孟永麗 李 暉

（1.河南中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，河南鄭州 450011；2.河南省中醫(yī)院，河南鄭州 450002）

在《自然流產(chǎn)診治中國專家共識（2020年版）》中建議將連續(xù)發(fā)生自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）2次及以上定義為復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA），包括連續(xù)發(fā)生的生化妊娠[1]。RSA發(fā)生率占妊娠總數(shù)的5%[2]，其病因復雜且致病機理不明，目前臨床上尚缺少有效的、規(guī)范的、更有力的循證醫(yī)學證據(jù)的診療方案，多采用抗凝、免疫、激素補充等療法，有效性和安全性仍具爭議[1-3]。

RSA可歸屬于中醫(yī)學“滑胎”范疇，治療上尤為重視補腎。清代醫(yī)家張錫純在壽胎丸中以菟絲子為君藥，重在補腎，取腎旺蔭胎之理。菟絲子首見于《神農(nóng)本草經(jīng)》[4]：“主續(xù)絕傷，補不足，益氣力，肥健?！梅髂?，輕身延年”，臨證常用于治療腎虛胎漏、胎動不安、滑胎、不孕癥、月經(jīng)后期及閉經(jīng)、陽痿遺精、遺尿尿頻及黃褐斑、白癜風等疾病[5]?，F(xiàn)代藥理研究表明，菟絲子具有調(diào)節(jié)激素水平、平衡免疫、抗氧化應激、抗骨質(zhì)疏松、增強內(nèi)分泌系統(tǒng)功能等作用[6]，其主要化學成分為金絲桃苷、槲皮素、山柰酚、異鼠李素等黃酮類化合物和β-谷甾醇類、多糖類及揮發(fā)性成分[7]。既往研究表明，菟絲子活性成分通過調(diào)節(jié)母胎界面免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡平衡以預防RSA[8]。本文通過梳理菟絲子活性成分在RSA信號通路中的藥物作用機制，以期為臨床運用菟絲子預防RSA及新藥研發(fā)提供思路和方法。

1 參與胚胎著床

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是 絲 氨 酸/蘇 氨 酸 蛋白 激酶家族重要的一員，介導了細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激 酶（the extracellular signal-related kinases 1/2，ERK1/2）、p38 MAPK激 酶、Jun N端 激 酶/應 激活化蛋白激酶（Jun N-terminal kinase/stressactivated protein kinase，JNK/SAPK）、ERK5信 號 轉(zhuǎn)導通路等4種MAPK級聯(lián)反應[9]。ERK信號通路是參與調(diào)節(jié)細胞生長、發(fā)育和分裂的信號網(wǎng)絡核心[10]，其中ERK1/2在胚胎發(fā)育早期階段具有廣泛表達，其通過干預孕早期滋養(yǎng)層細胞（CTB）和蛻膜基質(zhì)細胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等妊娠過程參與胚胎著床[11]。當MAPK表達下降時，會減弱孕早期CTB侵襲力，導致子宮上皮和基質(zhì)以及胎盤的巨細胞和海綿滋養(yǎng)細胞中腫瘤壞死因子（TNF）-α過度表達，促使孕早期CTB的進一步凋亡，同時刺激前列腺素E2（PGE2）釋放，興奮子宮平滑肌，引發(fā)流產(chǎn)[12]。基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）9可影響子宮內(nèi)膜細胞外基質(zhì)的降解與重塑能力，而PI3K/AKT信號通路參與妊娠期前3個月胎盤絨毛組織增殖、黏附及侵入子宮內(nèi)膜的過程與MMP-9的表達趨勢一致[13]，表明MMP-9在促進絨毛滋養(yǎng)層細胞的遷移和侵襲方面發(fā)揮了重要作用。當MMP-9分泌減少時，已著床的胚胎易發(fā)生蛻膜出血，造成流產(chǎn)[13]。另有研究表明，滋養(yǎng)層中的Notch信號通路可阻止胎盤不受控制地生長，其機制可能是通過抑制初級CTB向絨毛外滋養(yǎng)層（EVT）細胞的分化，從而確保EVT的形成和分化平衡，使EVT細胞正常分泌MMP-9，維持EVT細胞侵襲能力[14]。

研究顯示，菟絲子總黃酮（TFSC）以時間和劑量依賴性活化MAPK通路，促進早期CTB增殖，下調(diào)p-ERK和p-p38磷酸化，同時上調(diào)雌二醇（E2）、孕酮（P）和催乳素激素受體水平，防止RSA[15]。GAO F X等[16]研究發(fā)現(xiàn)，5 μg/mL濃度的TFSC可上調(diào)Notch/AKT/MAPK信號通路介導的MMP-9表達，使得EVT細胞的遷移和侵襲最大化。ZHU G S等[17]實驗研究亦表明，10 μg/mL濃度的TFSC能有效促進EVT細胞活性。槲皮素作為黃酮類化合物，可通過抑制p38 MAPK和JNK磷酸化，提高谷胱甘肽（GSH）水平，減少氧化應激損傷，以助于孕早期CTB植入子宮內(nèi)膜，促進胚胎著床[18]。

