曾 臻，楊彩娟，譚強來，豐 艷，陸馨敏，許 莉，陳仲巍

（1.廈門醫(yī)學院 海洋生物醫(yī)藥資源福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學院 天然化妝品福建省高校工程研究中心，福建 廈門 361023）

益生菌發(fā)酵是利用有益微生物自身代謝產(chǎn)生的多種酶類使蛋白質(zhì)、多糖等大分子分解，生成新的小分子多肽、糖類等營養(yǎng)功效物質(zhì)[1]。通過益生菌發(fā)酵不僅?？梢蕴嵘称凤L味、延長食品保質(zhì)期，還能賦予或強化發(fā)酵制品的抗氧化、抗炎、抗菌、降血壓等多種益生功能[2]。DU X P等[3]采用植物乳桿菌、釀酒酵母、巴氏醋酸菌發(fā)酵紅毛藻，可有效降低藻腥味、提高接受度。MARTí-QUIJAL F J等[4]利用乳酸菌對魚副產(chǎn)品進行發(fā)酵，獲得了抗氧化活性產(chǎn)物，從而提升了食品加工副產(chǎn)品的價值。韓之皓等[5]的研究表明，復合益生菌乳飲料具有較強的抗氧化、抑菌及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性。FAN J J等[6]研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌發(fā)酵人參制品可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群，進而緩解酒精性肝損傷和腸道功能紊亂。目前，益生菌已廣泛應用于發(fā)酵乳、米面、果蔬、肉類等食品的制作與加工[7-8]，而應用于海洋貝類發(fā)酵的研究相對有限。為數(shù)不多的研究表明，貝類發(fā)酵制品也表現(xiàn)出多種生理活性，如GAO J等[9-10]分別利用納豆芽孢桿菌發(fā)酵的扇貝裙邊和菲律賓蛤仔，均有較好的ACE抑制活性。然而，以牡蠣為基料進行益生菌發(fā)酵目前還較為少見。

牡蠣在我國資源豐富且富含蛋白質(zhì)，素有“海中牛奶”之稱，具有開發(fā)為抗氧化功能食品的潛能[11-12]。劉文穎等[13]通過二步酶解法制備了具有良好抗氧化效果的牡蠣低聚肽。王力等[14]研究表明，牡蠣酶解多肽組分具有較好的抗氧化活性。龐忠莉等[15]對牡蠣干雙酶解液的體外抗氧化活性進行了評價。

本研究以牡蠣為基料，參考《可用于食品的菌種名單》[16]，選用4株典型的益生菌進行液態(tài)發(fā)酵后，對比相應牡蠣制品的總抗氧化能力、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力及總肽含量等指標，旨在為益生菌株選用和牡蠣基功能食品開發(fā)提供參考依據(jù)，為益生菌發(fā)酵海洋食藥資源的產(chǎn)業(yè)應用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）、布拉酵母菌（Saccharomyces boulardii）：本實驗室保存；牡蠣凍干粉：陜西東禾福生物科技有限公司；蔗糖（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；MRS肉湯培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：北京索萊寶科技有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒、DPPH自由基檢測試劑盒、羥自由基檢測試劑盒、超氧陰離子自由基檢測試劑盒、總蛋白定量檢測試劑盒：南京建成生物工程研究所；其他化學試劑（均為分析純）：西隴科學股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GR88DR高壓滅菌鍋：致微（廈門）儀器有限公司；Anaerobox IV型厭氧培養(yǎng)箱：美國GeneScience公司；SKY-2102C恒溫搖床：上海蘇坤實業(yè)有限公司；UV-5100B紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HWS-24水浴鍋：上海一恒科技有限公司；FE28酸度計：梅特勒托利多科技（中國）有限公司；3K15冷凍臺式離心機：德國SIGMA公司；Quintix5102電子天平：德國Sartorius公司；Vortex 3漩渦混勻器：德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 益生菌的活化及種子菌懸液的制備

將鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、腸膜明串珠菌接種于MRS肉湯，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h；布拉酵母菌接種于YPD液體培養(yǎng)基，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)24～48 h，使各菌活化后，再同上條件分別轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制成109CFU/mL的種子菌懸液，備用。

