尹麗萍，張劍林，殷 娜，黎進(jìn)雪，王妍凌，達(dá)菊慶，李 寧，武 運(yùn)

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052）

隨著人們生活水平逐漸提高，人們對于健康更加關(guān)注，特別是對于乳品的營養(yǎng)及口感需求與日俱增[1-4]。發(fā)酵乳為乳和乳制品在特征菌的作用下發(fā)酵而成的酸性凝乳狀制品[5]，具有改善乳糖不耐受的優(yōu)勢，同時具備抗有害微生物、抗胃腸感染、抗癌和降低血清膽固醇等功能[6-8]。益生菌在發(fā)酵乳發(fā)酵過程中發(fā)揮著重要的作用，賦予發(fā)酵乳獨(dú)特風(fēng)味[9-11]。由于發(fā)酵乳風(fēng)味獨(dú)特、質(zhì)感細(xì)膩，受到更多消費(fèi)者的青睞[12-14]。發(fā)酵乳衍生產(chǎn)品的感官品質(zhì)及營養(yǎng)價值是廣大消費(fèi)者選擇、購買和食用考慮的首要因素。因此，豐富發(fā)酵乳產(chǎn)品種類，提高其口感及食用價值是發(fā)酵乳的研究方向[15-16]。周潔等[17-18]研制了生姜紅糖發(fā)酵乳與凝固型芝士風(fēng)味發(fā)酵乳，徐華益[19]將白首烏添加到發(fā)酵乳制品，研制出既具有白首烏功能特性又具備發(fā)酵乳風(fēng)味的白首烏發(fā)酵乳。

紅葡萄酒粉主要由利用紅葡萄酒（紅酒）原汁及濃縮汁經(jīng)噴霧干燥制備而成，粉末細(xì)致，顏色鮮艷、口味均勻、復(fù)水性好以及性狀穩(wěn)定。紅酒風(fēng)味乳制品是基于純牛乳資源而開發(fā)的一種新型風(fēng)味乳制品，阮雁春等[20]以紅酒和全脂牛乳為主要原料制備了具有紅酒和牛乳營養(yǎng)及風(fēng)味的紅酒酸奶產(chǎn)品，而紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的研究未見報道。紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳制品的開發(fā)對于乳資源的擴(kuò)展利用具有很大的現(xiàn)實(shí)意義，符合風(fēng)味發(fā)酵乳產(chǎn)品多元化的趨勢。紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳既可以豐富發(fā)酵乳制品的種類，又可以發(fā)揮紅酒粉與發(fā)酵乳的營養(yǎng)價值，改善人體腸道菌生活環(huán)境，容易人體消化吸收[21-23]，響應(yīng)“健康、安全、綠色”的號召[24]。

本研究以牛奶與紅酒粉為主要原料制備紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳，以其酸度和感官評分為評價指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用模糊數(shù)學(xué)綜合評價法結(jié)合響應(yīng)面法對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。以期為紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的制作提供理論及實(shí)踐依據(jù)，為風(fēng)味發(fā)酵乳的研發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

生鮮牛乳：新疆烏魯木齊；紅酒粉：上海德樂飲品有限公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）YL15：新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院食品生物發(fā)酵與質(zhì)量安全研究室保藏。

1.1.2 試劑

蔗糖、NaOH、七水硫酸鈷（均為分析純）：天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；酚酞（分析純）：天津永晟精細(xì)化工有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR40-A2生物安全柜：青島海爾特種電器有限公司；PTX-FA210電子天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：光明醫(yī)療（北京）儀器廠；LDZX-50KBS高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；JM-L型膠體磨：諾尼輕工機(jī)械（上海）有限公司；DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；H2500R臺式高速離心機(jī)：湘儀儀器（長沙）有限公司；MJX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

