史江穎， 畢 彩， 紀(jì)曉丹， 單樹花， 李卓玉

(山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 太原 030006)

結(jié)腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤，死亡率高，是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，近20年結(jié)腸癌發(fā)病率升高趨勢(shì)尤為明顯[1,2]。早期診斷和根治性切除可以改善患者的預(yù)后[3,4]，然而，結(jié)腸癌患者缺乏早期階段的癥狀，一旦發(fā)現(xiàn)通常已經(jīng)是結(jié)腸癌晚期，導(dǎo)致一半的結(jié)腸癌患者容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移[5]。鑒于此，早期發(fā)現(xiàn)和一級(jí)預(yù)防成為顯著降低結(jié)腸癌患者死亡率的有效舉措[6]。目前，臨床檢測(cè)結(jié)腸癌的手段主要依賴于內(nèi)窺鏡檢查和血清癌胚抗原篩查，但其臨床應(yīng)用受到靈敏度和特異度低的限制[7-9]。因此，篩選具有高靈敏度和特異性的新型分子標(biāo)記物，闡明其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，可以顯著優(yōu)化臨床治療方法為患者帶來益處。

越來越多的研究表明，腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的條件下，依然采用有氧糖酵解替代正常細(xì)胞的氧化磷酸化(oxidative phosphorylation，OXPHOS)產(chǎn)能，線粒體作為細(xì)胞的能量來源在癌細(xì)胞從氧化磷酸化到有氧糖酵解的代謝重編程中發(fā)揮著重要作用[10,11]。MicroRNAs (miRNAs/miR)是一種小型非編碼RNA，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)，在癌癥的發(fā)展過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用已被不斷證實(shí)[12]。Zhang等[13]比較了457例結(jié)腸癌組織與8例癌旁組織差異表達(dá)的miRNA發(fā)現(xiàn)，miR-149在結(jié)腸癌患者中顯著降低，暗示 miR-149 在早期大腸癌發(fā)育和進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用，可以作為潛在的結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。但是，miR-149在結(jié)腸癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能及作用機(jī)制仍需進(jìn)一步的研究探索。

因此，本研究探討了miR-149在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中的生物學(xué)功能，進(jìn)一步評(píng)估了miR-149抗結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的活性，并從線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化的角度探討miR-149抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的作用機(jī)制，為miR-149進(jìn)一步成為腫瘤標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；RPMI-1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司；無支原體胎牛血清購買于上海生工生物工程有限公司；青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液(100×三抗)、DMSO、DAPI、PMSF、MTT、胰酶、高靈敏Western印跡發(fā)光試劑、SDS-PAGE試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司；細(xì)胞裂解液和BCA試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；Drp1、Mfn2、Fis1、GAPDH、BAX、BCL-2、活化胱天蛋白酶3(activated-caspase-3)、活化胱天蛋白酶9(activated-caspase-9)蛋白抗體購買自Proteintech公司，線粒體熒光探針MitoTracker?CMXRos、轉(zhuǎn)染試劑Lipofection 3000購買自Invitrogen公司；JC-1探針試劑盒購自美國Sigma公司；蛋白質(zhì)分子量標(biāo)記物(marker)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HT-29細(xì)胞使用RPMI1640培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中含有青霉素-鏈霉素-慶大霉素混合溶液(100×三抗)與10%胎牛血清(FBS)，細(xì)胞株置于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，用0.25%胰酶消化傳代。

miRNA-149抑制劑(inhibitor)：(序列5′-GGGAGUGAAGACACGGAGCCAGA-3′)，抑制劑陰性對(duì)照(inhibitor N.C)：(序列5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)，模擬物(mimic)：(序列5′-GAGUGA AGACACGGAGCCAGAUU-3′)，模擬物陰性對(duì)照(mimic N.C)：(序列5′-UUGUCCGAACGU GUCACGUTT-3′)由Invitrogen公司合成。miR-149的陰性對(duì)照(N.C)、抑制劑、激活劑和轉(zhuǎn)染試劑需分別混勻在不含血清的培養(yǎng)基中，室溫反應(yīng)15 min，將上述配制好的混合液加入培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)6 h，換新鮮含血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染的48～72 h期間，進(jìn)行檢測(cè)及相關(guān)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活能力

