李彬 劉江文 王鳳媛 文英 蔣學(xué)俊

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心內(nèi)科 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430060)

膿毒癥是臨床上一種常見的全身性疾病，極易進(jìn)展為多器官衰竭，進(jìn)而導(dǎo)致患者死亡[1-2]。其中，膿毒癥引發(fā)的以左心室擴(kuò)張和左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)降低為特征的心肌損傷在膿毒癥并發(fā)癥中最為常見，是導(dǎo)致患者死亡的重要原因[3]。目前臨床缺乏有效的特異性治療方法。因此，尋求新的治療方案以減輕膿毒癥引發(fā)的心肌損傷是目前臨床亟待解決的問題。新近研究[4]顯示，作為三羧酸循環(huán)代謝物的衣康酸在活化的巨噬細(xì)胞中高度誘導(dǎo)，可顯著抑制炎癥反應(yīng)。其作用機(jī)制主要是使Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1的半胱氨酸殘基151、257、288、273和297烷基化，并阻止它與核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2)結(jié)合，使Nrf2易位到細(xì)胞核，上調(diào)下游抗氧化反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制氧化應(yīng)激[5]，同時4-辛基衣康酸(4-octyl itaconate，4-OI)還可抑制p65的磷酸化以及pp65的入核[6]。4-OI是一種細(xì)胞通透性衣康酸衍生物，具備潛在的減輕膿毒癥引發(fā)的心肌損傷的應(yīng)用價值，但尚無研究證實(shí)。因此，本研究擬探究4-OI對脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的心肌損傷的影響，以評估4-OI在膿毒癥引發(fā)的心肌損傷方面的治療價值。

1 材料和方法

1.1 動物與分組

6～8周雄性C57BL/6J小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于武漢大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，無特定病原體條件下，隨機(jī)分為3組。Control組(n=10)：腹腔注射等量生理鹽水連續(xù)3 d；LPS組(n=10)：腹腔注射等量生理鹽水3 d后，腹腔注射LPS(10 mg/kg)，構(gòu)建LPS誘導(dǎo)的膿毒癥造成的心肌損傷模型；4-OI組(n=10)：腹腔注射4-OI(25 mg/kg)連續(xù)處理3 d后，腹腔注射LPS(10 mg/kg)。

1.2 藥品與試劑

4-OI和LPS購自sigma公司，p65、pp65、谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4，GPx4)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(prostaglandin endoperoxide synthase 2，PTGS2)、Nrf2和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗體購自Cell Signaling Technology公司。

1.3 超聲心動圖檢查

用1%戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉小鼠，胸部備皮后固定，使用飛依諾公司的VINNO6超聲儀描記M型心臟超聲圖像，測量LVEF、左心室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening，LVFS)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd)和左心室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end-systolic diameter，LVESd)，以評估左心室的結(jié)構(gòu)及功能[7]。

1.4 蘇木精-伊紅染色

用1%戊巴比妥鈉腹腔注射(90 mg/kg)安樂死處死小鼠，迅速開胸摘取心臟，4%多聚甲醛中4 ℃固定過夜。石蠟包埋，6 μm切片后行蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Western blot檢測

分離小鼠左心室心肌組織并冷凍在液氮中，用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒定量蛋白濃度并用RIPA裂解液調(diào)整至同一濃度，后加入5X上樣緩沖液，混勻并100 ℃加熱10 min。采用SDS-PAGE電泳分離40 μg蛋白質(zhì)，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，然后與特定一抗工作液4 ℃孵育過夜[p65 1：1 000、pp65 1：1 000、GPx4 1：1 000、PTGS2 1：1 000、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)1：1 000、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)1：1 000和GAPDH 1：1 500]。洗膜后，二抗工作液室溫孵育1 h，使用ECL試劑盒激發(fā)化學(xué)發(fā)光信號，并用ImageLabTM軟件檢測。以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行灰度分析。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。使用GraphPad Prism 9軟件，采用單因素方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動圖檢查結(jié)果

心臟超聲檢查結(jié)果顯示(圖1E和表1)，與Control組相比，LPS組LVEF[(41.65±4.49)% vs(80.32±2.43)%，P<0.001]和LVFS[(17.16±2.92)% vs(41.84±2.31)%，P<0.001]顯著降低，LVESd[(3.05±0.16)mm vs(2.17±0.12)mm，P<0.001]顯著增加。與LPS組相比，4-OI組LVEF[(60.93±4.26)% vs(41.65±4.49)%，P<0.001]和LVFS[(28.89±2.64)% vs(17.16±2.92)%，P<0.001]得以保留，LVESd[(2.50±0.12)mm vs(3.05±0.16)mm，P<0.001]明顯縮小(圖1A、圖1B和圖1C)。三組之間LVEDd無顯著性差異(圖1D)。

表1 三組小鼠超聲心功能比較

注：****表示P<0.001，ns表示P>0.05。

2.2 病理學(xué)檢查結(jié)果

HE染色顯示，與Control組相比，LPS組小鼠心臟表現(xiàn)出明顯的炎癥細(xì)胞浸潤以及心肌細(xì)胞排列疏松，該表現(xiàn)類似于膿毒癥誘導(dǎo)的心肌損傷的病理特點(diǎn)。與LPS組相比，4-OI組小鼠心臟炎癥細(xì)胞浸潤程度較低，心肌細(xì)胞排列較緊密(圖2)。