原料的調(diào)配：向生鮮牛乳中添加3%的紅酒粉、6%的蔗糖進(jìn)行調(diào)配。

均質(zhì)：溫度60～75 ℃，均質(zhì)壓力18～20 MPa下均質(zhì)300 s。

殺菌：于恒溫水浴鍋中85 ℃加熱20 min進(jìn)行巴氏殺菌，冷卻至室溫。

菌種的活化：將單菌落挑至10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

接種：將活化好的植物乳桿菌YL15菌液以4℃、5000r/min離心15 min，取其沉淀用已滅菌蒸餾水進(jìn)行洗滌后再次離心，重復(fù)2次后，加入已滅菌的蒸餾水制成菌懸液，以2%的接種量接種至冷卻后混合原料中。

發(fā)酵、灌裝：于42 ℃發(fā)酵5 h，凝固后進(jìn)行灌裝，即得紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳成品。

1.3.2 紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)

固定發(fā)酵基礎(chǔ)條件為：接種量3%、發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時間5 h、蔗糖添加量6%、紅酒粉添加量3%。以酸度及感官評分為評價指標(biāo)，分別考察發(fā)酵時間（4 h、5 h、6 h、7 h、8 h）、發(fā)酵溫度（33 ℃、36 ℃、39 ℃、42 ℃、45 ℃）、接種量（1%、2%、3%、4%、5%）、蔗糖添加量（2%、4%、6%、8%、10%）、紅酒粉添加量（1%、3%、5%、7%、9%）對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳發(fā)酵效果的影響。

1.3.3 紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，固定接種量為2%，蔗糖添加量為6%，分別以酸度（Y1）、感官評分（Y2）為響應(yīng)值，以紅酒粉添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）為自變量，通過Box-Behnken原理進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素和水平見表1。

表1 發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken tests of fermentation conditions optimization

1.3.4 感官評價

請20名專業(yè)感官評價員對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的色澤、口感、組織形態(tài)、香氣4個指標(biāo)進(jìn)行感官綜合評價，滿分100分，紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of red wine flavored fermented milk

1.3.5 模糊數(shù)學(xué)綜合評價模型的建立

根據(jù)表2，參照張劍林等[25]的方法對不同條件下紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的感官指標(biāo)進(jìn)行模糊數(shù)學(xué)綜合評價，并建立評價模型。

（1）對象集、因素集、得分集與權(quán)重集的建立

評價對象集U，代表進(jìn)行感官評價的紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳樣品集合。U={u1，u2，u3，u4，u5，u6，u7，u8，u9，…uj…，u17}，其中，j=1，2，3，4，5，6，7，8，9，……，17。

評定因素集R={v1，v2，v3，v4}，v1～v4依次代表評價紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的4個評價因素。即R={色澤，口感，組織形態(tài)，香氣}。

評價得分集B={b1，b2，b3，b4}，b1～b4依次代表優(yōu)、良、中、差4個等級評判結(jié)果，對應(yīng)的分值是90，80，70和60。即B={優(yōu)，良，中，差}={90，80，70，60}。權(quán)重集X={x1，x2，x3，x4}，根據(jù)表2設(shè)置權(quán)重X={0.2，0.3，0.2，0.3}。

（2）模糊矩陣的建立及評價結(jié)果的確定

請20名專業(yè)感官評價員按照紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的色澤、口感、組織形態(tài)、香氣4個因素進(jìn)行感官綜合評價，評價之后可統(tǒng)計(jì)各個因素在各個等級中的票數(shù)，然后根據(jù)所得的票數(shù)結(jié)果得紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的感官評價模糊關(guān)系矩陣Rk。

其中k=1，2，3，4，5，…17為樣品的編號，里面的每一行都代表每一個質(zhì)量因素的評價數(shù)據(jù)結(jié)果。然后依照紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳模糊數(shù)學(xué)評價模型Tk=X×Rk（其中T評價集，X為權(quán)重系數(shù)，R為模糊矩陣）對第k號樣品的感官評分進(jìn)行計(jì)算。

