趙聰聰,王碭碭,王 菁,李 永,姚軍虎,曹陽(yáng)春

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

隨著奶牛養(yǎng)殖集約化程度的提高，全混合日糧(TMR)的使用越來(lái)越普遍[1]，同時(shí)，由于奶牛品種的選種選育，奶牛的產(chǎn)奶量迅速提升。我國(guó)優(yōu)質(zhì)粗飼料缺乏，為了滿足奶牛能量的需要，往往采用高精料日糧[2]。但是高精料日糧的使用會(huì)引起反芻動(dòng)物急性或亞急性瘤胃酸中毒(SARA)，影響機(jī)體健康[3-5]，同時(shí)持續(xù)性的瘤胃酸中毒會(huì)引發(fā)反芻動(dòng)物肢蹄病，減少動(dòng)物使用年限[2]。在美國(guó)，大約有19%的泌乳早期奶牛和26%的泌乳中期奶?；加蠸ARA[6]。在德國(guó)和荷蘭，約11%的泌乳早期奶牛和18%的泌乳中期奶牛患此病[7]。因此，動(dòng)物的生產(chǎn)性能和健康似乎成為了不可調(diào)和的矛盾。

奶牛日糧中NDF水平在很大程度上影響瘤胃健康，同時(shí)，飼料的物理特性在很大程度上影響動(dòng)物的咀嚼與反芻時(shí)間，進(jìn)而影響瘤胃pH[8-9]。因此，為了避免SARA在高產(chǎn)奶牛中的發(fā)生，NRC指出，如果以玉米青貯和苜蓿青貯為粗飼料的主要來(lái)源，則奶牛日糧中中性洗滌纖維(NDF)含量不應(yīng)低于25%[10]。但是有研究發(fā)現(xiàn)，即使NDF含量滿足要求，牛也可能出現(xiàn)跛行現(xiàn)象[2]，這說(shuō)明僅NDF不足以評(píng)估反芻動(dòng)物的日糧品質(zhì)以及動(dòng)物健康。

Mertens[11]提出了物理有效中性洗滌纖維(peNDF)的概念，即因飼料長(zhǎng)度、粒徑、韌性等物理特性引起動(dòng)物反芻、咀嚼等生理活動(dòng)及影響瘤胃內(nèi)容物兩相性質(zhì)的那部分NDF，其在數(shù)值上等于NDF含量與物理有效因子(pef)的乘積(pef是用來(lái)衡量不同種類(lèi)粗飼料及不同長(zhǎng)度的相對(duì)物理有效性)[12]。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著日糧中peNDF與瘤胃可降解淀粉比例的降低，瘤胃pH低于5.8和5.6的時(shí)間呈線性增加，乙酸摩爾比下降，而丙酸摩爾比增加。Li等[4]的另一項(xiàng)試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，降低日糧中peNDF8.0含量(從20.5降低到8.4)可以提高山羊瘤胃總VFA的量，增加琥珀酸纖維桿菌和黃色瘤胃球菌的相對(duì)豐度。表明改變?nèi)占ZpeNDF水平可能會(huì)影響瘤胃發(fā)酵，同時(shí)影響瘤胃細(xì)菌的組成。

因此本試驗(yàn)在高精料日糧的背景下，通過(guò)改變TMR的攪拌時(shí)間，獲得不同peNDF水平的日糧，利用高通量測(cè)序技術(shù)探究不同peNDF水平日糧對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌組成的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)日糧 本試驗(yàn)日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。通過(guò)調(diào)整TMR的攪拌時(shí)間(10、18和60 min)制成3種不同peNDF8.0日糧：高(11.25%)、中(10.56%)和低(9.02%)peNDF8.0(表2)。

表1 日糧組成與營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

表2 不同攪拌時(shí)間TMR日糧粒度分布

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取12頭、2胎次的荷斯坦奶牛(產(chǎn)奶量為33.0±1.7 kg/d、泌乳天數(shù)131±8 d)隨機(jī)分為3組，分別飼喂高(11.25%)、中(10.56%)和低(9.02%)水平的peNDF8.0日糧。試驗(yàn)期為25 d，其中預(yù)試期21 d，正試期4 d。每天于8:00和15:00飼喂兩次，自由飲水。