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT-29細(xì)胞，以適合的細(xì)胞數(shù)量按照每孔100 μL的體積植入96孔板中過夜培養(yǎng)，待其密度達(dá)70%～80%時(shí)，向96孔板中分別轉(zhuǎn)染miR-149的陰性對(duì)照(N.C)、激活劑和抑制劑處理48 h；向每個(gè)培養(yǎng)孔中加入20 μL MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄舊培養(yǎng)基，用移液槍加入150 μL DMSO，低速震蕩，使用酶聯(lián)免疫熒光檢測(cè)儀測(cè)定各孔在570 nm處的吸光度值。

1.4 集落形成實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT-29細(xì)胞接種到24孔板中，采用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，適當(dāng)稀釋細(xì)胞濃度至3×104/孔，待細(xì)胞貼壁，分別轉(zhuǎn)染miR-149的陰性對(duì)照(N.C)、激活劑和抑制劑處理，處理48 h，在Olympus 倒置顯微鏡下觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)變化情況 (×20)。

1.5 線粒體形態(tài)觀察

將HT-29細(xì)胞接種在培養(yǎng)板中的蓋玻片上，分別用miR-149的陰性對(duì)照(N.C)、抑制劑和激活劑處理48 h；離心收集細(xì)胞，將細(xì)胞與經(jīng)過37oC水浴預(yù)熱的MitoTracker? Red CMXRos(100 nmol/L)共同孵育15 min；用PBS清洗3次，用含有3.7%福爾馬林的完全培養(yǎng)液37 ℃孵育15 min，吸出多余固定液，PBS清洗收集細(xì)胞；用預(yù)冷丙酮通透5 min，PBS清洗細(xì)胞；使用DAPI染色標(biāo)記細(xì)胞核，在37 ℃恒溫箱中避光孵育1.5 h，PBS洗去多余染液；滴加防熒光淬滅劑，甘油封閉，使用免疫熒光顯微鏡觀察細(xì)胞中線粒體的形態(tài)變化，通過Image J 軟件統(tǒng)計(jì)處理組線粒體的總數(shù)量，然后用大于對(duì)照組平均線粒體長(zhǎng)度的數(shù)量除以處理組線粒體的總數(shù)量，即為線粒體融合率。

1.6 Western免疫印跡分析

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HT-29細(xì)胞接種在小皿中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分別轉(zhuǎn)染miR-149的陰性對(duì)照(N.C)、激活劑和抑制劑處理48 h；收集細(xì)胞加入適量細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min；離心收集的上清即為細(xì)胞蛋白質(zhì)；BCA法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測(cè)定，SDS-PAGE分離各蛋白質(zhì)樣品(每孔上蛋白質(zhì)樣品量為60 μg)，使用脫脂牛奶溶液封閉PVDF膜上非特異的蛋白質(zhì)位點(diǎn)；分別接入Drp1、Fis1、Mfn2、BAX、BCL-2、活化胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶9蛋白質(zhì)的一抗，在搖床上4oC過夜孵育，使用1×TBST緩沖液漂洗膜3次，除去未特異性結(jié)合的抗體，每次8 min；接入酶聯(lián)二抗室溫孵育2 h。使用1×TBST緩沖液漂洗膜3次，每次8 min，去除未特異性結(jié)合的抗體，在膜上加入化學(xué)發(fā)光液，使用X光片壓片、顯像，觀察Drp1、Fis1、Mfn2、BAX、BCL-2、活化胱天蛋白酶3、活化胱天蛋白酶9蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的表達(dá)量的變化，并使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.7 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè)

將HT-29細(xì)胞按1×106個(gè)細(xì)胞數(shù)接種于共聚焦細(xì)胞專用培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁，加入miR-149陰性對(duì)照(N.C)、抑制劑和激活劑處理細(xì)胞48 h，離心收集細(xì)胞，按照說明書配制JC-1工作液將細(xì)胞吹散，培養(yǎng)箱中孵育15～20 min，收集細(xì)胞，用1×染色結(jié)合液清洗細(xì)胞，再用等體積的1×染色結(jié)合液吹懸細(xì)胞，進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

