劉夫仁，賽 罕，賀 偉，張正一，馮中華，張梓琪，鮑偉東

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100083；2.山東省棗莊市山亭區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山亭，277200；3.內(nèi)蒙古賽罕烏拉國家級自然保護(hù)區(qū)管理局，大板，025150；4.赤峰市森林草原保護(hù)發(fā)展中心，赤峰，024005；5.赤峰市野生動植物保護(hù)協(xié)會，赤峰，024005）

動物體內(nèi)腸道中有數(shù)以萬億計(jì)的菌群，不同季節(jié)、飲食和棲息地的變化都會導(dǎo)致腸道菌群組成發(fā)生變化，達(dá)到動態(tài)平衡［1-3］。腸道菌群與宿主存在相互影響，在不同物種之間腸道菌群也會發(fā)揮不同作用，如食草動物糞便中分離出的菌株多具有纖維素分解功能，而從食肉動物糞樣中分離出的菌株多具有分解脂肪的功能，同時腸道菌群也會反作用于宿主本身，促進(jìn)物種對棲息地、食性的選擇［4］。Li 等［5］的研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群還可以擴(kuò)大動物的食物生態(tài)位，某些植物為防止被動物取食，會合成一些次生化合物，而動物腸道菌群則可以消化這些化合物。

食性是影響野生動物腸道菌群的重要因素，不同的食物組成會影響宿主腸道菌群的多樣性及其群落結(jié)構(gòu)，可以反映物種對環(huán)境的適應(yīng)程度。在雌雄性坡鹿（Rucervus eldii）的研究中發(fā)現(xiàn)，不同性別之間腸道菌群組成無明顯差異，但菌群豐度存在差異，這種結(jié)果主要是由食物不同造成的［6］。對野生和圈養(yǎng)林麝（Moschus berezovskii）腸道菌群的研究發(fā)現(xiàn)，野生個體和圈養(yǎng)個體腸道群落存在顯著差別，圈養(yǎng)林麝擁有更高豐度的變形菌門（Proteobacteria）［7］。

馬鹿（Cervus elaphus）生活于范圍較大的針闊混交林、林緣或靠近水源的林地，是國家二級重點(diǎn)保護(hù)野生動物［8］。對于馬鹿的生態(tài)研究涵蓋了食性、家域、種群遺傳結(jié)構(gòu)和行為習(xí)性等多方面內(nèi)容［9-12］。阿拉善馬鹿（C.e.alashanicus）冬季腸道菌群以厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門為優(yōu)勢菌門，顯示菌群群落組成與食性密切相關(guān)［13］。不同性別東北馬鹿（C.e.xanthopygus）的冬季菌群多樣性無顯著差異［14］。在內(nèi)蒙古賽罕烏拉國家級自然保護(hù)區(qū)有蹄類動物中，馬鹿的種群數(shù)量較多［15］，其他有蹄類動物還包括野豬（Sus scrofa）、狍（Capreolus pygargus）和中華斑羚（Naemorhedus griseus）等［16］。近年來，隨著保護(hù)政策的落實(shí)，野生動物保護(hù)成效得到極大提升，各類動物種群密度增加，這導(dǎo)致不同物種在生態(tài)位中存在激烈競爭，了解不同物種的適應(yīng)對策，有助于改進(jìn)保護(hù)管理策略。本研究旨在分析保護(hù)區(qū)內(nèi)夏季馬鹿的腸道菌群多樣性及結(jié)構(gòu)，從食物資源利用和動物健康角度認(rèn)識馬鹿的適應(yīng)性，為后期開展同域分布的有蹄類物種資源利用及競爭研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時也為馬鹿的保護(hù)提供新視角。

1 研究方法

1.1 樣品采集

樣品采集于內(nèi)蒙古賽罕烏拉國家級自然保護(hù)區(qū)，該保護(hù)區(qū)位于內(nèi)蒙古自治區(qū)赤峰市巴林右旗北部（43°59'—44°27' N，118°18'—118°55' E），屬于大興安嶺南段山地，占地總面積10.04萬 hm2［17］。2020年7—8 月，在保護(hù)區(qū)正溝、大東溝和大西溝按照樣線法取馬鹿糞便樣品35份（圖1），樣線間距500 m左右，每條樣線只取1份樣品（10粒），記錄糞便樣品形狀、大小和位置信息，樣品放入收集管中倒入95%乙醇冷凍保存。

