黃 闊，葉長文，李東亮，李青常，朱貝貝，劉萌萌，范 黎，史占東，薛 芳*，李 棟*

1. 中國煙草總公司鄭州煙草研究院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)楓楊街2 號(hào) 450001

2. 四川中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，成都市成龍大道一段56 號(hào) 610066

霉變是煙草及煙草制品存儲(chǔ)中需要重點(diǎn)研究解決的關(guān)鍵問題之一［1-3］，霉變除影響煙草及煙草制品感官品質(zhì)外還可能造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［1，4-6］。雪茄煙與傳統(tǒng)卷煙相比，更易發(fā)生霉變［7］，而預(yù)防和控制雪茄煙霉變的前提是能夠快速準(zhǔn)確地檢測雪茄煙中的霉菌含量，評估雪茄煙霉變發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。由于雪茄煙生產(chǎn)及存儲(chǔ)的特殊性和霉菌的差異性，尋找更加適合于雪茄煙中霉菌計(jì)數(shù)的方法尤為重要。

國內(nèi)外食品行業(yè)出臺(tái)了霉菌計(jì)數(shù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，如ISO 21527—2：2008［8］、GB 4789.15—2016［9］和美國FDA 官方檢測方法［10］等，這些微生物學(xué)霉菌計(jì)數(shù)方法主要采用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基或馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，推薦使用平板傾注法或平板涂布法兩種接種方式［8-12］。煙草行業(yè)也參考食品相關(guān)檢測方法建立了煙草及煙草制品中霉菌計(jì)數(shù)方法標(biāo)準(zhǔn)［11］，采用改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行平板傾注法接種。林華清等［13］針對煙草及煙草制品中8種常見霉菌，對霉菌計(jì)數(shù)用培養(yǎng)基種類進(jìn)行了篩選，但未對實(shí)際煙草樣品進(jìn)行適用性驗(yàn)證和分析。由于不同類型煙草及煙草制品中霉菌種類較多且存在差異性，同時(shí)培養(yǎng)基種類和接種方式也直接影響計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性，若在同等條件下將樣品中的霉菌盡可能多地培養(yǎng)出來，有必要對適宜的培養(yǎng)基種類進(jìn)行系統(tǒng)比較和篩選，并優(yōu)化接種方式，以得到穩(wěn)定準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。為此，對目前的霉菌計(jì)數(shù)方法綜合分析后，選用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（GB 法推薦用培養(yǎng)基）、改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YC/T法推薦用培養(yǎng)基）和SYMPHONY Agar 快速顯色培養(yǎng)基（Biokar法推薦用培養(yǎng)基）等3種培養(yǎng)基，采用平板涂布法與平板傾注法兩種接種方式對國內(nèi)市售13種雪茄煙進(jìn)行霉菌計(jì)數(shù)，研究3種培養(yǎng)基在不同接種方式條件下雪茄煙中霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的差異性及霉菌形態(tài)的變化，并對各霉菌計(jì)數(shù)方法進(jìn)行適用性評價(jià)，旨在為篩選出適宜雪茄煙的霉菌計(jì)數(shù)方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品信息

從視覺、嗅覺的角度，根據(jù)雪茄煙的霉變程度，選擇國內(nèi)市售13種具有代表性的雪茄煙（見表1）作為試驗(yàn)樣品。13 個(gè)樣品按茄芯原料形態(tài)分類，分為煙束（8種）、煙片（4種）和煙絲（1種）三類；按制作方式分為手制（10 種）、半手制（1 種）和機(jī)制（2 種）三類；按包裝形式分為木盒（4種）、紙盒（7種）和鐵盒（2種）三類［14］。

表1 13種雪茄煙樣品基本信息Tab.1 Basic information of 13 cigar samples

1.2 儀器與試劑

Bagmixer?400均質(zhì)器（法國Interscience公司）；HZT-2000電子天平（福州華志科學(xué)儀器有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；CL-40M高壓滅菌鍋（日本AUTOCLVAE公司）；SCAN 1200自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器（法國Interscience公司）；VORTEX 1 渦旋振蕩器（德國 IKA 公司）；CTHI-250B2恒溫恒濕箱（上海施都凱儀器設(shè)備有限公司）。

孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（按照煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［11］制備）；SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基（法國Solabia集團(tuán)Biokar公司）；225 mL磷酸鹽緩沖液、無菌培養(yǎng)皿、無菌L型涂布棒、無菌均質(zhì)袋（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品稀釋

每個(gè)樣品各稱取25 g，用無菌剪刀剪碎，置于無菌均質(zhì)袋中，加入225 mL無菌磷酸鹽緩沖液，均質(zhì)器3擋均質(zhì)3 min，取均質(zhì)后樣液梯度稀釋，按照前期對樣品中霉菌含量的評估，依次制備4 個(gè)稀釋梯度（10-1、10-2、10-3、10-4）。每個(gè)樣品3次重復(fù)，進(jìn)行稀釋接種。