將HT-29細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁，采用miR-149的陰性對(duì)照(N.C)、抑制劑和激活劑處理細(xì)胞48 h；吸掉含有miR-149的陰性對(duì)照(N.C)、抑制劑和激活劑的舊培養(yǎng)基，使用預(yù)冷的PBS清洗1次(收集液體)。未含EDTA的胰酶消化細(xì)胞后，加入等體積新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞PBS 洗滌 2 次，加入 100 μL 結(jié)合緩沖液(binding buffer) 重懸細(xì)胞，加入 5 μL Annexin V-FITC和 5 μL PI 染色液(staining solution)，輕輕混勻，室溫避光孵育 10 min，加入 400 μL結(jié)合緩沖液，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

*表示差異顯著(P<0.05)；運(yùn)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，兩組獨(dú)立樣本間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 miR-149抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖

為了驗(yàn)證miR-149在結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中的生物學(xué)功能，采用miR-149的模擬物(mimic)與miR-149的抑制劑(inhibitor)分別構(gòu)建過表達(dá)和敲減miR-149的結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞模型。通過MTT檢測(cè)敲減和過表達(dá)miR-149對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示，miR-149 inhibitor能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，與miR-149 inhibitor N.C組相比，HT-29細(xì)胞的存活率上調(diào)20%±2.9%；miR-149 mimic能夠顯著抑制HT-29細(xì)胞的增殖，與miR-149 mimic N.C組相比，HT-29細(xì)胞的存活率下降到62%±4.4%(Fig.1A)。集落形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-149的抗結(jié)腸癌活性，結(jié)果顯示，與miR-149 inhibitor N.C組相比，轉(zhuǎn)染了miR-149 inhibitor后的HT-29細(xì)胞形狀與對(duì)照一致呈多角型，細(xì)胞密度顯著增加，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛。miR-149 mimic處理后HT-29細(xì)胞與miR-149 mimic N.C組相比部分細(xì)胞變?yōu)閳A形，細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞密度變稀疏(Fig.1B,C)。以上結(jié)果證明，miR-149高表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的增殖。

Fig.1 miR-149 inhibits the proliferation of HT-29 cells (A) MTT assays showed the viability of HT-29 cells after transfected with miR-149 inhibitor or miR-149 mimic for 48 hours. (B) Colony formation assays were used to detected the cell growth capacity of HT-29 cells that were transfected with miR-149 inhibitor or miR-149 mimic for 48 hours. (C) Statistical results of colony formation assays. Data were presented as means ± SD (n=3). *P< 0.05, **P < 0.01 compared with control

2.2 miR-149低表達(dá)促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體的分裂

為了確定miR-149低表達(dá)對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響，采用線粒體熒光探針標(biāo)記miR-149 inhibitor處理HT-29細(xì)胞后觀察線粒體的形態(tài)。線粒體熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，與miR-149 inhibitor N.C組相比，miR-149 inhibitor干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)紅色小點(diǎn)并未發(fā)生聚集連接成線，表明miR-149 inhibitor并未促進(jìn)線粒體的融合(Fig.2A,B)。已有研究證明，線粒體分裂動(dòng)力蛋白質(zhì)相關(guān)蛋白DRP1(dynamin-related protein1)，線粒體分裂蛋白FIS1(mitochondrial fission protein1)和線粒體融合蛋白MFN2(mitofusin2)在調(diào)節(jié)線粒體分裂和融合過程中扮演著重要角色[14-17]。因此，本文進(jìn)一步檢測(cè)了miR-149 inhibitor處理后對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞內(nèi)MFN2、DRP1、FIS1蛋白質(zhì)的表達(dá)變化。Western 印跡結(jié)果證明，miR-149 inhibitor能夠顯著降低MFN2的表達(dá)、同時(shí)促進(jìn)DRP1和FIS1的表達(dá)(Fig.2C,D)。這些結(jié)果揭示了miR-149低表達(dá)能夠通過促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中DRP1和FIS1的表達(dá)，抑制MFN2的表達(dá)從而促進(jìn)線粒體分裂。