2 促進血管生成

胎盤血管生成是妊娠早期新生血管形成的一種主要方式，在子宮內(nèi)膜發(fā)育及子宮蛻膜化中具有關鍵作用，也是胚胎著床和維持正常妊娠的必要環(huán)節(jié)。有研究表明，重鑄的母胎界面血管是維持妊娠的關鍵，其本質(zhì)是血管新生[19]。磷酯 酰 肌 醇-3激 酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，AKT）信 號通路屬酪蛋白激酶受體型轉(zhuǎn)導途徑，PI3K/AKT信號通路可激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）產(chǎn)生NO，刺激血管舒張、血管重塑和血管生成[20]。同時，PI3K/AKT信號通路介導了血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的產(chǎn)生，后者在血管生成中起核心作用，可促進生長因子依賴的絨毛滋養(yǎng)層生長與細胞侵襲，其機制可能是VEGF通過與其受體VEGFR-2結(jié)合，使AKT活化進而激活PI3K/AKT通路，上調(diào)環(huán)氧化酶（COX）-2、誘導型NOS（iNOS）的表達，從而引起持續(xù)性血管新生[21]。KUTLUER G等[22]證實，VEGF的降低與早孕流產(chǎn)相關。此外，MAPK信號通路為VEGF下游常見的信號通路之一[23]，Notch信號通路是胎兒CTB入侵并重塑母體血管過程的關鍵組成部分，其中Notch1主要表達于早孕期絨毛分化及胎盤形成，調(diào)控胎盤血管生成和胚胎發(fā)育[24]。

研究發(fā)現(xiàn)，RSA患者母胎界面中存在過多的炎癥反應，降低了絨毛滋養(yǎng)層細胞活性，是導致早期胚胎植入失敗的一大原因[25]。當炎癥因子如白細胞介素（IL）-1β、干擾素（IFN）-γ、TNF-α等升高時，會阻礙胎盤血管生成，同時產(chǎn)生大量氧自由基，引發(fā)氧化應激反應，進而導致流產(chǎn)[26-27]。蔡美云等[28]研究發(fā)現(xiàn)，TFSC中的山柰酚通過p38 MAPK信號通路下調(diào)6-羥多巴胺（6-OHDA）誘導的PC12細胞炎性相關蛋白COX-2、iNOS以及核因子-κB（NF-κB）的表達水平，從而發(fā)揮抗炎作用。異鼠李素具有血管內(nèi)皮細胞保護作用，其機制與其抑制氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）所致氧化應激損傷有關[29]。此外，PI3K/AKT 和血紅素加氧酶-1（HO-1）可能是抑制ox-LDL誘導的細胞凋亡的新靶點，研究表明，異鼠李素可顯著增加HO-1表達，激活AKT磷酸化，并促進轉(zhuǎn)錄因子Nrf2易位，起到抗細胞凋亡的作用[30]。

3 平衡母胎免疫

母胎免疫耐受機制在RSA中起著重要作用，其中輔助性T細胞（Th）1/Th2平衡在免疫微環(huán)境中的調(diào)控作用尤為關鍵[31]。Th1細胞主要分泌TNF-α、IL-2、IFN-γ、IL-6、IL-12等細胞因子，有免疫殺傷作用[32]，TNF-α表達增強可殺死內(nèi)皮細胞，促使孕早期CTB凋亡，造成血栓形成、缺血、出血、組織壞死、子宮平滑肌興奮等，引發(fā)機體對胚胎的免疫排斥反應[33]。Th2細胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-10等細胞因子，主要介導體液免疫，誘導免疫耐受，利于母胎免疫耐受的維持與建立，多項研究證實IL-10能有效抑制Th1細胞因子的表達[34]?？傊?，Th2細胞免疫主導母體免疫系統(tǒng)時，可維持正常妊娠，而Th1細胞免疫占主導時則易引發(fā)流產(chǎn)。母胎界面的CD4+T細胞在著床期及妊娠早期介導免疫耐受平衡，研究表明，不明原因RSA發(fā)生機制可能與Notch1信號通路和Foxp3特異性轉(zhuǎn)錄因子表達下調(diào)，阻礙CD4+T細胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T細胞，進而誘發(fā)免疫排斥有關[35]。