1.1.3 樣品采集 在試驗(yàn)第22-24天連續(xù)3 d采集TMR樣品，使用賓夕法尼亞篩(PSPS)進(jìn)行pef測(cè)定[14-15]。將3天的樣品等比例混樣后進(jìn)行化學(xué)成分分析。試驗(yàn)期最后一天晨飼前通過(guò)瘤胃穿刺法采集瘤胃液進(jìn)行細(xì)菌多樣性測(cè)序。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 使用QIAamp DNA Stool試劑盒進(jìn)行DNA提取，并用NanoDrop2000進(jìn)行DNA濃度和純度檢測(cè)。

1.2.2 細(xì)菌16S rRNA的高通量測(cè)序 使用正向引物：5'-AYTGGGYDTAAAGNG-3'和反向引物：5'-TACNVGGGTATCTAATCC-3'對(duì)細(xì)菌V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為25 μL，包括2 μL的DNA模板，每種引物1 μL(10uM)，2 μL的dNTP(2.5 mM)，5 μL 5×Q5緩沖液，5 μL 5×Q5 GC增強(qiáng)劑以及0.25 μL Q5高保真DNA聚合酶(5 U/μL)。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并使用QIAGEN凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產(chǎn)物。擴(kuò)增構(gòu)建Miseq文庫(kù)并采用Illumina Miseq(Illumina，USA)上機(jī)測(cè)序。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 運(yùn)用Qimme進(jìn)行序列過(guò)濾[16]，運(yùn)用Mothur去除嵌合體[17]。將獲得的優(yōu)質(zhì)序列以97%的相似度進(jìn)行聚類(lèi)，最長(zhǎng)的被指定為操作分類(lèi)學(xué)單位(OTU)，調(diào)用BLAST[18]的方法對(duì)序列與Greengene數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)[19]，獲得每個(gè)OTU的分類(lèi)學(xué)信息。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)單整理，采用SPSS 21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，LSD法多重比較。P<0.05表示差異顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 基本信息統(tǒng)計(jì)及稀釋曲線

12份瘤胃液樣品共獲得868 623條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣品有72 385條序列，共計(jì)15 631個(gè)OTU。從稀釋曲線來(lái)看，隨著樣本測(cè)序深度增加，曲線越趨于平穩(wěn)，說(shuō)明測(cè)序量足夠(圖1)。

圖1 樣本稀釋曲線

2.2 Alpha多樣性指數(shù)分析

Alpha多樣性用于反映微生物群落的多樣性和豐富度，本試驗(yàn)采用Chao1和ACE指數(shù)反映群落豐富度，Shannon和Simpson指數(shù)反映群落多樣性。由表3可知，低peNDF8.0日糧組的菌群豐富度指數(shù)ACE有低于其它兩組的趨勢(shì)(P<0.10)，其余多樣性指數(shù)在3組間無(wú)顯著差異。

表3 不同peNDF8.0 水平日糧對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌α多樣性的影響

2.3 不同分類(lèi)水平的群落組成分析

在門(mén)水平上，共鑒定出了22個(gè)門(mén) (圖2)。其中擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，80.79%～87.37%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes，8.40%～10.27%)、變形菌門(mén)(Proteobacteria，2.24%～6.63%)為3組間共有優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其余菌門(mén)的相對(duì)豐度均小于1%。隨著日糧peNDF8.0水平的降低，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度減少，而厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)相對(duì)豐度增加。

圖2 門(mén)水平組成柱狀圖

由表4可知，普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、S24-7在3組中相對(duì)豐度都大于1%，為共有優(yōu)勢(shì)菌科。此外，BS11在高peNDF8.0組和中peNDF8.0組中相對(duì)豐度高于1%，為優(yōu)勢(shì)菌科，且顯著高于低peNDF8.0組(P<0.05)。

表4 不同peNDF8.0 水平日糧對(duì)奶牛瘤胃細(xì)菌科、屬水平的影響(TOP 15)

3組間唯一共有優(yōu)勢(shì)菌屬為普雷沃氏菌屬(Prevotella)，其相對(duì)豐度高達(dá)62.9%以上，遠(yuǎn)高于其它屬。中peNDF8.0組丁酸弧菌屬豐度高于1%，其余各屬豐度均小于1%，且各組間差異不顯著。與纖維消化相關(guān)的2個(gè)屬的(瘤胃球菌屬Ruminococcus，纖維桿菌屬Fibrobacter)相對(duì)豐度也低于1%。

