高文靜，甄 攀，李惠源，趙瑛璐，趙港國(guó)，韓 英，賈麗艷

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030801；2.山西省白酒生物工程研究生教育創(chuàng)新中心，山西 晉中 030801；3.山西杏花村汾酒廠股份有限公司，山西 呂梁 032209）

白酒是我國(guó)的國(guó)酒[1]，是中國(guó)特有的蒸餾酒[2]。根據(jù)風(fēng)格的不同，可將白酒劃分為清香型、濃香型、醬香型、米香型等香型[3]，其中，由于清香型白酒具有“清香純正，綿甜爽凈，醇甜柔和”的風(fēng)格[4-5]，深受國(guó)內(nèi)外廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。清香型白酒是以高粱為原料，以大曲為糖化發(fā)酵劑，采用“清蒸二次清，地缸固態(tài)發(fā)酵，甑桶蒸餾”工藝生產(chǎn)而成的白酒，其主要的風(fēng)味物質(zhì)為乙酸乙酯[6-9]。乙酸乙酯的含量影響著白酒的品質(zhì)及風(fēng)格[10]。由于清香型白酒的發(fā)酵過(guò)程是“物系、酶系、菌系”及發(fā)酵條件動(dòng)態(tài)變化過(guò)程[11-12]。乙酸乙酯的形成因受外界環(huán)境影響，具有一定的波動(dòng)性[13]。因此，研究發(fā)酵條件對(duì)清香型白酒中乙酸乙酯形成的影響，對(duì)于調(diào)控清香型白酒中乙酸乙酯的形成，穩(wěn)定和進(jìn)一步提升清香型白酒中乙酸乙酯的含量，助推清香型白酒向可控化、智能化方向發(fā)展具有重要意義[14-17]。該研究以清香型白酒大米查發(fā)酵工藝為基礎(chǔ)，通過(guò)恒溫發(fā)酵的方式，采用單因素試驗(yàn)，探究水添加量、大曲添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間等因素對(duì)清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中乙酸乙酯形成影響，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙酸乙酯產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化高產(chǎn)乙酸乙酯的發(fā)酵工藝條件，為清香型白酒品質(zhì)穩(wěn)定和提升提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高粱（晉雜22號(hào)）、低溫大曲（精米查曲、紅心曲、后火曲的混合生產(chǎn)用曲）：山西某酒廠提供。

乙酸乙酯（分析純）、磷酸（分析純）、乙腈（色譜純）：上海阿拉丁科技公司；無(wú)水乙醇、磷酸二氫鉀（均為分析純）：天津市風(fēng)和化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BS2010S電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；Agilent 1260高效液相色譜（high-performance liquid chromatogra phy，HPLC）儀、Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：安捷倫科技有限公司；85-2A磁力攪拌器：精鑿科技（上海）有限公司；ST2100 pH計(jì)：常州奧豪斯儀器有限公司；Top Pette移液槍：濟(jì)南東儀試驗(yàn)室設(shè)備有限公司；SCAA-104有機(jī)相尼龍針式濾器：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 清香型白酒的加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：參考《清香型白酒生產(chǎn)技術(shù)》[18]。

1.3.2 分析檢測(cè)

酒精度的測(cè)定：參考國(guó)標(biāo)GB 5009.225—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測(cè)定》[19]中的酒精計(jì)法；乙酸乙酯含量的測(cè)定：參考魏志陽(yáng)等[20]的高效液相色譜法，略有修改。高效液相色譜分析條件：ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.05 mol/L KH2PO4（8∶92，V/V）；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)210nm。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）單因素試驗(yàn)

將粉碎后的高粱，在不同發(fā)酵時(shí)間（0、3 d、7 d、15 d、17 d、21 d、28 d）、發(fā)酵溫度（24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃、34 ℃）、大曲添加量（2%、4%、6%、8%、10%、12%）、水添加量（80%、100%、120%、140%、160%）的條件下進(jìn)行發(fā)酵。分別測(cè)定酒醅酒精度和乙酸乙酯含量，探究以上各因素對(duì)清香型白酒發(fā)酵大米查酒醅中乙酸乙酯形成的影響。

（2）響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，確定影響清香型白酒發(fā)酵大米查酒醅中乙酸乙酯形成的三個(gè)顯著因素，以大曲添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、水添加量（C）為評(píng)價(jià)因素，以酒醅中乙酸乙酯含量（Y）作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments design for fermentation process optimization