1.3.2 接種和培養(yǎng)

分別使用平板傾注法［15］和平板涂布法［8］在3 種培養(yǎng)基上進(jìn)行平行試驗(yàn)，最后對3種培養(yǎng)基及兩種接種方式進(jìn)行比較。

平板傾注法（QZ）：先吸取1 mL 各樣品的梯度稀釋液于培養(yǎng)皿中，再將20 ～25 mL 45 ℃左右的高壓蒸汽滅菌后的培養(yǎng)基傾倒于培養(yǎng)皿中。然后沿同一時(shí)針方向輕微旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿使樣品與培養(yǎng)基混合均勻，待培養(yǎng)基完全凝固后用封口膜密封，標(biāo)記后置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)于28 ℃±1 ℃正置培養(yǎng)。其中GB法［9］與YC/T法［11］需培養(yǎng)至第5天，Biokar法需培養(yǎng)至第3天。

平板涂布法（TB）：吸取各樣品的梯度稀釋液于各培養(yǎng)基表面（每個(gè)稀釋度分別吸取0.333 mL 接種量并分別加入到3 塊已提前制備好的培養(yǎng)基平板中），后用一次性無菌L 型涂布棒涂抹均勻，待培養(yǎng)基表面水分晾干后密封進(jìn)行正置培養(yǎng)，培養(yǎng)及計(jì)數(shù)方法與平板傾注法相同。具體技術(shù)路線及方法簡稱如圖1所示。

圖1 技術(shù)路線Fig.1 Technical route

1.3.3 霉菌判讀、計(jì)數(shù)及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

按照各培養(yǎng)基特點(diǎn)直接肉眼觀察（必要時(shí)使用放大鏡）判別霉菌形態(tài)。

平板傾注法（最低檢出限10 CFU/g）霉菌計(jì)數(shù)公式：

式中：Qi為每個(gè)重復(fù)的霉菌菌落總數(shù)；i為重復(fù)次數(shù)；T為稀釋倍數(shù)。

平板涂布法（最低檢出限10 CFU/g）霉菌計(jì)數(shù)公式：

式中：Ti為每個(gè)重復(fù)的霉菌菌落總數(shù)；i為重復(fù)次數(shù)；T為稀釋倍數(shù)。

按照GB 4789.15—2016［9］進(jìn)行霉菌菌落計(jì)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

使用Microsoft Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，將所檢測霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果轉(zhuǎn)化為以10為底數(shù)的對數(shù)值（未檢出樣品的對數(shù)值按0.7 統(tǒng)計(jì)），采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)，評價(jià)各方法對霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的差異顯著性。

使用 Med Calc?Version 19.0.4 軟件繪制 Bland-Altman 圖，其基本原理是計(jì)算出兩方法測量結(jié)果的一致性界限，并以圖形方式直觀反映，同時(shí)根據(jù)實(shí)際測量結(jié)果判斷兩種方法是否具有一致性［16-18］。

2 結(jié)果與討論

2.1 霉菌計(jì)數(shù)方法比較

2.1.1 3種培養(yǎng)基平板涂布法的比較

對3 種培養(yǎng)基平板涂布法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果分別進(jìn)行Bland-Altman圖比較，如圖2、圖3和圖4所示。將GB 法-TB、Biokar 法-TB 和 YC/T 法-TB 進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)除低濃度樣本中的個(gè)別數(shù)據(jù)分布在95%上下限之外，其余樣本占比分別為92.31%、92.31%和89.74%的數(shù)據(jù)點(diǎn)落在95%上下限內(nèi)，說明3 種方法間檢測結(jié)果一致性較好。當(dāng)樣品中霉菌含量低于102CFU/g 時(shí)，培養(yǎng)基對霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響較大，而當(dāng)樣品中霉菌含量高于102CFU/g時(shí)，培養(yǎng)基對霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性較好。表明3種培養(yǎng)基采用平板涂布法進(jìn)行接種，對霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的影響與樣品中霉菌含量有關(guān)。

圖2 平板涂布法接種條件下GB法和YC/T法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性比較Fig.2 Result consistency between the GB and YC/T mould counting methods when adopting spread plate inoculation method

圖3 平板涂布法接種條件下GB法和Biokar法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性比較Fig.3 Result consistency between the GB and Biokar mould counting methods when adopting spread plate inoculation method

圖4 平板涂布法接種條件下Biokar法和YC/T法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性比較Fig.4 Result consistency between the Biokar and YC/T mould counting methods when adopting spread plate inoculation method