3 討 論

哺乳動(dòng)物腸道中微生物組成受多種因素的影響，其中日糧的影響最為直接。Sonnenburg[20]研究發(fā)現(xiàn)高纖維日糧能夠增加微生物菌群多樣性。張紅濤[21]發(fā)現(xiàn)，隨著日糧NDF水平的升高，瘤胃細(xì)菌豐富度和多樣性都顯著上升。這些結(jié)果都表明日糧纖維的含量能夠顯著影響腸道微生物菌群，且菌群多樣性隨纖維含量的升高而升高。本試驗(yàn)日糧NDF的含量是一致的，由于攪拌時(shí)間的不同，使得日糧纖維的物理有效性發(fā)生改變。隨著日糧peNDF8.0水平的降低，瘤胃細(xì)菌豐富度有下降的趨勢(shì)。因此推測(cè)日糧纖維的長(zhǎng)度對(duì)微生物組成也有調(diào)控作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)為瘤胃中絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，但其比例隨日糧精粗比的改變而適當(dāng)變化[22]。當(dāng)日糧纖維含量從88.0%下降到57.5%時(shí)，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度大幅下降，而擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度大幅上升[22]。楊碩[23]的試驗(yàn)結(jié)果表明，補(bǔ)飼精料的青年絨山羊瘤胃中擬桿菌門(mén)的豐度升高，厚壁菌門(mén)降低。這可能是因?yàn)楹癖诰T(mén)包含很多具有纖維降解功能的微生物[24-25]。本試驗(yàn)使用高精料日糧，擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度遠(yuǎn)高于厚壁菌門(mén)，與前人研究結(jié)果一致。普雷沃氏菌屬為本試驗(yàn)中優(yōu)勢(shì)菌屬，這與奶牛[26-27]，綿羊[28]和肉牛[29]的研究結(jié)果一致。普雷沃菌屬在泌乳奶牛瘤胃中相對(duì)豐度可高達(dá)50%[23]，可能與普雷沃氏菌在瘤胃中參與廣泛的物質(zhì)代謝有關(guān)。有研究表明，普雷沃氏菌屬可參與淀粉的消化和利用、半纖維素和果膠的消化以及蛋白質(zhì)或肽的代謝[30]。

隨著日糧peNDF8.0降低，BS11科的相對(duì)豐度顯著下降。有研究發(fā)現(xiàn)，幼齡湖羊補(bǔ)飼開(kāi)食料后瘤胃中BS11相對(duì)豐度顯著升高[31]。同時(shí)，Solden等[32]發(fā)現(xiàn)提高日糧半纖維素和木質(zhì)素含量，可使BS11的含量大大增加。說(shuō)明BS11科很可能具有纖維降解功能，且對(duì)日糧纖維含量和有效性敏感。

Zhao等[33]的研究表明，隨著日糧peNDF增加，動(dòng)物反芻和總咀嚼的時(shí)間呈線性增加，且瘤胃pH低于5.8的時(shí)間呈線性減少。Cao等[34]的研究也表明，增加黑麥草顆粒長(zhǎng)度可以提高瘤胃的平均pH，降低瘤胃pH低于6.0的時(shí)間。說(shuō)明日糧的物理有效性能夠顯著影響動(dòng)物的反芻行為，進(jìn)而影響唾液分泌量，從而影響瘤胃pH。而瘤胃微生物有其最適的酸堿度，pH過(guò)低時(shí)往往對(duì)纖維降解菌不利。本試驗(yàn)基于現(xiàn)代化牧場(chǎng)高精料日糧的背景，通過(guò)減少TMR攪拌時(shí)間，適度增加纖維的物理有效性來(lái)探究對(duì)瘤胃微生物的影響。發(fā)現(xiàn)3種peNDF8.0日糧處理下，僅觀測(cè)到BS11科差異顯著。這表明日糧纖維的物理有效性也通過(guò)某種機(jī)制會(huì)對(duì)瘤胃微生物產(chǎn)生影響。但由于本試驗(yàn)3種日糧peNDF8.0差異較小，僅對(duì)物理有效性最為敏感BS11產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

在高精料日糧下，peNDF8.0水平從9.02%上升至11.25%使得奶牛瘤胃細(xì)菌豐富度有上升的趨勢(shì)，且BS11菌科隨peNDF8.0水平的上升顯著提高，說(shuō)明日糧的物理有效性能夠?qū)α鑫肝⑸锝M成和豐度產(chǎn)生影響。造成本試驗(yàn)結(jié)果差異不顯著的原因可能是日糧精料含量過(guò)高，且3種日糧peNDF8.0水平差異不是很大。由此推測(cè)適當(dāng)下調(diào)精料比例或者增加日糧纖維的物理有效性能夠改變瘤胃微生物組成，進(jìn)而可能實(shí)現(xiàn)反芻動(dòng)物的健康高產(chǎn)。