高長(zhǎng)久 丁 崧 盧 芳 柳長(zhǎng)鳳 于棟華 劉樹(shù)民

1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江哈爾濱 150040

格雷夫斯?。℅raves disease，GD）又稱(chēng)毒性彌漫性甲狀腺腫，是一種甲狀腺器官特異性自身免疫性疾病，其特征是促甲狀腺激素受體抗體的產(chǎn)生，導(dǎo)致甲狀腺功能亢進(jìn)[1]。當(dāng)前，治療GD 主要有抗甲狀腺藥物、手術(shù)和放射性碘3 種治療方式[2-3]，但存在著復(fù)發(fā)率高、易伴發(fā)甲狀腺功能減退等問(wèn)題[4]。GD 屬于中醫(yī)“癭病”范疇，甲狀腺腫大為中醫(yī)之“痰凝”。本病初期多為氣機(jī)郁滯，繼而津凝痰聚，痰氣搏結(jié)頸前。日久引起血脈瘀阻，氣、痰、瘀三者常協(xié)同為患。隨著病情的進(jìn)展，本病常發(fā)生病機(jī)轉(zhuǎn)化。如肝氣郁結(jié)日久可化火，火熱內(nèi)盛，耗氣傷陰，導(dǎo)致氣陰兩虛之候[5]。驗(yàn)方芪玄抑甲寧補(bǔ)氣滋陰、清肝降火、化痰散結(jié)，廣泛應(yīng)用于臨床，并取得良好療效，其由黃芪、玄參、浙貝母、夏枯草和牡蠣5 味中藥組成，前期藥效學(xué)研究已證實(shí)其對(duì)GD 有顯著改善作用[6-8]，但其具體作用機(jī)制尚未明確。因此，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)芪玄抑甲寧治療GD 的作用機(jī)制，并對(duì)篩選的部分預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以期初步探討芪玄抑甲寧治療GD 的作用機(jī)制，為其進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，為中藥防治GD 提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6 周齡SPF 級(jí)雌性BALB/c 小鼠，體重（20±2）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)SCXK（京）2021-0006。動(dòng)物于溫度20～26℃、濕度40%～60%條件下適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院完成，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2018-007。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021 061101）。

1.1.2 藥品與試劑 芪玄抑甲寧的組方配伍如下，黃芪∶玄參∶牡蠣∶浙貝母∶夏枯草=3∶2∶2∶2∶1（以上飲片均由黑龍江修生堂藥業(yè)有限公司提供，批號(hào)分別為20190401、20190401、20200601、20191101、20190701），按最優(yōu)工藝提取藥物[9]，制備成凍干粉備用；甲巰咪唑片（Merck KGaA，批號(hào)：C10002097）；重組腺病毒Ad-TSHR-289（賽業(yè)生物科技有限公司，滴度：3.13×1011PFU/ml）；小鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：202109）；血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（plateletendothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1）小鼠單克隆抗體（武漢賽維爾生物科技有限公司，貨號(hào)：GB12063）。

1.1.3 主要儀器 酶標(biāo)儀（奧地利安圖斯公司，型號(hào)：Anthos2010）；高速冷凍離心機(jī)（安徽科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司，型號(hào)：KDC-160HR）；脫水機(jī)（DIAPATH，型號(hào)：Donatello）；包埋機(jī)（武漢俊杰電子有限公司，型號(hào)：JB-P5）；病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016）。

1.2 研究方法

1.2.1 芪玄抑甲寧活性成分及其靶點(diǎn)的獲取 運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)和化學(xué)專(zhuān)業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)收集芪玄抑甲寧中5 味中藥黃芪、玄參、夏枯草、浙貝母和牡蠣的化學(xué)成分，通過(guò)口服生物利用度≥30%，類(lèi)藥性≥0.18 篩選活性成分及其靶點(diǎn)[10]。

1.2.2 GD 相關(guān)靶點(diǎn)的獲取 運(yùn)用GeneCards、在線人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET、靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)和DrugBank檢索“Graves’disease”，合并去重得到GD 相關(guān)靶點(diǎn)。