1.3.2 益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的制備

稱取4.0 g牡蠣凍干粉、0.4 g蔗糖，加100 mL蒸餾水混勻，配制成4 g/100 mL牡蠣培養(yǎng)基，pH調(diào)節(jié)至6.2～6.6后滅菌備用。

以10%接種量分別接入上述4種益生菌的種子菌懸液，同上條件發(fā)酵24 h后，8 000 r/min離心10 min收集上清，并利用0.22 μm微孔濾膜確保除菌，獲得各益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品。以未接種任何益生菌的4%牡蠣培養(yǎng)基為空白對照。

1.3.3 總抗氧化能力的測定

遵照總抗氧化能力檢測試劑盒說明書的步驟，配制對應試劑，設(shè)置測定管及對照管，按照操作順序加樣、混勻、水浴、靜置后，以雙蒸水調(diào)零后測定吸光度值（波長520 nm、光徑1 cm）后，完成計算。

1.3.4 DPPH自由基清除能力的測定

遵照DPPH自由基檢測試劑盒說明書的步驟，配制對應試劑，設(shè)置空白管、對照管及測定管，按照操作順序加樣、混勻、避光靜置，以無水乙醇調(diào)零后測定吸光度值（波長517 nm、光徑1 cm）后，完成計算。

1.3.5 羥自由基清除能力的測定

遵照羥自由基測試試劑盒說明書的步驟，配制對應試劑，設(shè)置空白管、標準管、對照管及測定管，按照操作順序加樣、迅速混勻、精確計時水浴、顯色，以雙蒸水調(diào)零后測定吸光度值（波長550 nm，光徑1 cm）后，完成計算。

1.3.6 超氧陰離子自由基清除能力的測定

遵照超氧陰離子自由基測定試劑盒說明書的步驟，配制對應試劑，設(shè)置對照管、標準管及測定管，按照操作順序加樣、混勻、水浴、顯色，以雙蒸水調(diào)零后測定吸光度值（波長550 nm，光徑1 cm）后，完成計算。

1.3.7 總肽含量的測定

遵照總蛋白定量測定試劑盒說明書的步驟，配制對應試劑，設(shè)置空白管、標準管及對照管，按照操作順序加樣、混勻、孵育、終止，以雙蒸水調(diào)零后測定吸光度值（波長562 nm、光徑0.5 cm）后，完成計算。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

實驗如無特別標注，平行測定3次。數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism version 5.01進行分析及繪圖，結(jié)果以“平均值±標準偏差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 總抗氧化能力的測定

4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的總抗氧化能力見圖1。由圖1可知，與空白對照（（0.73±0.02）U/mL）相比，4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的總抗氧化能力均顯著提升（P＜0.05）；總抗氧化能力依次為鼠李糖乳桿菌組（（4.04±0.05）U/mL）＞干酪乳桿菌組（（3.59±0.12）U/mL）＞布拉酵母菌組（（2.54±0.09）U/mL）＞腸膜明串珠菌組（（2.32±0.13）U/mL），且除了腸膜明串珠菌組與布拉酵母菌組之間無顯著差異之外（P＞0.05），其余各組間均存在顯著差異（P＜0.05）。因此，進一步評估各實驗組的DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力。

圖1 4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的總抗氧化能力比較Fig.1 Comparison of total antioxidant capacity of oyster products with liquid fermentation by 4 probiotics

2.2 DPPH自由基清除能力測定

4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的DPPH自由基清除能力見圖2。由圖2可知，鼠李糖乳桿菌組、干酪乳桿菌組、腸膜明串珠菌組、布拉酵母菌組的DPPH自由基清除能力分別為（47.62±0.63）μg Trolox/mL、（44.71±1.24）μg Trolox/mL、（39.34±1.88）μg Trolox/mL、（39.40±1.32）μg Trolox/mL，表明各組均有一定的DPPH自由基清除能力，其中鼠李糖乳桿菌與干酪乳桿菌兩組顯著高于腸膜明串珠菌與布拉酵母菌兩組（P＜0.05）。

圖2 4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的DPPH自由基清除能力比較Fig.2 Comparison of DPPH free radical scavenging ability of oyster products with liquid fermentation by 4 probiotics

