邸 學,曲浩源,王海波,裴帥龍,魯茂盛

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

傳統(tǒng)的天然抗氧化活性產(chǎn)物研究，一般是通過一系列的成分分離和和純化技術(shù)得到提取物或單體成分，再進行體內(nèi)或體外活性測定，因此，研究周期長、效率低，又較為盲目，而且不利于性質(zhì)不穩(wěn)定化合物的抗氧化活性發(fā)現(xiàn)[6-7]。HPLC-DPPH在線篩選抗氧化成分，是將色譜柱分離后的樣品溶液與DPPH 溶液混合，反應后流入檢測器進行檢測，抗氧化活性化合物與DPPH反應，使其吸收減弱從而形成倒峰；通過對比樣品HPLC色譜圖和DPPH自由基清除反應后HPLC圖譜，即可進行不同成分抗氧化活性的在線分析[8-9]。該方法能夠直觀反映混合樣品中不同成分清除自由基能力，實現(xiàn)混合樣品中不同成分分離和抗氧化活性的同步測定，具有高效、原位、簡捷、快速等優(yōu)勢，近年來已逐漸應用于天然抗氧化活性成分的篩選分析。

遠志的皂苷、多糖、黃酮等組分的抗氧化活性已有相關(guān)研究，但其中的糖酯類活性成分的抗氧化活性的研究報道較少。本試驗研究通過HPLC-DPPH法在線分析、全面篩選遠志的抗氧化活性成分，并采用對照樣品對照量化其抗氧化活性的效應，方法操作簡便、高效，為遠志的藥效活性物質(zhì)成分研究提供支持。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1100液相色譜儀；Boltimate C18色譜柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱后反應器(0.25 mm×20 m，儀佳科技有限公司)；RPL-D2000 柱溫箱(大連日普利科技儀器有限公司)。

1.2 材料與試劑

2-聯(lián)苯基-1-苦基腈基(DPPH)、6-羥基-2,5,7,8-四甲基色烷-2-羧酸(Trolox)，均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇(色譜純)，購于天津市凱信化學工業(yè)有限公司；磷酸(色譜純)、乙腈(色譜純)，購于天津市光復科技發(fā)展有限公司；過硫酸鉀、L(+)-抗壞血酸，購于國藥集團化學試劑有限公司；西伯利亞遠志糖酯A6(SA6)、3,6’-二芥子?；崽?DSS)，購于成都普菲德生物技術(shù)有限公司；純凈水，購于杭州娃哈哈公司。遠志，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學許亮教授鑒定為遠志科遠志屬植物遠志(Polygala tenuifolia Willd.)的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

供試品溶液的制備：取遠志藥材適量，加8倍量水，煎煮提取2次，每次 2 h，合并提取液；減壓濃縮至 20 mg/mL，加甲醇稀釋至 10 mg/mL，微孔濾膜濾過，備用。

對照樣品溶液的制備：精密稱取DSS、SA6對照品適量，分別加入甲醇配制成質(zhì)量濃度為 0.1 mg/mL 的對照品溶液，備用。精密稱取Trolox對照樣品，加入甲醇分別配制成質(zhì)量濃度為 0.01 mg/mL 的對照樣品溶液，備用。

DPPH反應液的制備：精密稱取DPPH試劑適量，加入甲醇配制成質(zhì)量濃度為 10 μmol/L 的溶液，備用。

2.2 HPLC-DPPH法分析條件

分析試驗裝置及流程：參考文獻并優(yōu)化試驗裝置流程，試驗流路體系分別為樣品高效分離路徑(A)和DPPH自由基清除檢測系統(tǒng)路徑(B)。待測樣品由路徑A 經(jīng)液相色譜法分離后與DPPH自由基溶液經(jīng)三通連接管混合，進入規(guī)格為 0.25 mm×20 m 的反應器充分反應。再經(jīng)檢測器檢測獲得樣品反應后的色譜圖。分別以甲醇溶液、DPPH溶液或?qū)φ諛悠啡芤簽閷φ眨瑢Ρ确治鲞h志成分抗氧化活性。

遠志成分分析：色譜柱為Agilent C18柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)；柱溫 40 ℃；流速 0.25 mL/min；進樣量 5 μL；流動相為0.05%磷酸水(A)-0.05%磷酸乙腈(B)。梯度洗脫條件：0～5 min 8%～20%(B),10～32 min 26%～32%(B),35～42 min 55%～8%(B)。檢測波長為 320 nm。

HPLC-DPPH在線分析：為保證色譜分離效果和抗氧化活性試驗結(jié)果的準確性和靈敏度，對DPPH反應液濃度(5、10、20 μmol/L)、遠志洗脫液與DPPH溶液的體積比(2∶3、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5)、混合及反應時間(0.6、0.8、1.2 min)、反應溫度(25、30、40 ℃)等多種因素影響進行優(yōu)化，確定反應條件為DPPH反應液濃度為 10 μmol/L，流速為 1 mL/min，反應器規(guī)格為 0.25 mm×20 m，反應物的質(zhì)量比1∶4、反應時間 0.8 min，反應溫度 40 ℃，檢測波長是 517 nm。

2.3 遠志抗氧化活性成分在線篩選

取遠志供試品溶液，按2.2項進行遠志成分及抗氧化活性效應分析，結(jié)果見圖1。遠志樣品抗氧化活性效應分析圖上可觀察到8個倒峰出現(xiàn)，其中2、5號峰位置處倒峰強度較大，其他位置處倒峰強度較小。根據(jù)倒峰強度判斷，抗氧化活性最強成分為5號位置成分，2號位置成分次之，6號等其他位置處成分抗氧化活性較弱。

A.遠志樣品成分分析圖；B.遠志樣品-DPPH譜圖； C.Trolox-DPPH譜圖圖1 HPLC-DPPH在線分析色譜圖

2.4 遠志成分抗氧化活性強度分析

取對照品溶液按2.2項進行抗氧化活性測定。保留時間對照、外標法計算遠志中的DSS(5號)、SA6(2號)含量。再以SA6為對照，采用歸一化法計算抗氧化活性成分近似含量。采用倒峰的峰面積與成分含量的比值,衡量抗氧化活性的強度；再以Trolox活性為對照，計算遠志成分抗氧化活性效應比值，結(jié)果見表1。

表1 遠志成分抗氧化活性效應分析表

結(jié)果表明，采用對照樣品對照方法進行遠志成分抗氧化活性的半定量測定，量化分析不同成分的抗氧化活性的情況，發(fā)現(xiàn)遠志藥材中抗氧化活性排序為DSS、SA6。

3 結(jié)論與討論

本研究利用HPLC-DPPH在線分析法，進行遠志抗氧化活性成分篩選研究，能夠快速實現(xiàn)遠志中DSS與SA6等抗氧化活性成分的篩選。方法簡捷、高效，能夠快速篩選復雜中藥樣品的藥效活性成分。

遠志藥材化學成分種類復雜，成分眾多，對色譜分離條件要求較高。進行遠志藥材質(zhì)量評價時，需要應用全面、準確的多成分共同測定方法，綜合考慮色譜柱載樣量、色譜分離效果和分析周期等多種因素，最后篩選確定分析條件。

本研究表明，遠志主要抗氧化活性成分3,6’-二芥子?；崽?、西伯利亞遠志糖酯A6，也是遠志主要藥效活性組分[10-12]。對遠志藥材中各成分抗氧化活性的全面評價，有助于更準確分析遠志藥材多種藥效成分之間的藥效作用關(guān)聯(lián)機制，為遠志的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供研究支持。