1.3.6 分析檢測

酸度的測定：參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品酸度的測定》[26]。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

采用Excel2019進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用軟件Origin8.0繪圖，采用Design-Expert 8.0.5進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵時間對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵時間＜5 h時，酸度及感官評分均逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵時間為5 h時，酸度及感官評分均達(dá)到最大值，分別為82.1°T、88.4分；當(dāng)發(fā)酵時間＞5 h之后，酸度及感官評分均下降。綜合考慮，確定最適發(fā)酵時間為5 h。

圖1 發(fā)酵時間對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響Fig.1 Effect of fermentation time on the quality of red wine flavored fermented milk

2.1.2 發(fā)酵溫度對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵溫度＜42 ℃時，酸度及感官評分逐漸增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為42 ℃時，酸度及感官評分達(dá)到最大值，分別為87.1°T、88.7分；當(dāng)發(fā)酵溫度＞42 ℃之后，酸度及感官評分下降。綜合考慮，確定最適發(fā)酵溫度為42 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on the quality of red wine flavored fermented milk

2.1.3 接種量對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

由圖3可知，當(dāng)接種量＜2%時，酸度及感官評分均逐漸增加；當(dāng)接種量為2%時，酸度接近最高值且感官評分達(dá)到最大值，分別為75.1°T、89.2分；當(dāng)接種量＞2%之后，酸度及感官評分均下降。綜合考慮，確定最適接種量為2%。

圖3 接種量對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響Fig.3 Effect of inoculum on the quality of red wine flavored fermented milk

2.1.4 蔗糖添加量對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

由圖4可知，當(dāng)蔗糖添加量＜6%時，紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳酸度及感官評分逐漸增加；當(dāng)蔗糖添加量為6%時，酸度及感官評分均達(dá)到最高值，分別為75.2°T、88.7分；當(dāng)蔗糖添加量＞6%之后，酸度及感官評分呈下降趨勢。綜合考慮，確定最適接種量為6%。

圖4 蔗糖添加量對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響Fig.4 Effect of sucrose addition on the quality of red wine flavored fermented milk

2.1.5 紅酒粉添加量對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響

由圖5可知，當(dāng)紅酒粉添加量＜3%時，酸度及感官評分均逐漸增加；當(dāng)紅酒粉添加量為3%時，酸度及感官評分均達(dá)到最高值，分別為80.7°T、89.1分；當(dāng)紅酒粉添加量＞3%之后，酸度及感官評分均逐漸下降。綜合考慮，確定最適紅酒粉添加量為3%。

圖5 紅酒粉添加量對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳品質(zhì)的影響Fig.5 Effect of red wine powder addition on the quality of red wine flavored fermented milk

2.2 模糊數(shù)學(xué)綜合評價法分析

20名感官評定人員對17組樣品進(jìn)行感官評定打分，各個等級的各項(xiàng)指標(biāo)票數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

將表3中的數(shù)據(jù)建立模糊評價矩陣，將每個樣品的各自影響因素的得票數(shù)除以總的參與評價人數(shù)20，即可得到各個模糊矩陣R1～R17。以1號產(chǎn)品為例，色澤的評價人數(shù)分別為：0人優(yōu)，7人良，10人中，3人差，則R色澤=（0.00，0.35，0.50，0.15），同理，R口感=（0.00，0.25，0.40，0.35），R組織形態(tài)=（0.00，0.30，0.40，0.30），R香氣=（0.00，0.15，0.40，0.45），由此得矩陣R1：

表3 紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳感官評分投票結(jié)果Table 3 Voting results of sensory scores of red wine flavored fermented milk

同理，可依次得到R2～R17。

根據(jù)模糊變換原理，利用矩陣乘法，將權(quán)重集合X乘以模糊數(shù)學(xué)關(guān)系矩陣Rj，可以得到樣品對4個因素的綜合隸屬度Tk，以1號樣品為例，綜合隸屬度T1如下：