1.2.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與核心靶點(diǎn)的篩選將芪玄抑甲寧相關(guān)靶點(diǎn)與GD 相關(guān)靶點(diǎn)取交集并繪制維恩圖，將共有靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，選擇度值＞2 倍中位數(shù)的靶點(diǎn)作為核心靶點(diǎn)。

1.2.4 芪玄抑甲寧-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及核心成分的篩選 將藥物、活性成分、靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape得到“芪玄抑甲寧-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，選擇度值＞2 倍中位數(shù)的活性成分作為核心成分。

1.2.5 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析 將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape 平臺(tái)，進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析。

1.2.6 芪玄抑甲寧對(duì)GD 小鼠甲狀腺血管新生的影響前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，芪玄抑甲寧對(duì)GD 模型小鼠的外觀行為、甲狀腺組織病理形態(tài)具有改善作用，并對(duì)血清中甲狀腺素、促甲狀腺激素受體抗體有回調(diào)作用，且高劑量組最顯著。本研究以前期實(shí)驗(yàn)的高劑量組作為給藥組，選取網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所預(yù)測(cè)抑制血管新生方面的機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證[8]。

1.2.7 動(dòng)物分組與給藥 選取6 周齡SPF 級(jí)體重（20±2）g的雌性BALB/c 小鼠40 只，其中10 只設(shè)為正常對(duì)照組，其余30 只應(yīng)用重組腺病毒Ad-TSHR-289 于小鼠脛前肌注射免疫構(gòu)建GD 模型，免疫劑量為1.878×109PFU/60 μl，于1、4、7 周共免疫3 次[11-12]。第10 周采用隨機(jī)數(shù)字表法將造模成功的小鼠分為GD 模型組、甲巰咪唑組、芪玄抑甲寧組，每組8 只。芪玄抑甲寧組灌胃芪玄抑甲寧50 g/kg，甲巰咪唑組灌胃甲巰咪唑片3.75 mg/kg，正常對(duì)照組、GD 模型組灌胃同體積的飲用水，1 次/d，連續(xù)4 周。

1.2.8 芪玄抑甲寧對(duì)四組血清VEGF 的影響 給藥4 周后，將四組以0.3%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）進(jìn)行麻醉，于各組頜下靜脈叢采取靜脈血，取上清后采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)四組血清中VEGF 含量，具體操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，并經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)時(shí)的光密度值。

1.2.9 芪玄抑甲寧對(duì)GD 小鼠甲狀腺組織PECAM-1 的影響 對(duì)四組甲狀腺組織采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PECAM-1 水平，PECAM-1 水平可反映微血管密度。按照石蠟切片免疫組化法將四組甲狀腺組織制成中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察染色情況，依照Weidner 標(biāo)準(zhǔn)，每張隨機(jī)選取5 個(gè)不重疊、不相鄰的視野，400 倍鏡下觀察，計(jì)算每個(gè)視野的PECAM-1 水平[13]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 7 對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，比較采用t 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪玄抑甲寧活性成分及其靶點(diǎn)

共獲得芪玄抑甲寧的活性成分63 種，靶點(diǎn)281 個(gè)。見(jiàn)圖1。

圖1 芪玄抑甲寧活性成分相關(guān)信息

2.2 GD 相關(guān)靶點(diǎn)及PPI 網(wǎng)絡(luò)與核心靶點(diǎn)

共獲得GD 相關(guān)靶點(diǎn)1 489 個(gè)，芪玄抑甲寧與GD共有靶點(diǎn)為124 個(gè)，見(jiàn)圖2。PPI 獲得111 個(gè)潛在靶點(diǎn)，其中核心靶點(diǎn)有信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、VEGFA 等21 個(gè)，見(jiàn)圖3。

圖2 芪玄抑甲寧相關(guān)靶點(diǎn)與格雷夫斯病相關(guān)靶點(diǎn)維恩圖

圖3 芪玄抑甲寧與格雷夫斯病共有靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

2.3 芪玄抑甲寧-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)及核心成分

篩選與潛在靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的活性成分，將其與5 味中藥及靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 軟件得到“芪玄抑甲寧-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，經(jīng)篩選得到槲皮素、山柰酚、木犀草素、熊果酸、β-谷甾醇等18 種核心成分。見(jiàn)圖4。