菟絲子多糖（PAR）具有抗氧化應激、調(diào)節(jié)炎性細胞、抗衰老、增強免疫功能及抑制腫瘤細胞增殖等作用[36]。黃長盛等[37]研究發(fā)現(xiàn)，PAR以劑量依賴性增加妊娠期糖尿病大鼠CTB細胞增殖活性，通過提高血清E2、P水平，降低血清TNF-α、IFN-γ濃度，誘導異常蛻膜細胞凋亡，并提高IL-10、IL-4水平，從而預防RSA。馬紅霞等[38]研究發(fā)現(xiàn)，TFSC通過提高流產(chǎn)模型大鼠血清P水平，直接或間接下調(diào)蛻膜Th1細胞因子（IFN-γ、TNF-α）、上調(diào)Th2細胞因子（IL-4、IL-10）表達，使內(nèi)分泌-母胎界面免疫達到平衡，從而預防流產(chǎn)，其作用與運用P相似。KIM S Y等[39]研究發(fā)現(xiàn)，異鼠李素能顯著抑制脂多糖（LPS）誘導的BV2小膠質(zhì)細胞中TNF-α、IL-1β和 IL-6的分泌，包括NO和前列腺素E2的生成，其抗炎機制與阻斷NF-κB信號通路有關。另有研究表明，槲皮素可改善流產(chǎn)模型小鼠的氧化應激狀態(tài)，并調(diào)節(jié)外周血Th1、Th2細胞數(shù)量以減少血清IL-6、IL-8的分泌，并上調(diào)巨噬細胞數(shù)量和IL-10分泌，從而使母胎界面免疫平衡[40]。

4 其他相關作用

Fas/Fas配體（FasL）與TNF-α同屬一族，由Fas/FasL介導的針對特異性T淋巴細胞的凋亡是保證胎兒不被母體免疫系統(tǒng)排斥的防御機制之一[41]。肝素表皮生長因子（HB-EGF）是一種刺激細胞增殖的調(diào)節(jié)因子，可促進基質(zhì)細胞增殖[42]。此外，可通過抑制半胱氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）活性和促凋亡Bax表達，上調(diào)抗凋亡Bcl-2 mRNA水平以阻止基質(zhì)細胞凋亡，從而保護子宮蛻膜[42]。馬紅霞等[43]研究發(fā)現(xiàn)，TFSC通過降低流產(chǎn)模型大鼠蛻膜、胎盤Fas/FasL的表達，促使血清P分泌、下調(diào)母胎界面TNF-α表達，從而改善母胎免疫耐受，進而預防RSA；同時通過自分泌或旁分泌增加CTB中HB-EGF表達，增強CTB的增殖、侵入和缺氧耐受。β-石竹烯屬菟絲子揮發(fā)性成分，具有抗炎、抗氧化、抗細胞凋亡、抗菌等作用，有明顯的藥物劑量依賴性[44]。劉京東等[45]通過動物研究發(fā)現(xiàn)，β-石竹烯可以抑制腦缺血再灌注損傷大鼠海馬中Notch1、NF-κB、Hes1蛋白表達，降低TNF-α及IL-1β等炎性因子水平，保護缺血損傷及降低炎性反應。此外，β-谷甾醇作為菟絲子主要活性成分之一，可通過抑制TNF-α誘導的NF-κB信號通路激活和促性腺激素釋放激素（GnRH）的分泌，發(fā)揮抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等作用[46]。

5 結(jié)語

綜上，菟絲子活性成分通過調(diào)控MAPK、PI3K/AKT、Notch等信號通路參與胚胎著床、胎盤及其血管形成，促進母胎界面血流及免疫平衡?，F(xiàn)代藥理學研究亦證實，含菟絲子的經(jīng)典名方和中成藥，如壽胎丸、滋腎育胎丸、補腎安胎沖劑、孕康口服液等以補腎為主的方劑可通過VEGF、MAPK、PI3K/AKT、TGF-β等相關信號通路，調(diào)節(jié)相關蛋白及細胞因子表達，繼而預防RSA。

本文在梳理菟絲子活性成分的藥理作用研究相關文獻時，亦發(fā)現(xiàn)以下幾點不足：（1）菟絲子活性成分預防RSA的研究大多集中在菟絲子黃酮類化合物相關經(jīng)典通路，缺少其他活性成分如甾醇類、揮發(fā)性成分等重要信號通路在預防RSA方面的研究；（2）RSA相關信號通路的相互作用機制研究較少。后期我們將進行菟絲子多種活性成分與RSA靶點的細胞及動物實驗，以剖析各信號通路間的相互聯(lián)系及具體作用機制，為臨床應用和藥物研發(fā)提供科學依據(jù)。