2.3 羥自由基清除能力測定

4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的羥自由基清除能力見圖3。由圖3可知，鼠李糖乳桿菌組、干酪乳桿菌組、腸膜明串珠菌組、布拉酵母菌組的羥自由基清除能力分別為（33.04±0.09）U/mL、（32.98±1.06）U/mL、（34.18±1.70）U/mL、（32.18±1.12）U/mL，表明各組均有一定的羥自由基清除能力，其中腸膜明串珠菌組稍高，但各組之間均無顯著差異（P＞0.05）。

圖3 4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的羥自由基清除能力比較Fig.3 Comparison of hydroxyl radical scavenging capacity of oyster products with liquid fermentation by 4 probiotics

2.4 超氧陰離子自由基清除能力測定

4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的超氧陰離子自由基清除能力見圖4。由圖4可知，鼠李糖乳桿菌組、干酪乳桿菌組、腸膜明串珠菌組、布拉酵母菌組的超氧陰離子自由基清除能力分別為（21.85±0.46）U/L、（31.11±1.00）U/L、（35.45±1.76）U/L、（36.96±1.29）U/L，表明各組均有一定的超氧陰離子自由基清除能力，其中布拉酵母菌與腸膜明串珠菌兩組顯著高于干酪乳桿菌組（P＜0.05），而干酪乳桿菌組又顯著高于鼠李糖乳桿菌組（P＜0.05）。

圖4 4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的超氧陰離子自由基清除能力比較Fig.4 Comparison of superoxide anion radical scavenging capacity of oyster products with liquid fermentation by 4 probiotics

2.5 總肽含量的測定

4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品中總肽含量見圖5。由圖5可知，鼠李糖乳桿菌組、干酪乳桿菌組、腸膜明串珠菌組、布拉酵母菌組的總肽含量分別為（4.04±0.01）mg/mL、（4.30±0.07）mg/mL、（4.46±0.10）mg/mL、（3.77±0.11）mg/mL；其中腸膜明串珠菌與干酪乳桿菌組兩組顯著高于鼠李糖乳桿菌組（P＜0.05），而鼠李糖乳桿菌組又顯著高于布拉酵母菌組（P＜0.05）。

圖5 4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的總肽含量比較Fig.5 Comparison of total peptide contents of oyster products with liquid fermentation by 4 probiotics

3 討論

微生物發(fā)酵食品因其口感豐富、功能顯著，貼合現(xiàn)代社會人們的飲食需求，在行業(yè)內(nèi)愈加受到關(guān)注[17]。食品發(fā)酵工業(yè)中所用微生物菌株以乳酸菌、酵母菌最為常見，二者均具有良好的食品安全性[18]。乳酸菌常具有優(yōu)良的產(chǎn)酸能力和凝乳特性，還含有酚酸脫羧酶、β-葡萄糖苷酶、蛋白酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、乳酸脫氫酶等多種活性酶，可基于生物轉(zhuǎn)化活性改變基質(zhì)中的物質(zhì)結(jié)構(gòu)和類型[18-20]。酵母菌多具有產(chǎn)香能力，還富含蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、谷氨酸脫氫酶，表現(xiàn)出抗氧化、抑菌等多種益生特性[21-22]。劉夢培等[23]比較了釀酒酵母、植物乳桿菌單獨或復合發(fā)酵杜仲雄花茶汁的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)采用植物乳桿菌發(fā)酵的品質(zhì)指標和抗氧化活性均比較好。曹慶超等[24]研究發(fā)現(xiàn)，相比釀酒酵母，采用扣囊復膜酵母發(fā)酵的芍藥籽餅粕的抗氧化活性更強。此外，有研究表明，不同的菌種由于所分泌的酶系存在差異，對蛋白質(zhì)的降解效果也不相同，有必要針對性對比篩選[25-26]。因此，本研究基于牡蠣原料中蛋白質(zhì)含量高的特點，采用鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌、腸膜明串珠菌、布拉酵母菌4株典型的乳酸菌或酵母菌進行液態(tài)發(fā)酵，綜合對比抗氧化活性和總肽含量指標，從而篩選較適用于牡蠣基料發(fā)酵的益生菌株。而研究結(jié)果也表明，牡蠣基料經(jīng)各益生菌發(fā)酵后，其制品的總抗氧化能力均有明顯提高；但不同菌株之間存在顯著差異，其中以鼠李糖乳桿菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的總抗氧化能力最高。在自由基抑制清除能力上，鼠李糖乳桿菌組的DPPH自由基清除能力也最強。但其羥自由基清除能力與其他組相近，超氧陰離子自由基清除能力反而最低，這或與不同菌株存在的代謝轉(zhuǎn)化途徑差異有關(guān)[27]。