注：HE染色，200倍。

2.3 Western blot檢測結(jié)果

Western blot檢測結(jié)果顯示，與Control組比較，LPS組小鼠心肌組織中Nrf2和GPx4的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，IL-1β、TNF-α、PTGS2(P<0.05)和pp65/p65(P<0.01)的表達(dá)明顯升高；與LPS組相比，4-OI組小鼠Nrf2(P<0.01)和GPx4(P<0.05)的表達(dá)明顯升高，IL-1β、TNF-α、pp65/p65(P<0.05)和PTGS2(P<0.01)的表達(dá)明顯下降(圖3)。LPS組小鼠心肌組織中的pp65/p65(P<0.01)、TNF-α和IL-β(P<0.05)的表達(dá)上調(diào)，Nrf2(P<0.05)的表達(dá)下調(diào)，而PTGS2(P<0.05)的表達(dá)上調(diào)，GPx4(P<0.05)的表達(dá)下調(diào)；與LPS組相比，4-OI組小鼠心肌組織中的pp65/p65、TNF-α和IL-β(P<0.05)的表達(dá)下調(diào)，Nrf2(P<0.01)的表達(dá)上調(diào)，而PTGS2(P<0.01)的表達(dá)下調(diào)，GPx4(P<0.05)的表達(dá)上調(diào)。

注：圖A，炎癥相關(guān)蛋白的改變；圖B，Nrf2的改變；圖C，PTGS2和GPx4的改變(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。

3 討論與結(jié)論

膿毒癥是一種常見的全身性炎癥疾病，易進(jìn)展為多器官功能衰竭，患者死亡率極高，尤以合并有心肌損傷時更為嚴(yán)重[8]。雖然膿毒癥誘發(fā)的心肌損傷是一個可逆的過程，但其仍是導(dǎo)致膿毒癥死亡率高的主要原因[9]。因此，在膿毒癥患者的治療中，減輕膿毒癥引發(fā)的心肌損傷的治療尤為重要，是降低膿毒癥患者臨床死亡率的重要措施。既往研究[1]表明，炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激是膿毒癥患者發(fā)生心肌損傷的兩個重要發(fā)病機(jī)制。LPS可結(jié)合并激活巨噬細(xì)胞膜上的Toll樣受體，促進(jìn)p65的磷酸化以及pp65入核，促使包括TNF-α和IL-1β在內(nèi)的促炎癥因子表達(dá)上調(diào)[10]，激活炎癥細(xì)胞直接損傷心肌細(xì)胞并抑制其收縮功能[11]，臨床表現(xiàn)為LVEF及LVFS下降。另一方面，嚴(yán)重感染導(dǎo)致心肌細(xì)胞線粒體呼吸鏈酶復(fù)合物Ⅱ功能障礙，導(dǎo)致電子傳遞方向逆轉(zhuǎn)，誘發(fā)氧化應(yīng)激，并對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA等細(xì)胞組成成分產(chǎn)生直接損害[12]，還可進(jìn)一步阻止缺氧誘導(dǎo)因子-1α的降解，最終上調(diào)促炎性細(xì)胞IL-1β的轉(zhuǎn)錄，加重炎癥。GPx4作為一種抗氧化成分，在氧化應(yīng)激時表達(dá)水平會明顯下降，同時誘導(dǎo)PTGS2上調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致脂質(zhì)氧化[13-14]。

衣康酸是三羧酸循環(huán)中的代謝產(chǎn)物，具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用，新近研究[2]顯示，4-OI作為其衍生物可激活Nrf2，上調(diào)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，同時可作用于p65蛋白抑制炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)，具備潛在的減輕膿毒癥引發(fā)心肌損傷的應(yīng)用價值，但尚無研究證實(shí)。本研究結(jié)果表明，4-OI腹腔注射預(yù)處理能明顯改善LPS腹腔注射后小鼠的心臟收縮功能，保護(hù)心臟結(jié)構(gòu)的完整并緩解心肌組織的炎癥浸潤。4-OI的應(yīng)用可明顯緩解LPS誘導(dǎo)的心肌組織TNF-α和IL-1β等炎癥因子的增加，抑制p65磷酸化。其機(jī)制可能與4-OI抑制p65的磷酸化，進(jìn)而減少pp65入核以及下調(diào)促炎因子的表達(dá)有關(guān)。同時，4-OI的應(yīng)用可激活Nrf2，抑制LPS腹腔注射后導(dǎo)致的心臟GPx4水平下降及PTGS2水平上調(diào)，最終抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而保護(hù)心肌。

綜上所述，4-OI的預(yù)處理可能通過上調(diào)Nrf2的表達(dá)，降低p65的磷酸化水平來抑制炎癥并發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而減輕LPS誘導(dǎo)造成的心肌損傷，但具體作用機(jī)制還有待深入研究。