如圖5 所示，通過對A、B、C、D、E 等5 個(gè)樣品的菌落形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，3種培養(yǎng)基采用平板涂布法接種培養(yǎng)后樣品中典型霉菌菌落形態(tài)區(qū)別較大，其中GB法與YC/T 法霉菌菌落較大，形態(tài)清晰易判讀。Biokar 法典型菌落較小，分布均勻，更有助于計(jì)數(shù)，但較難從菌落形態(tài)上區(qū)分出不同種類的霉菌，由此推測Biokar法所用SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基中生長促進(jìn)劑和選擇性系統(tǒng)既可以促進(jìn)霉菌的快速生長又能抑制霉菌菌絲的過度繁殖。綜合比較發(fā)現(xiàn)，平板涂布法接種培養(yǎng)基上霉菌菌落全部生長于培養(yǎng)基表面，GB 法與YC/T 法的典型霉菌菌落形態(tài)最易判別，而Biokar法更易快速計(jì)數(shù)。

圖5 平板涂布法接種條件下3種培養(yǎng)基中霉菌的形態(tài)比較Fig.5 Morphological comparison of mould in three media with spread plate inoculation method

2.1.2 3種培養(yǎng)基的平板傾注法比較

對3種培養(yǎng)基的平板傾注法進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6、圖 7 和圖 8 所示。從 Bland-Altman 圖中發(fā)現(xiàn)，94.87%的數(shù)據(jù)點(diǎn)均落在95%上下限內(nèi)，表明3 種培養(yǎng)基的平板傾注法結(jié)果一致性較好。檢測樣品中霉菌含量低于102CFU/g 時(shí)，3 種培養(yǎng)基在平板傾注法接種條件下與平板涂布法接種條件下表現(xiàn)出的霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果一致。說明無論采用平板傾注法還是平板涂布法接種，當(dāng)樣品中霉菌含量低于102CFU/g 時(shí)，各培養(yǎng)基所對應(yīng)的計(jì)數(shù)方法均存在一定的波動(dòng)性。

圖6 平板傾注法接種條件下GB法和YC/T法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性比較Fig.6 Result consistency between the GB and YC/T mould counting methods when adopting pour plate inoculation method

圖7 平板傾注法接種條件下GB法和Biokar法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性比較Fig.7 Result consistency between the GB and Biokar mould counting methods when adopting pour plate inoculation method

圖8 平板傾注法接種條件下Biokar法和YC/T法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性比較Fig.8 Result consistency between the Biokar and YC/T mould counting methods when adopting pour plate inoculation method

3 種培養(yǎng)基中平板傾注法對樣品中霉菌生長狀況的影響如圖9所示。平板傾注法與平板涂布法相比，霉菌菌落除生長于培養(yǎng)基表面外，還在培養(yǎng)基內(nèi)部呈現(xiàn)出不同的立體生長形態(tài)。YC/T法和GB法菌落生長形態(tài)相似，部分霉菌生長速率過快，菌落易蔓延，相互交錯(cuò)，影響計(jì)數(shù)。Biokar法霉菌生長速率較慢，更利于霉菌計(jì)數(shù)。

圖9 平板傾注法接種條件下3種培養(yǎng)基中霉菌的形態(tài)比較Fig.9 Morphological comparison of mould in three mediums with pour plate inoculation method

2.1.3 平板涂布法與平板傾注法的比較

GB 法（孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基）比較結(jié)果如圖10所示，各樣品在兩種接種方式下霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果差異均在1 個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)。通過獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)7 個(gè)樣品（A、B、D、E、G、I、J）的平板涂布法與平板傾注法之間存在顯著差異，其中3 個(gè)低、中濃度樣品（B、D、E）的平板涂布法檢測結(jié)果顯著高于平板傾注法，4個(gè)中、高濃度樣品（A、G、I、J）的平板傾注法檢測結(jié)果顯著高于平板涂布法。53.85%的樣品計(jì)數(shù)結(jié)果存在差異性，表明兩種接種方式間差異較大，對霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果有較大影響。

圖10 GB法條件下平板涂布法和平板傾注法接種方式霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的差異性比較Fig.10 Comparison of mould counting results between spread and pour plate inoculation methods when adopting the GB method

YC/T 法（改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）比較結(jié)果如圖11所示。4個(gè)樣品（B、C、D、E）中平板涂布法與平板傾注法之間存在顯著差異，且3個(gè)中、高濃度樣品（B、C、D）的平板涂布法檢測結(jié)果顯著高于平板傾注法。30.77%的樣品計(jì)數(shù)結(jié)果存在差異，且主要表現(xiàn)為平板涂布法檢測結(jié)果高于平板傾注法，表明兩種接種方式間差異較小，對霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果影響不大。