同理，可得其他紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳樣品的模糊評價結(jié)果，將各個樣品的綜合評判結(jié)果分別乘以其對應(yīng)的分值（優(yōu)、良、中、差依次被賦予分值90分、80分、70分、60分），經(jīng)過加和后，即得每個樣品最終感官評分。如1號樣品最終感官評分=0.00×90+0.25×80+0.42×70+0.33×60=69.2分。同理，可以計(jì)算出2～17號樣品的感官評分。

2.3 紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析見表5。通過Design-Expert 8.0.5軟件對表4的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合分析，可得到紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳酸度（Y1）、感官評分（Y2）對紅酒粉添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時間（C）的擬合回歸方程為：

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of response surface tests for fermentation conditions optimization

續(xù)表

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

由表5可知，模型極顯著（P＜0.01），失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05）。決定系數(shù)R21=0.981 8，R22=0.998 5，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj1=0.958 5，R2Adj2=0.996 6，該模型分別能解釋95.85%、99.66%的變化，表明實(shí)測值與預(yù)測值間擬合度比較好。因此，能用該模型對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的發(fā)酵條件進(jìn)行分析和預(yù)測。

由P值可知，一次項(xiàng)A、B、C、交互項(xiàng)BC、二次項(xiàng)A2、B2、C2對酸度影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AC對酸度影響顯著（P＜0.05）；一次項(xiàng)A、B、C與交互項(xiàng)AB、AC及二次項(xiàng)A2、B2對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳感官評分影響極顯著（P＜0.01）。

2.3.2 響應(yīng)面交互作用分析

由圖6可知，發(fā)酵溫度（B）和紅酒粉添加量（A）、發(fā)酵時間（C）和紅酒粉添加量（A）、發(fā)酵時間（C）和發(fā)酵溫度（B）交互作用對酸度影響的等高線呈橢圓形，表明各因素之間的交互作用對酸度影響顯著（P＜0.05）。發(fā)酵溫度（B）和紅酒粉添加量（A）、發(fā)酵時間（C）與紅酒粉添加量（A）交互作用對感官評分影響的等高線呈橢圓形，表明各因素間交互作用對感官評分影響顯著（P＜0.05），這與方差分析結(jié)果一致。

圖6 各因素間交互作用對紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳酸度及感官評分影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on acidity and sensory scores of red wine flavored fermented milk

2.3.3 模型驗(yàn)證

經(jīng)過Design-Expert8.0.5分析可得紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的最佳發(fā)酵工藝條件為：發(fā)酵時間5.1 h，紅酒粉添加量3%，發(fā)酵溫度42.3 ℃。在此最佳發(fā)酵工藝條件下，紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳酸度預(yù)測值可達(dá)78.7°T，感官評分預(yù)測值為89分。為方便實(shí)際操作，將發(fā)酵工藝條件修正為：發(fā)酵時間5 h，紅酒粉添加量3%，發(fā)酵溫度42 ℃。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)3次，實(shí)際測得的酸度為78.3°T、感官得分為89分，與響應(yīng)面法預(yù)測酸度及感官得分基本保持一致，該模型與實(shí)際試驗(yàn)結(jié)果擬合度較好，證實(shí)該模型具有一定的可行性。

3 結(jié)論

以牛奶和紅酒粉為主要原料制備紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳，以酸度和感官評分為評價指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用模糊數(shù)學(xué)綜合評價法結(jié)合Box-Behnken法獲得紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的最佳發(fā)酵工藝條件為：紅酒粉添加量3%、發(fā)酵溫度42 ℃、發(fā)酵時間5 h、接種量2%、蔗糖添加量6%。在該優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳的酸度為78.3°T，感官評分為89分，紅酒風(fēng)味發(fā)酵乳色澤淡紅，入口柔綿，有獨(dú)特紅酒香味。