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

利用Origin 8.5軟件繪圖，Design Expert 10.0.7進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)清香型白酒酒醅中乙酸乙酯形成的影響

由圖1可知，隨著發(fā)酵時(shí)間在0～21 d范圍內(nèi)的增加，清香型白酒發(fā)酵酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度均呈現(xiàn)先增加后略有降低的趨勢(shì)，發(fā)酵初期酒醅中乙酸乙酯含量快速上升；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到21 d時(shí)，發(fā)酵酒醅中乙酸乙酯含量達(dá)到最高，為（0.71±0.020）g/kg；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到17 d時(shí)，酒精度最高，為（11.8±0.20）%vol；發(fā)酵時(shí)間在21～28 d時(shí)，酒醅中乙酸乙酯含量略微降低。發(fā)酵時(shí)間在17～28 d時(shí)，酒精度略有降低。發(fā)酵后期，酒醅中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被消耗，微生物代謝緩慢，產(chǎn)酯能力下降。因此，選擇最適發(fā)酵時(shí)間為21 d。

圖1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.1 Effect of fermentation time on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影響

低溫發(fā)酵有利于養(yǎng)醅，防止酒醅生酸過(guò)快[21]，可以提高出酒率；并且低溫發(fā)酵酒甜，綿柔爽凈；高溫發(fā)酵的酒苦，后味苦澀、雜味大[22]。

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵溫度在24～28 ℃范圍內(nèi)的升高，酒醅中酒精度和乙酸乙酯含量隨之增加；當(dāng)發(fā)酵溫度為28 ℃時(shí)，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度達(dá)到最高，分別為（0.75±0.02）g/kg、（11.9±0.21）%vol；當(dāng)發(fā)酵溫度在28～34 ℃時(shí)，酒醅中酒精度和乙酸乙酯含量隨之下降。通過(guò)與室溫發(fā)酵對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在一定的溫度范圍內(nèi)，當(dāng)酒醅發(fā)酵溫度恒定，有利于酒醅發(fā)酵中乙酸乙酯和乙醇的形成。因此，選擇最適發(fā)酵溫度為28 ℃。

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains

2.1.3 大曲添加量對(duì)清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影響大曲

作為重要的糖化劑和發(fā)酵劑[23]，是引起酒醅發(fā)酵的微生物及其代謝產(chǎn)物的主要來(lái)源[24]。大曲的品質(zhì)和質(zhì)量在清香型白酒發(fā)酵過(guò)程中尤其重要[25]。

由圖3可知，當(dāng)大曲添加量在2%～12%范圍內(nèi)的增加，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度隨之升高；當(dāng)大曲添加量為12%時(shí)，酒醅中乙酸乙酯含量、酒精度最高，分別達(dá)到（0.81±0.01）g/kg、（11.8±0.15）%vol；隨著大曲添加量在2%～12%范圍內(nèi)的增加，酒醅中酯化酶作用加快，加速了酒醅中淀粉的轉(zhuǎn)化，乙酸乙酯合成速率加快，所以酒醅中乙酸乙酯含量快速增加。因此，選擇最適大曲添加量為12%。

圖3 大曲添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.3 Effect of Daqu addition on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains

2.1.4 水添加量對(duì)清香型白酒酒醅乙酸乙酯形成的影響

白酒發(fā)酵過(guò)程中除了發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間等因素，水添加量也會(huì)在一定程度上影響到酒體的成分和品質(zhì)[26]。

由圖4可知，隨著水添加量在80%～120%范圍內(nèi)的增加，酒醅中的乙酸乙酯含量和酒精度隨之增加；當(dāng)水添加量為120%時(shí)，酒醅中乙酸乙酯含量達(dá)到最高，為（0.86±0.01）g/kg；當(dāng)水添加量為140%時(shí)，酒醅中酒精度最高，為（11.4±0.15）%vol；當(dāng)水添加量＞120%之后，乙酸乙酯含量有所下降；當(dāng)水添加量＞140%之后，酒精度稍有降低。因此，選擇最適水添加量為120%。

圖4 水添加量對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度的影響Fig.4 Effect of water addition on ethyl acetate contents and alcohol content of fermented grains