圖4 芪玄抑甲寧-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

2.4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

GO 富集分析獲得炎癥反應(yīng)、血管新生、血管形態(tài)發(fā)生、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)活性等954 項(xiàng)，見(jiàn)圖5。KEGG富集分析獲得MAPK、PI3K/Akt、IL-17、VEGF 等92 條信號(hào)通路，見(jiàn)圖6。

圖5 芪玄抑甲寧治療格雷夫斯病核心靶點(diǎn)的GO 富集分析

圖6 芪玄抑甲寧治療格雷夫斯病核心靶點(diǎn)的KEGG富集分析

2.5 四組血清VEGF 水平比較

GD 模型組血清VEGF 水平高于正常對(duì)照組，且芪玄抑甲寧組VEGF 水平低于GD 模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖7。

圖7 四組血清VEGF 水平比較

2.6 四組甲狀腺組織的PECAM-1 水平比較

GD 模型組血清PECAM-1 水平高于正常對(duì)照組，且芪玄抑甲寧組PECAM-1 水平低于GD 模型組，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)圖8。

圖8 四組甲狀腺組織的PECAM-1 水平比較

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從多維角度預(yù)測(cè)中藥及復(fù)方與疾病之間的相互作用關(guān)系，從而預(yù)測(cè)藥物治療疾病的作用機(jī)制，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于中醫(yī)藥前中期研究工作中[14-15]。本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建了PPI 網(wǎng)絡(luò)、“芪玄抑甲寧-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)、GO 和KEGG 富集分析，將核心成分、核心靶點(diǎn)、功能和信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)整合，揭示了芪玄抑甲寧治療GD 的作用機(jī)制主要集中在以下兩個(gè)方面。

血管新生方面，抑制甲狀腺血管新生可以縮小GD 甲狀腺體積、降低甲狀腺激素水平[16]。核心成分山柰酚能抑制血管新生，用于包括癌癥在內(nèi)的許多嚴(yán)重疾病[17]，其通過(guò)靶向VEGF 受體2 調(diào)控VEGF 刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中的MAPK 和PI3K/AKT 信號(hào)通路來(lái)抑制血管新生[18-19]。同時(shí)，核心成分槲皮素、熊果酸也具有抑制血管新生的作用[20]。提示芪玄抑甲寧可能通過(guò)山柰酚、槲皮素、熊果酸等成分調(diào)控VEGF受體2、MAPK 和PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制甲狀腺的血管新生。本研究通過(guò)檢測(cè)VEGF、PECAM-1 的表達(dá)情況，提示芪玄抑甲寧可能通過(guò)降低GD 小鼠的VEGF水平，抑制甲狀腺血管翳的新生來(lái)治療GD。

甲狀腺功能方面，GD 以甲狀腺?gòu)浡阅[大和分泌功能亢進(jìn)為主要特征[21]。其核心成分槲皮素能顯著降低高脂膳食小鼠血清甲狀腺素水平，通過(guò)MAPK、甲狀腺激素合成通路預(yù)防和逆轉(zhuǎn)甲狀腺激素代謝紊亂[22-23]；山柰酚作為競(jìng)爭(zhēng)性甲狀腺過(guò)氧化物酶抑制劑[24]，可抑制甲狀腺激素的合成。有研究顯示，富含山柰酚和槲皮素的海藻石莼提取物可顯著降低甲亢大鼠血清T3、T4和促炎性細(xì)胞因子的水平[25]。提示芪玄抑甲寧可能通過(guò)山柰酚和槲皮素等成分調(diào)控MAPK信號(hào)通路或抑制甲狀腺激素的合成，從而減輕甲狀腺功能亢進(jìn)的癥狀。

綜上所述，本研究所得核心成分、靶點(diǎn)及信號(hào)通路與GD 的治療密切相關(guān)，發(fā)現(xiàn)了槲皮素、山柰酚、熊果酸等潛在活性成分，以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1、VEGFA 等核心靶點(diǎn)，提示芪玄抑甲寧可能通過(guò)調(diào)控MAPK、PI3K/AKT 和VEGF等信號(hào)通路產(chǎn)生抑制血管新生等作用治療GD。然而芪玄抑甲寧治療GD 的作用機(jī)制仍需大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行闡明，本研究結(jié)果可為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。