Fig.2 Low expression of miR-149 promotes mitochondrial division in HT-29 cells HT-29 cells were seeded on coverslips in 24-well plates and treated with miR-149 inhibitor N.C or miR-149 inhibitor for 48 hours. (A) Representative images of mitochondrial morphology. HT-29 cells were infected with miR-149 inhibitor N.C or miR-149 inhibitor for 48 hours. Mitochondrial morphology was observed by confocal fluorescent microscope with Mitotracker dye. Cell nuclei were counter-stained by DAPI. (B) Statistical analysis of mitochondrial fusion rate was performed using Image J software. Data were presented as means ± SD (n=3). *P< 0.05, **P< 0.01 compared with control. (C) Western blotting assays showed the expression of DRP1, FIS1 and MFN2 in HT-29 cells transfected with miR-149 inhibitor N.C or miR-149 inhibitor. (D) Relative protein levels of DRP1, FIS1 and MFN2 were analyzed by Image J software. Data were presented as means ± SD (n=3). *P< 0.05, **P< 0.01 compared with control

2.3 miR-149高表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體融合

為了進(jìn)一步探究miR-149對(duì)線粒體融合的影響，用線粒體熒光探針標(biāo)記miR-149 mimic后觀察HT-29細(xì)胞線粒體的形態(tài)。結(jié)果顯示，相較于miR-149 mimic N.C組，miR-149 mimic處理后紅色小點(diǎn)連接呈線，融合現(xiàn)象增加(Fig.3A,B)。表明miR-149能夠誘導(dǎo)線粒體融合。為了進(jìn)一步證明miR-149高表達(dá)對(duì)線粒體分裂和融合行為的調(diào)節(jié)作用，本文采用Western印跡技術(shù)檢測(cè)了miR-149 mimic處理后HT-29細(xì)胞中線粒體分裂和融合相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。結(jié)果表明，miR-149 mimic處理組與miR-149 mimic N.C組相比MFN2的表達(dá)量明顯上調(diào)，而DRP1、FIS1的表達(dá)量明顯下調(diào)(Fig.3C,D)。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，miR-149高表達(dá)促進(jìn)HT-29細(xì)胞線粒體融合。

Fig.3 High expression of miR-149 induces mitochondrial fusion in HT-29 cells HT-29 cells were seeded on coverslips in 24-well plates and treated with miR-149 inhibitor N.C or miR-149 inhibitor for 48 hours. (A) Representative images of mitochondrial morphology. HT-29 cells were infected with miR-149 mimic NC or miR-149 mimic for 48 hours. Mitochondrial morphology was observed by confocal fluorescent microscope with Mitotracker dye. Cell nuclei were counter-stained by DAPI. (B) Statistical analysis of mitochondrial fusion rate was performed using Image J software. Data were presented as means ± SD (n=3). *P< 0.05, **P< 0.01 compared with control. (C) Western blotting assays showed the protein levels of DRP1, FIS1 and MFN2 in HT-29 cells that were transfected with miR-149 mimic NC and miR-149 mimic. (D) Relative protein levels of DRP1, FIS1 and MFN2 were analyzed by Image J software. Data were presented as means ± SD (n=3). *P < 0.05, **P < 0.01 compared with control

2.4 miR-149通過促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體融合誘導(dǎo)線粒體膜電位下降

為了確定miR-149促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體過度融合后對(duì)線粒體功能狀態(tài)的影響。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)miR-149對(duì)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體膜電位的變化，結(jié)果顯示，miR-149 inhibitor處理后與miR-149 inhibitor N.C組相比，細(xì)胞線粒體膜電位升高；而miR-149 mimic處理組與miR-149 mimic N.C組相比，細(xì)胞線粒體膜電位降低(Fig.4A-B)。表明miR-149介導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體融合誘導(dǎo)線粒體膜電位下降。據(jù)文獻(xiàn)[18]報(bào)導(dǎo)，BCL-2調(diào)控線粒體內(nèi)、外膜的完整性，能夠增加線粒體基質(zhì)內(nèi)質(zhì)子的外流，抑制線粒體膜電位的下降；BAX通過與線粒體外膜上的電壓依賴性陰離子通道(voltage-depedent anion channel, VDAC)結(jié)合，使線粒體PT孔(permeability transition pore)開放，從而誘導(dǎo)線粒體膜電位的下降。因此，本文通過檢測(cè)BAX和BCL-2蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，評(píng)價(jià)miR-149誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體融合對(duì)線粒體膜電位的影響。Western 印跡結(jié)果顯示，miR-149 inhibitor處理后與miR-149 inhibitor N.C組相比，BAX的表達(dá)水平顯著下調(diào)，BCL-2的表達(dá)水平顯著上調(diào)；而miR-149 mimic處理后與miR-149 mimic N.C組相比，BAX的表達(dá)水平顯著上調(diào)，BCL-2的表達(dá)水平顯著下調(diào)(Fig.4C)。綜上所述，miR-149通過促進(jìn)線粒體融合誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體膜電位下降。