圖1 馬鹿腸道菌群多樣性分析糞樣采集點(diǎn)Fig.1 Pellets sampling sites for red deer gut microbiota diversity analysis

1.2 DNA提取及測序

使用E.Z.N.A 糞便DNA 提取試劑盒（Omega Bio-Tek）從糞便樣本中提取總DNA。使用腸道細(xì)菌通用引 物343F：5'-TACGGRAGGCAGCAG-3' 和798R：5'-AGGGTATCTAATCCT-3' 擴(kuò)增細(xì) 菌16S rRNA 基因V3—V4 高變區(qū)。通過PCR 反應(yīng)向16S rRNA 的產(chǎn)物末端加上帶有Index 的接頭，用于Illumina MiSeq 的NGS 測序。PCR 反應(yīng)體系為25.0 μL：模板DNA 20.0 ng，dNTPs 2.0 μL，引物各1.0 μL（10 μmol/L），TransStart Buffer 2.5 μL，TransStartTaqDNA 0.5 μL，用ddH2O 補(bǔ)足。PCR 反應(yīng)設(shè)置：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，24 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。通過Qubit 3.0熒光計(jì)檢測DNA 樣品的濃度，采用MetaVx文庫試劑盒構(gòu)建DNA文庫。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用QIIME 數(shù)據(jù)包分析16S rRNA 測序數(shù)據(jù)，使用UCHIME 去除嵌合序列，參考數(shù)據(jù)庫Silva 128 比對16S rRNA 序列，使用聚類程序Vsearch（1.9.6）將序列聚類為操作分類單位（OTU），序列相似性閾值設(shè)為97%。基于OTU 分析的結(jié)果，采用對樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽樣的方法，以QIIME軟件計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)（Chao1、Shannon和Simpson指數(shù)）以反映腸道微生物群落的物種豐度和多樣性，采取Good’s coverage 曲線用于評估測序結(jié)果的群落物種總數(shù)，判斷測序深度是否足夠。使用unweighted UniFrac 比較分析樣本間是否有顯著差異，基于Bray-Curtis 樣本間距離矩陣用于主坐標(biāo)分析（PCoA）可視化圖展示Beta多樣性，并進(jìn)行非度量多維尺度（NMDS）排序。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果

經(jīng)過對16S rRNA 基因測序數(shù)據(jù)分析，35份馬鹿樣品共獲得2 287 019 條有效序列，其中最大有效序列數(shù)為70 650，最小有效序列數(shù)為50 488，每個樣品平均獲得有效序列為65 343。對有效序列進(jìn)行聚類分析，OTU 平均數(shù)量為2 553，其中核心OTU 數(shù)量為169（圖2）。Good’s coverage 曲線顯示測序深度平均達(dá)到99%以上，說明測序深度足以充分反映樣本真實(shí)性，可以進(jìn)一步分析（圖3）。

圖2 馬鹿糞便樣品OTU的Venn圖Fig.2 Venn diagram of red deer fecal sample OTU

圖3 馬鹿糞便樣品Good’s coverage曲線Fig.3 Good’s coverage curve of red deer fecal samples

2.2 多樣性分析

Chao1指數(shù)在樣本序列達(dá)到20 000時，曲線趨于平緩，Chao1 最高值為4 358，最低值為2 648（圖4A）；Shannon 指數(shù)在樣本序列為4 000 時，曲線趨于平緩，最高值為9.9，最低值為6.3（圖4B）；Simpson指數(shù)在樣本序列達(dá)到2 300 時，曲線趨于平緩，最高值為0.99，最低值為0.96（圖4C）。結(jié)果表明，樣品的豐富度和多樣性都較高。

圖4 馬鹿腸道菌群Alpha多樣性Fig.4 Alpha diversity of red deer gut bacteria community

NMDS stress 數(shù)值小于0.2，除一份樣品（R25）可能存在測序深度不足外，其余樣本分布較均勻，個體無明顯差異（圖5A）。在PCoA 分析中，樣本分布較均勻，除R25 有明顯分隔，其余個體無明顯分離，種內(nèi)并無顯著差異（圖5B）。