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

通過(guò)單因素試驗(yàn)，篩選出了3個(gè)影響清香型白酒大米查發(fā)酵酒醅中乙酸乙酯含量及酒精度變化的顯著因子，以大曲添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、水添加量（C）為自變量，酒醅中乙酸乙酯含量（Y）作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

續(xù)表

應(yīng)用Design Expert 10.0.7軟件分析了大曲添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、水添加量（C）3因素對(duì)清香型白酒中乙酸乙酯含量的影響，得出酒醅中乙酸乙酯含量（Y）的二次回歸方程為：Y=+0.90+0.008 75A+0.031B+0.018C-0.005AB+0.012AC+0.002 5BC-0.097A2-0.097B2-0.13C2。

根據(jù)表3可知，建立的酒醅發(fā)酵產(chǎn)乙酸乙酯的回歸模型P值＜0.000 1，表明此響應(yīng)面回歸模型極顯著。乙酸乙酯失擬項(xiàng)P值=0.123 4＞0.05，不顯著，說(shuō)明試驗(yàn)誤差較小，響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)的結(jié)果可靠?；貧w方程決定系數(shù)R2為0.997 6，校正決定系數(shù)R2adj為0.994 5，表明多元回歸關(guān)系顯著，此試驗(yàn)設(shè)計(jì)可靠，因此可以利用該回歸方程預(yù)測(cè)上述因素對(duì)清香型白酒中乙酸乙酯含量的影響。由P值可知，一次項(xiàng)B、C及二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量影響均極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)A及交互項(xiàng)AC對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量的影響顯著（P＜0.05）。由F值可知，3因素對(duì)酒醅中乙酸乙酯含量的影響順序?yàn)榘l(fā)酵溫度＞水添加量＞大曲添加量。

2.2.2 各因素對(duì)清香型白酒酒醅中乙酸乙酯形成影響的響應(yīng)面分析

大曲添加量（A）、發(fā)酵溫度（B）、水添加量（C）三個(gè)因素交互作用對(duì)清香型白酒大米查酒醅中乙酸乙酯含量（Y）影響響應(yīng)面及等高線見(jiàn)圖5。根據(jù)各因素之間的三維響應(yīng)面圖形觀察各因素間交互作用的強(qiáng)弱，也可以反映出各個(gè)交互作用對(duì)響應(yīng)值的影響強(qiáng)弱。等高線圖中曲線越陡，影響越顯著；曲線越平順，影響越微弱。三維響應(yīng)面圖的形狀變化表示響應(yīng)值的變化。

圖5 大曲添加量、發(fā)酵溫度和水分添加量間交互作用對(duì)乙酸乙酯含量影響的響應(yīng)曲面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between Daqu addition,fermentation temperature and water addition on ethyl acetate contents

由圖5可知，各因素間交互作用對(duì)結(jié)果影響的響應(yīng)面曲線走勢(shì)較陡，等高線呈橢圓形，說(shuō)明AB、AC、BC之間存在交互作用，乙酸乙酯含量隨著大曲添加量（A）、水添加量（C）兩者交互作用響應(yīng)面較為陡峭，等高線橢圓程度較為明顯，對(duì)乙酸乙酯含量的影響顯著（P＜0.05）。

2.2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)Design-Expert 10.0.8軟件得到最優(yōu)工藝參數(shù)為大曲添加量12.17%，發(fā)酵溫度28.31 ℃，水添加量118.52%。為了便于實(shí)際操作，將清香型白酒大米查最優(yōu)發(fā)酵工藝條件修正為：大曲添加量12.2%，發(fā)酵溫度28 ℃，水添加量118%，在此優(yōu)化條件下，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，乙酸乙酯含量實(shí)際值為（0.91±0.02）g/kg，與預(yù)測(cè)值0.901 g/kg基本保持一致，故該模型可行。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及響應(yīng)面試驗(yàn)，確定了高產(chǎn)乙酸乙酯清香型白酒的最優(yōu)發(fā)酵條件為大曲添加量12.2%，發(fā)酵溫度28℃，水添加量118%。在此最佳條件下，酒醅中乙酸乙酯含量達(dá)到最高，為（0.91±0.02）g/kg。本研究為提高清香型白酒酒醅中乙酸乙酯的含量及促進(jìn)清香型白酒向智能化、可控化方向發(fā)展提供技術(shù)支撐。