Fig.4 miR-149 induces a decrease of mitochondrial membrane potential by promoting the fusion of mitochondria in HT-29 cells (A) HT-29 cells were transfected with miR-149 inhibitor N.C, miR-149 inhibitor, miR-149 mimic N.C or miR-149 mimic for 48 hours. The mitochondrial membrane potential level of HT-29 cells was detected by flow cytometry. (B) Statistical analysis of mitochondrial membrane potential was performed using Image J software. Data were presented as means ± SD (n=3). *P < 0.05,**P < 0.01 compared with control. (C) Western blotting for BAX and BCL-2 protein expression in HT-29 cells. HT-29 cells were transfected with miR-149 inhibitor N.C, miR-149 inhibitor, miR-149 mimic N.C or miR-149 mimic

2.5 miR-149通過促進(jìn)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞線粒體融合誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡

線粒體在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用，線粒體內(nèi)跨膜電位的降低，是細(xì)胞凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的早期事件[19]。為明確miR-149促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體融合是否誘發(fā)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞技術(shù)評(píng)價(jià)miR-149對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡作用。結(jié)果顯示，miR-149 inhibitor處理后與miR-149 inhibitor N.C組相比，細(xì)胞凋亡率未見顯著變化；miR-149 mimic處理組與miR-149 mimic N.C組相比，細(xì)胞凋亡率增加了5.64倍(Fig.5A,B)。研究表明，線粒體融合與線粒體膜電位降低，都是線粒體凋亡的指標(biāo)[14]。本文通過Western免疫印跡檢測(cè)了miR-149對(duì)HT-29細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)活化胱天蛋白酶3與活化胱天蛋白酶9與表達(dá)水平的影響。結(jié)果表明，miR-149 inhibitor處理后與miR-149 inhibitor N.C組相比，活化胱天蛋白酶3與活化胱天蛋白酶9表達(dá)水平下調(diào)；miR-149 mimic處理組與miR-149 mimic N.C組相比，活化胱天蛋白酶3與活化胱天蛋白酶9表達(dá)水平顯著上調(diào)(Fig.5C)。以上結(jié)果進(jìn)一步證明，miR-149通過促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞線粒體融合誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞的凋亡。

Fig.5 miR-149 induces colon cancer cell apoptosis by promoting mitochondrial fusion of HT-29 cells (A) HT-29 cells were transfected with miR-149 inhibitor N.C, miR-149 inhibitor, miR-149 mimic N.C or miR-149 mimic for 48 hours. The apoptosis levels of HT-29 cell were detected by flow cytometry. (B) Statistical analysis of apoptosis level for HT-29 cells was performed using Image J software. Data were presented as means ± SD (n=3). *P < 0.05, **P < 0.01 compared with control. (C) Western blotting assays showed the levels of activated-caspase-3 and activated-caspase-9 in HT-29 cells that were transfected with miR-149 inhibitor N.C, miR-149 inhibitor, miR-149 mimic N.C or miR-149 mimic

3 討論

結(jié)腸癌的高死亡率和預(yù)后差使其成為全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，已有的研究表明，由于結(jié)腸癌患者早期癥狀不明顯，導(dǎo)致診斷晚，易發(fā)生癌轉(zhuǎn)移，使得大腸癌早期患者的5年生存率從90%急劇下降至10%以下[20,21]。然而，目前結(jié)腸癌的主要篩查手段仍存在敏感性和特異性較低等缺陷。因此，迫切需要篩選新的生物標(biāo)記物作為結(jié)腸癌的診治靶點(diǎn)，闡明其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制，推動(dòng)新生物標(biāo)記物的進(jìn)一步臨床轉(zhuǎn)化。