圖5 馬鹿腸道菌群β多樣性Fig.5 Beta diversity of red deer gut bacteria community

2.3 群落結(jié)構(gòu)分析

通過對OTU 聚類注釋分析，35 份馬鹿糞便樣品中共獲得38 菌門、777 菌屬，用相對豐度描述腸道菌群的組成。在門水平，相對豐度之和＞95%的是擬桿菌門（29.55%）、變形菌門（29.30%）、厚壁菌門（29.30%）、放線菌門（Actinobacteria，5.78%）和芽單孢菌門（Gemmatimonadetes，1.99%），其余門水平的腸道菌群相對豐度較低（圖6）。

圖6 馬鹿腸道菌群門水平相對豐度Fig.6 Relative abundance of gut bacteria composition at the phylum level

在屬水平，取相對豐度前15的菌屬進(jìn)行作圖，其中豐度超過1%的菌屬共11種，分別是擬桿菌屬（Bacteroides，4.30%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae_UCG-005，3.34%）、埃希氏菌-志賀氏菌屬（Escherichia-Shigella，2.87%）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacter，2.62%）、毛螺菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group，2.43%）、瘤胃球菌屬（Ruminococcaceae_UCG-014，1.98%）、另枝菌屬（Alistipes，1.88%）、普雷沃菌屬（Prevotella_1，1.70%）、乳桿菌屬（Lactobacillus，1.52%）、鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas，1.23%）（圖7）。

圖7 馬鹿腸道菌群屬水平相對豐度Fig.7 Relative abundance of gut bacteria composition at the genus level

3 討論

隨著第三代測序技術(shù)愈發(fā)成熟，高通量測序技術(shù)成為研究動物腸道微生物的重要技術(shù)手段，如在大熊貓（Ailuropoda melanoleuca）［18］、黑 犀（Diceros bicornis）［19］、駝鹿（Alces alces）［20］和川金絲猴（Rhinopithecus roxellana）［21］等腸道微生物研究中均使用該技術(shù)進(jìn)行測序分析。在駝鹿［20］、東北馬鹿［22］和牦牛（Bos grunniens）［23］等動物腸道中，厚壁菌門和擬桿菌門都是優(yōu)勢菌門；在大熊貓［24］、野豬［25］中變形菌門是優(yōu)勢菌門。可見，不同物種之間腸道微生物存在差異，這與物種棲息地、食性、年齡、性別甚至季節(jié)都有很大關(guān)系。