Biokar 法（SYMPHONY Agar 快速顯色培養(yǎng)基）比較結(jié)果如圖12 所示，僅有3 個(gè)樣品（B、C、L）的平板涂布法與平板傾注法之間存在顯著差異。23.08%的樣品計(jì)數(shù)結(jié)果呈現(xiàn)出差異性，且均表現(xiàn)為平板涂布法檢測結(jié)果高于平板傾注法，表明兩種接種方式間差異更小，對霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果影響較小。

圖12 Biokar法條件下平板涂布法和平板傾注法霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的差異性比較Fig.12 Comparison of mould counting results between spread and pour plate inoculation methods when adopting the Biokar method

2.2 霉菌計(jì)數(shù)方法的比較

3 種霉菌計(jì)數(shù)方法及兩種接種方式綜合比較結(jié)果如表2所示。

表2 霉菌計(jì)數(shù)方法的比較Tab.2 Comparison of mould counting methods

培養(yǎng)基的選擇：平板涂布法接種適用于GB法推薦的孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和Biokar 法推薦的SYMPHONY Agar 快速顯色培養(yǎng)基，平板傾注法接種更適用于YC/T 法所推薦的改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。無論是霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果還是霉菌生長形態(tài)，不同培養(yǎng)基的效果不同，在試驗(yàn)研究過程中可以根據(jù)試驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同的培養(yǎng)基。

前期準(zhǔn)備及操作步驟：不同計(jì)數(shù)方法和不同接種方式對于前期準(zhǔn)備和操作步驟的要求不同。但各方法間對于平板傾注法接種的前期準(zhǔn)備較為相似，均為將培養(yǎng)基在接種前進(jìn)行水浴保溫，且各水浴溫度要求差異不大，但操作步驟繁瑣。各方法間對于平板涂布法接種的前期準(zhǔn)備要求均為提前預(yù)制平板，操作步驟便捷。

培養(yǎng)時(shí)間：3種霉菌計(jì)數(shù)方法均為傳統(tǒng)微生物學(xué)檢測方法，由于霉菌生長的特殊性及樣品的差異性，各方法中對于培養(yǎng)時(shí)間的要求不盡相同。GB 法、YC/T 法和Biokar 法對培養(yǎng)時(shí)間的要求分別為5 d、2～5 d 和54 h～3 d，GB 法與其他兩種方法相比培養(yǎng)周期較長，不利于霉菌快速計(jì)數(shù)，Biokar法可以在更短的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)對樣品中霉菌的計(jì)數(shù)。

菌落形態(tài)：根據(jù)圖5和圖9中霉菌生長形態(tài)的差異性，無論是培養(yǎng)基還是接種方式的不同，均會(huì)影響霉菌菌落形態(tài)的觀察，而培養(yǎng)基對霉菌形態(tài)的影響明顯大于接種方式。但無論平板涂布法還是平板傾注法接種方式，均表現(xiàn)出GB法所用孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和YC/T 法所用改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基更有利于霉菌生長形態(tài)的觀察，而Biokar 法所用SYMPHONY Agar快速顯色培養(yǎng)基則更有利于霉菌計(jì)數(shù)。

判讀計(jì)數(shù)：影響樣品中霉菌判讀計(jì)數(shù)的因素較多，在培養(yǎng)基和接種方式明確的條件下，菌落生長速率和菌落分布均勻度對于判讀計(jì)數(shù)有重要影響。由于霉菌生長的特殊性，菌落生長速率較快不利于霉菌計(jì)數(shù)，稍不注意便會(huì)造成菌落蔓延而無法計(jì)數(shù)。3種培養(yǎng)基進(jìn)行比較，孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基菌落生長速率較快，不利于霉菌計(jì)數(shù)，而SYMPHONY Agar 快速顯色培養(yǎng)基菌落生長速率較慢，有利于霉菌計(jì)數(shù)。除霉菌生長速率外，菌落分布均勻性也影響霉菌的判讀計(jì)數(shù)，而接種方式對于菌落分布的影響更大。平板傾注法接種并培養(yǎng)后，菌落分布不均勻且菌落還可能生長在培養(yǎng)基內(nèi)部，而平板涂布法接種并培養(yǎng)后霉菌菌落在培養(yǎng)基表面分布均勻、更易于觀察與計(jì)數(shù)。

3 結(jié)論

①3種培養(yǎng)基在同種接種方式條件下，雪茄煙中霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果的一致性較好，其中Biokar 法培養(yǎng)周期短，霉菌生長緩慢，可避免菌落快速蔓延，更利于計(jì)數(shù)，GB 法和YC/T 法則更適用于對霉菌菌落的形態(tài)觀察。②相同培養(yǎng)基在不同接種方式條件下，雪茄煙中霉菌計(jì)數(shù)結(jié)果存在差異。與平板傾注法相比，平板涂布法操作簡單，霉菌菌落均勻分布于培養(yǎng)基表面，適合大批量樣品檢測。