大量研究已經(jīng)揭示了miRNAs 參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展，特別是與癌癥的發(fā)病緊密相關(guān)。相關(guān)研究表明，miR-149的上調(diào)可以靶向c-myc的3′-UTR從而抑制丙酮酸激酶同工酶2(Pyruvate kinase isozyme typeM2，PKM2)介導(dǎo)的有氧糖酵解，發(fā)揮抗結(jié)腸癌活性，miR-149 基因 rs2292832多態(tài)性位點(diǎn)具有降低消化道腫瘤患者易感性和復(fù)發(fā)率的風(fēng)險(xiǎn)[22-25]，揭示了miR-149在結(jié)腸癌中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果證明，miR-149的抑制劑能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29的增殖，而對(duì)于miR-149的激活劑則能夠顯著抑制HT-29細(xì)胞的增殖，本研究結(jié)果揭示，miR-149高表達(dá)能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，這與文獻(xiàn)調(diào)研的結(jié)果一致 。

腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞的氧化磷酸化產(chǎn)能相比無論在有氧還是無氧的條件下均采用有氧糖酵解產(chǎn)能，這種能量代謝重編程的現(xiàn)象是腫瘤細(xì)胞的基本特征之一，線粒體是重要的能量代謝加工場(chǎng)，腫瘤細(xì)胞的線粒體明顯異于正常細(xì)胞[10]，闡明線粒體結(jié)構(gòu)的變化對(duì)腫瘤細(xì)胞線粒體功能異常與腫瘤發(fā)生發(fā)展尤為重要。已有文獻(xiàn)報(bào)道[14]，線粒體通過分裂和融合不斷地影響著線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能的改變。線粒體融合則導(dǎo)致線粒體形態(tài)延長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)損傷，并且線粒體融合蛋白Mfn2升高可降低線粒體膜電位，促使細(xì)胞色素C從線粒體釋放入胞質(zhì)內(nèi)；同時(shí)可以激活胱天蛋白酶家族，下調(diào)BCL-2表達(dá)，上調(diào)BAX表達(dá)，增加BAX/BCL-2比率，觸發(fā)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)源性凋亡通路。因此，本文將探明miR-149與線粒體結(jié)構(gòu)和功能異常的關(guān)系，揭示miR-149抑制結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖的作用機(jī)制。線粒體的形態(tài)變化受到許多調(diào)節(jié)因子的影響，目前，研究較多的是DRP1、FIS1和MFN2[26]。多個(gè)DRP1在線粒體分裂位點(diǎn)上組裝成聚合體，并能通過聚合體的收縮調(diào)控線粒體分裂進(jìn)程；FIS1定位于線粒體外膜，其在線粒體分裂進(jìn)程中負(fù)責(zé)召集分布在線粒體內(nèi)的DRP1移動(dòng)到線粒體外組裝成聚合體[27]；而MFN2能誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞阻滯在G0/G1期，并且會(huì)引起線粒體過度聚集進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[28]，可見線粒體融合與細(xì)胞增殖的調(diào)控息息相關(guān)。本研究結(jié)果證實(shí)，miR-149能夠通過促進(jìn)MFN2的表達(dá)，抑制DRP1和FIS1的表達(dá)誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞中線粒體融合。線粒體是細(xì)胞凋亡的調(diào)控中心，在線粒體結(jié)構(gòu)發(fā)生異常變化時(shí)線粒體外膜通道打開，激活胱天蛋白酶介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡蛋白質(zhì)的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，miR-149高表達(dá)促進(jìn)了線粒體膜電位下降，進(jìn)而促進(jìn)了線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡。綜上，本文的研究結(jié)果證明，miR-149通過抑制線粒體分裂蛋白質(zhì)DRP1和FIS1的表達(dá)，促進(jìn)線粒體融合蛋白質(zhì)MFN2的表達(dá)誘導(dǎo)線粒體融合致使線粒體膜電位下降，進(jìn)而觸發(fā)了線粒體介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)源性凋亡，從而抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，發(fā)揮了抗結(jié)腸癌效應(yīng)。本研究進(jìn)一步豐富了miRNAs參與腫瘤治療的理論研究，為miR-149進(jìn)一步成為腫瘤標(biāo)記物或治療靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。