鼠李糖乳桿菌自分離鑒定以來，已成為全世界范圍內(nèi)食品工業(yè)乃至臨床試驗中應用研究最多的益生菌之一，不僅具有良好的耐酸、耐膽汁、粘附、增殖能力，還能發(fā)揮清除致病菌定植、預防感染、防治腹瀉、增強免疫等益生作用[28]。由此鼠李糖乳桿菌也顯示出良好的發(fā)酵增香增效性能，如鼠李糖乳桿菌在非洲被廣泛應用于發(fā)酵牛乳、小米、果汁，其制品營養(yǎng)豐富，并被賦予一系列的增進健康特性[29]。值得關(guān)注的是，BEGUNOVA A V等[30]研究表明，鼠李糖乳桿菌具有獨特的蛋白水解系統(tǒng)，雖然對牛乳酪蛋白的水解活性相較瑞士乳桿菌更弱，卻能釋放出多種特有的具有較好抗氧化和ACE抑制活性的肽。這與本研究結(jié)果較為一致，牡蠣經(jīng)鼠李糖乳桿菌液態(tài)發(fā)酵后，雖然其制品中總肽含量并不是最高，但總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力最強。因此，經(jīng)綜合對比，鼠李糖乳桿菌或是可用于發(fā)酵牡蠣制備生物活性肽的優(yōu)良菌株，但肽的序列結(jié)構(gòu)和種類尚待后續(xù)加以鑒定，其發(fā)酵條件也需系統(tǒng)優(yōu)化[30-31]。

牡蠣是我國重要的經(jīng)濟貝類，產(chǎn)量持續(xù)排名世界第一，而研究所在地福建省的牡蠣產(chǎn)量在全國也是連年占據(jù)高比重，在我國各主要的沿海省級產(chǎn)區(qū)中，福建省牡蠣產(chǎn)業(yè)的綜合比較優(yōu)勢第一、規(guī)模比較優(yōu)勢第二[32]。然而，在效率比較優(yōu)勢上，福建省在八個省級區(qū)域中僅排名第六[32]。一直以來，市場上牡蠣輸出形式主要為鮮食、蠔干、蠔油等粗放型產(chǎn)品，附加值較低，因此，牡蠣功效成分的深度開發(fā)、綜合利用日益受到關(guān)注[33]。如王力等[14]評估了牡蠣酶解多肽組分的抗氧化活性和抗衰老作用，認為其可作為相應的功能食品基料。XIAO M F等[34]研究表明，牡蠣多肽組分具有抗疲勞作用，并能調(diào)節(jié)小鼠腸道菌群的豐度，維持腸道微生態(tài)平衡。陳宏等[35]通過酶解牡蠣制備了二肽基肽酶-Ⅳ（dipeptidyl peptidase-Ⅳ，DPP-Ⅳ）抑制肽，為牡蠣基功能食品的開發(fā)奠定了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

通過比較4株益生菌液態(tài)發(fā)酵牡蠣制品的體外抗氧化活性指標，結(jié)果表明，牡蠣制品經(jīng)益生菌發(fā)酵后總抗氧化能力均得到明顯提高，其中以鼠李糖乳桿菌組的總抗氧化能力和DPPH自由基清除能力效果最佳，可初步確定鼠李糖乳桿菌為適用于發(fā)酵牡蠣制備生物活性肽的優(yōu)良菌株，驗證了采用益生菌發(fā)酵牡蠣增效的技術(shù)可行性，對牡蠣等海洋藥食資源的高值化利用具有借鑒意義，但發(fā)酵水解肽的序列結(jié)構(gòu)、活性評估、增效機理尚待后續(xù)進一步分離、鑒定和驗證。