含量與預(yù)后模型風(fēng)險進行相關(guān)性分析，結(jié)果以散點圖進行可視化。結(jié)果顯示，風(fēng)險評分與B細胞(見圖8A)無明顯相關(guān)性，與CD4-T細胞(見圖8B)、CD8-T細胞(見圖8C)、樹突狀細胞(見圖8D)、巨噬細胞(見圖8E)及中性粒細胞(見圖8F)呈正相關(guān)，|R|>0.1,P<0.05。結(jié)果表明，免疫基因可影響免疫細胞的產(chǎn)生，并協(xié)同促進結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展。

3 討論

根據(jù)“腫瘤免疫編輯”學(xué)說，腫瘤是免疫逃逸的結(jié)果[17]。腫瘤細胞是一種不正常的細胞，表現(xiàn)為基因突變和致癌基因的過表達。理論上，免疫細胞可以通過識別這些突變和異常表達的蛋白清除不正常的細胞，從而把腫瘤消滅于萌芽狀態(tài)，即“免疫監(jiān)視”作用[18]。但免疫監(jiān)視作用并不能完全地避免惡性腫瘤的發(fā)生，而且腫瘤一旦產(chǎn)生就會隨著病情的發(fā)展，其惡性程度漸進增加，并最終發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是免疫系統(tǒng)與腫瘤細胞一系列動態(tài)復(fù)雜的相互作用過程[19]。新生的腫瘤細胞具有較強的抗原性，在非特異性免疫機制(如吞噬細胞、天然殺傷細胞等)和特異性免疫機制(如CD4+T細胞、CD8+T細胞)的作用下，很快被免疫系統(tǒng)識別清除[20-21]。在與免疫系統(tǒng)相互作用的過程中一些腫瘤細胞發(fā)生變異并逃過了免疫編輯的“清除”作用而存活下來。在免疫系統(tǒng)的壓力下，存活的腫瘤細胞不斷的發(fā)生突變。隨著突變效應(yīng)的積累，使腫瘤細胞產(chǎn)生一系列惡性表型(如不能表達MHC分子，或不能產(chǎn)生腫瘤肽)而不能被T細胞識別，從而逃脫免疫殺傷[22]。此外，腫瘤細胞可使自身的細胞凋亡信號通路發(fā)生改變，從而逃避免疫細胞誘導(dǎo)的腫瘤細胞凋亡；同時，腫瘤會產(chǎn)生一個抑制免疫細胞的微環(huán)境，在這個微環(huán)境中，腫瘤細胞會釋放一些具有免疫抑制功能的分子，如TGF-β、IL-10等，并能誘導(dǎo)產(chǎn)生表達CTLA-4的調(diào)節(jié)T淋巴細胞，對其他免疫細胞產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對腫瘤的免疫耐受[23- 24]。由此，免疫系統(tǒng)的抗腫瘤機制已全面崩潰，腫瘤細胞的生長完全失控并發(fā)生廣泛轉(zhuǎn)移。

本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫篩選出了與結(jié)直腸癌預(yù)后相關(guān)的免疫基因，并以此構(gòu)建免疫基因預(yù)后模型。這些基因可通過不同的途徑調(diào)節(jié)免疫細胞的功能，及誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生發(fā)展的免疫微環(huán)境產(chǎn)生。例如，CD1B可將腫瘤細胞中的脂質(zhì)以抗原的形式呈遞給自脂反應(yīng)性T細胞(HJ1T)并將其激活，激活的HJ1T細胞通過CD8+T細胞在早期和后期直接裂解腫瘤細胞，有效地殺死表達CD1B的腫瘤細胞而在腫瘤免疫中發(fā)揮保護作用[25]。成纖維細胞生長因子2(FGF2)對細胞生物學(xué)功能具有廣泛的調(diào)節(jié)作用，包括增殖、血管生成、遷移、分化和損傷修復(fù)。FGF2在甲型流感中通過miR-194-FGF2信號軸抑制甲型流感病毒引起的肺損傷[26]。CCL28作為一種具有廣泛抗菌活性的趨化因子，對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌以及真菌具有廣泛的抗菌活性，作為表達CCR10和/或CCR3的細胞(如漿細胞)的化學(xué)吸引劑，在黏膜免疫中發(fā)揮雙重作用[27]。CCL28作為連接先天免疫和適應(yīng)性免疫的錨定點的作用，對B和T細胞表現(xiàn)出很強的歸巢能力，并協(xié)調(diào)淋巴細胞的轉(zhuǎn)運和功能[28-29]。ILC3是腸屏障保護系統(tǒng)的重要組成部分。腸道ILC3-神經(jīng)中樞形成一個非常嚴(yán)格調(diào)節(jié)的組織特異性電路，通過VIP-VIPR2信號通路誘導(dǎo)ILC3依賴的IL-22細胞因子產(chǎn)生以控制炎癥性腸道疾病[30]。血管活性腸肽(VIP)在免疫中的作用可以概括為先天性和適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)，包括抗炎作用，調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細胞和產(chǎn)生致耐受性樹突狀細胞[31-32]。

本研究的免疫基因預(yù)后模型在預(yù)測結(jié)直腸癌預(yù)后中表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，基于預(yù)后模型建立的風(fēng)險評分對病人具有可靠的預(yù)后評價，高風(fēng)險組病人的預(yù)后相對于低風(fēng)險組預(yù)后較差。預(yù)后模型風(fēng)險評分可作為評估病人預(yù)后的獨立風(fēng)險因子，這進一步驗證了本研究預(yù)后模型。進一步研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)直腸癌中也呈現(xiàn)差異表達，并且與免疫基因之間具有相互調(diào)控關(guān)系；免疫基因預(yù)后模型風(fēng)險評分與CD4-T細胞、CD8-T細胞等免疫細胞具有相關(guān)性。由此，推測轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)節(jié)免疫細胞的差異表達影響免疫細胞的產(chǎn)生，促進腫瘤細胞的產(chǎn)生及遠處轉(zhuǎn)移而調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌病人的預(yù)后。

本研究集中研究了結(jié)直腸癌中不斷變化的免疫基因的預(yù)后作用，避免了單個免疫基因的局限。盡管對結(jié)直腸癌免疫基因、轉(zhuǎn)錄因子及免疫細胞作了詳盡細致的分析，并且結(jié)果具有潛在的實質(zhì)性臨床意義，但是仍存在幾個問題。首先，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是一個多步驟、多程序、多種基因的過程；在構(gòu)建預(yù)后模型時，僅有18個免疫基因用于模型構(gòu)建，一些重要的差異免疫基因被排除在外，最終降低了模型的性能。其次，需要在結(jié)直腸癌中驗證轉(zhuǎn)錄因子、免疫基因的表達及免疫細胞的含量，并進行細胞功能試驗及機制研究以揭示轉(zhuǎn)錄因子、免疫基因及免疫細胞在調(diào)控結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中復(fù)雜的機制。