本研究探究了夏季賽罕烏拉馬鹿腸道微生物的多樣性，除1 份樣品可能存在測序深度不足外，其余樣品中厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門是主要優(yōu)勢菌門，這與賀蘭山馬鹿夏季腸道微生物的研究結(jié)果［26］類似，但菌群豐度存在一定差距，賽罕烏拉馬鹿的變形菌門和擬桿菌門的豐度大于賀蘭山馬鹿，厚壁菌門則較低。在一些有蹄類動物腸道微生物研究中，往往都是厚壁菌門占優(yōu)勢，擬桿菌門次之，變形菌門和其余菌門豐度較小，這可能與菌群在體內(nèi)發(fā)揮的作用不同有關(guān)。厚壁菌門在動物體內(nèi)往往起到降解纖維、促進(jìn)消化與吸收的作用，同時厚壁菌門會促進(jìn)脂肪積累和動物體重增加，但厚壁菌門中的鏈球菌會引起猩紅熱、膿皰病等［27］；擬桿菌門同樣可以促進(jìn)食物的消化與吸收，其主要對蛋白質(zhì)及碳水化合物發(fā)揮作用，在消化方面往往與厚壁菌門達(dá)到協(xié)同作用，同時擬桿菌門也會感染宿主出現(xiàn)炎癥，如腹瀉或膿腫［28］；變形菌門被認(rèn)為是體內(nèi)的危險因素，當(dāng)其豐度劇烈變化時往往會伴隨疾病的發(fā)生［29］，可見變形菌門是體內(nèi)腸道微生物健康與否的預(yù)警者，在個體尚未出現(xiàn)明顯癥狀時動物體內(nèi)的變形菌群豐度就已經(jīng)快速上升，食性、環(huán)境改變也會使得個體的變形菌門快速響應(yīng)［30］。本研究中的菌群構(gòu)成與李俊樂［26］的冬、夏季馬鹿研究結(jié)果相對比，變形菌門、酸桿菌門和志賀氏菌的豐度偏高，可能與賽罕烏拉保護(hù)區(qū)馬鹿感染腸炎等有關(guān)。出現(xiàn)腸炎的小鼠變形菌門豐度明顯高于正常小鼠，肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）和奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）等會導(dǎo)致小鼠體內(nèi)發(fā)生不恰當(dāng)?shù)拿庖叻磻?yīng)，造成局部炎癥［31］。田麗［32］在對炎癥性腸病研究中也證實(shí)，炎癥個體腸道菌群變形菌門、Epsilonbacteraeota 和酸桿菌門豐度升高，厚壁菌門和擬桿菌門豐度明顯降低。在腸炎小鼠與正常小鼠腸道菌群研究中，在屬水平上普雷沃菌屬、埃希氏菌-志賀氏菌屬和檸檬酸桿菌屬腸炎組豐度增加，與正常組小鼠有顯著區(qū)別［30］。檸檬酸桿菌中許多血清變型的抗原與埃希氏菌-志賀氏菌屬的抗原有關(guān)，而普雷沃菌屬也是常見的條件致病菌，由其介導(dǎo)的黏膜炎癥可能會影響全身疾?。?3］；毛螺菌屬和另枝菌屬有促進(jìn)腸黏膜修復(fù)的功能［34］。因此，賽罕烏拉保護(hù)區(qū)馬鹿或許存在腸道疾病風(fēng)險，具體原因還需進(jìn)一步研究，但在以后保護(hù)策略制定中應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。

本研究中馬鹿個體腸道微生物之間分散均勻，無明顯差別，這可能是食物影響造成不同個體腸道微生物趨同。在大熊貓的腸道微生物研究中發(fā)現(xiàn)，獨(dú)特的食性使得大熊貓腸道微生物產(chǎn)生適應(yīng)，食物的改變會使得菌群隨之變化［35］；在圈養(yǎng)馬麝（Moschus chrysogaster sifanicus）和野生馬麝的研究中也推測食物是造成腸道菌群差異的主要因素，圈養(yǎng)個體的變形菌門和擬桿菌門豐度都高于野生個體［36］；有趣的是，駝鹿在夏季取食林間邊緣草本植物和沼澤旁的水生植物時，體內(nèi)的腸道菌群會受到取食地所處環(huán)境的影響［20］，顯示來自環(huán)境微生物的效應(yīng)。本研究與此前對赤峰地區(qū)東北馬鹿冬季腸道微生物多樣性研究在群落豐度［14］上有明顯區(qū)別，冬季時厚壁菌門豐度（79.43%）遠(yuǎn)大于本研究的夏季（29.30%），而擬桿菌門（冬季16.64%，夏季29.55%）和變形菌門（冬季0.40%，夏季29.30%）豐度明顯減少，冬季的馬鹿食物多是高纖維的木本植物，需要更多厚壁菌門參與高纖維的消化與吸收，為馬鹿活動提供能量；夏季時馬鹿取食植物多為草本植物，主要采食嫩芽、嫩葉等，因此擬桿菌門豐度更高。在阿拉善馬鹿冬、夏腸道菌群結(jié)構(gòu)研究中發(fā)現(xiàn)，季節(jié)對馬鹿腸道菌群有重要影響，但發(fā)揮主要作用的還是食物［26］。以上研究都說明食物是動物腸道微生物群落進(jìn)化的主要驅(qū)動力，腸道微生物構(gòu)成反映了食物變化對動物的影響。為更加深入了解季節(jié)變化對本區(qū)域馬鹿的影響以及動物的適應(yīng)，建議后期開展不同季節(jié)和食物組成的對比研究，從而為提高馬鹿保護(hù)管理成效提供充分的基礎(chǔ)信息。